專利名稱：填裝有配體－二生物素結合物的可重復使用的體外柱的制作方法
技術領域：
本發明涉及調節體外裝置的方法，和用于體外從與哺乳動物狀況或疾病的診斷或治療相關的哺乳動物體液中提取毒性物質的方法，在本發明方法中包括能從哺乳動物體液中提取毒性物質的試劑，以及含有所述試劑的體外裝置。
背景技術：
通過意外事故、疾病狀態、細菌或病毒感染或為治療某些疾病(例如治療癌癥)而施用的物質，可將毒性物質引入人血液中。其中的許多毒性物質對身體組織例如腎、肝、肺和骨髓有很大損害，甚至可致命。因此，需要盡可能快地從血液中清除這樣的物質。盡管機體具有除去不想要毒性物質的天然防御機制，但這些方法在許多情況下是無效的。因此，需要采用體外裝置以最有效地清除血液中的某些毒性物質。這種裝置的示例是腎透析機，它可用來消除因腎功能低下而蓄積于血液中的毒性物質。能利用體外裝置的其他醫藥應用包括[1]清除放射性物質，[2]清除毒性水平的金屬，[3]清除細菌或病毒產生的毒素，[4]清除毒性水平的藥物，和[5]清除全細胞(例如癌細胞，特異性造血干細胞-例如B、T、或NK細胞)或清除細菌和病毒。
為了使體外裝置具有消除毒素的功能，必須使其與化學實體結合，所述化學實體對血液中待消除的毒性物質有高度親和性。化學實體并不是直接結合于體外裝置中的柱基質(column matrix)上，而是優先通過分子的另一結合對而結合。這種結合排列通常會使毒素結合部分在血液中更有效，并使裝置更適于各種毒性物質。所用的柱基質物質應能提供高表面積，并且不限制血流的通過(Nilson，R.等，EPC567514)。柱基質上含有與之結合的蛋白質(抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白)，使之對其他分子(例如生物素)有高度親和性。將對毒性物質具有高度親和性的部分與生物素雙分子結合，使得可以很容易達到附著于柱基質上，即可實現對柱的調節，使其適用于特殊醫藥用途。該調節劑含有兩個(而不是一個)生物素部分，因為這種構型可為柱基質提供高度的穩定性。
盡管腫瘤特異性免疫結合物可選擇性地與腫瘤細胞結合，但是仍需要在血液循環中保持初始高濃度的細胞毒性免疫結合物，以利于其在患者靶組織內達到足夠高的濃度。當需要對癌癥進行最佳治療時，在大多數情況下，血液和其他非腫瘤組織中的高濃度細胞毒性物質會在敏感和重要組織(例如骨髓)中形成組織損傷和/或病變。雖然有時會采用骨髓援救來防止這些潛在的致死效應，但是對于患者來說，這種移植術過于昂貴且具有高風險。即使在骨髓移植術有效的情況下，也可能對其他敏感器官(例如肝、腎、脾、肺等)造成無法挽回的損傷。用于防止血液中毒性物質損傷組織和骨髓的最有效方法，是顯著地減少血液中毒性物質的含量。當然，前提是必須在待治療組織(例如腫瘤)中保持治療水平的毒性物質。
已經對放射性標記的抗體在癌癥治療方面的應用研究了幾十年。施用放射性標記的抗體可將毒性物質引入血液。許多方法均建議，在腫瘤積蓄了足量的免疫結合物以達到診斷或治療目的后，將放射性標記抗體從血液循環中快速清除出去。一些方法包括通過形成免疫復合物來增強機體自身的清除機制。采用能與放射性標記抗體結合的分子，可提高放射性標記抗體的血液清除率，這種分子例如其他單克隆抗體(Klibanov等，J.Nucl.Med.29，1951-1956，1988Marshall等，Br.J. Cancer 69，502-507，1994Sharkey等，BioconjugateChem.8，595-604，1997)，或抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白(Sinitsyn等，J.Nucl.Med.30，6669，1989；Marshall等，Br.J.Cancer，71，18-24，1995)，或含有可被肝細胞上受體消除的化合物的糖基(Ashwell和Morell，Adv.Enzymol.41，99-128，1974)。其他方法涉及采用體外方法除去循環的免疫結合物(參見Schriber，G.J.和Kerr，D.E.在Current Medical Chemistry，1995，2卷，616-629頁的綜述)。
由于可快速地將毒性物質從體內除去，因此這種能從血液循環中清除醫藥物質的體外技術尤其具有吸引力。這些方法在免疫治療方面的應用已有描述(Henry CA，1991，18卷，565頁；Hofheinze D等，Proc.Am.Assoc.Cancer.Res.1987，28卷，391頁；Lear J K，等，Radiology1991，179卷，509-512頁；Johnson T.K.等，Antibody Immunoconj.Radiopharm.1991，4卷，509頁；Dienhart D.G.，等，AntibodyImmunocon j.Radiopharm.1991，7卷，225頁；DeNardo G.L.等，J.Nucl.Med.1993，34卷，1020-1027頁；DeNardo S.J.等，J.Nucl.Med.1992，33卷，862-863頁；DeNardo G.L.J.Nucl.Med.1992，33卷，863-864頁；和美國專利5,474,772澳大利亞專利638061，EPO；和Maddock的EP090 914303.4。
為了使血液清除更有效，并使對全血(而不是上述方法所指的血漿)的處理成為可能，醫藥物質已經生物素化并被柱基質上的抗生物素蛋白吸附劑清除，所述醫藥物質例如攜帶細胞殺傷劑的腫瘤特異性單克隆抗體或用于腫瘤定位的放射性核素。許多出版物提供的數據表明，該技術對于清除生物素化的和放射性核素標記的腫瘤特異性抗體均具有有效性和實用性(Norrgren K，等，Antibody Immunoconj.Radiopharm.1991，4卷，54頁；Norrgren K，等，J.Nucl.Med. 1993，34卷，448-454頁；Garkavij M，等，Acta OncologicAl996，53卷，309-312頁；Garkavij M，等，J.Nucl.Med.1997，38卷，895-901頁。美國專利申請08/090,047；EPC567 514和08/434,889中也描述了這些技術。
除了長時間循環可導致毒性免疫結合物不希望的暴露于健康組織這一不利之外，不充分的腫瘤組織穿透、非特異性器官中的滯留和新陳代謝均可使治療指數降低。針對這些問題，對以抗體為基礎的多步驟放射性核素傳遞方法進行了廣泛研究。基本原理首先包括注射病變特異性的靶向部分，該部分除了可特定地與病變結合之外，還可與隨后注入的放射性診斷劑或治療劑結合的特征。通過將這兩步分開，可使緩慢穿透組織性的非放射性/非細胞毒性抗體在腫瘤塊中得到充分的積蓄，同時選擇攜帶放射性核素/細胞毒素的物質用于更快速地穿透組織。然而，先決條件是前者(也優選后者)能快速從血液循環中清除。
大多數這些多步驟方法利用了抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白與生物素的結合對。抗生物素蛋白是在蛋清和鳥以及兩棲動物組織中發現的67kDA糖蛋白。它含有4個非共價結合的亞單位。每一亞單位能結合1個生物素分子。抗生物素蛋白的等電點較高(pI＞10)，這是由于其具有能與細胞膜非特異性結合的36個賴氨酸殘基。在阿維丁氏鏈霉菌(Streptomyces avidinii)中產生的鏈霉抗生物素蛋白(SAv)，是接近于抗生物素蛋白的相關物。它對生物素具有很高的親和性，但是其氨基酸含量以及凈電荷(pI 6.5)不同，并且未糖基化。由于沒有糖基，SAv的分子量略低(60kDa)，并且其體內藥動學和生物分布明顯不同于抗生物素蛋白。相對于靜脈內注射的放射性標記抗生物素蛋白可快速從血液中清除并大量積蓄于肝中，放射性標記的SAv表現出更長的循環時間和較低的器官蓄積(Pimm Mv等，Nucl.Med.Comm.1988，9卷，931-941Schechter B等，Eur.J.Biochem.1990，189卷，327-331Rosebrough SF，Nucl.Med.Biol.1993，20卷，663-668)。
結合對中的另一部分--生物素是一種維生素，并且是合成氨基酸及奇碳鏈(odd-chain)脂肪酸所必需的B族-復合物成員。通常可在胞內發現生物素，它通常與酶結合并在羧化反應期間用作輔因子。在食物中和在代謝性蛋白質轉變期間，生物素通常表現為賴氨酸-生物素加合物(生物胞素)形式。賴氨酸與生物素間的鏈接可被血漿酶、生物素酶分解。
為了改善在肺癌患者中的成像，Kalofonos等采用了兩步SAv-MAb/1llIn DTPA-生物素方法(Kalofonos HP等，J.Nucl.Med.1990，31卷，1791-1796)。Van Osdol等和Sung等開發出了用于兩步成像的數學模型，以及采用SAv-MAb和放射性標記生物素螯合物的治療方案。鑒于靶向SAv-MAb部分和放射性標記生物素成像劑的體內參數，他們作了如下推測1)大分子量的SAv-Mab可降低Mab(定位于腫瘤)的用量和在腫瘤中結合的均勻性。
2)放射性標記生物素會快速擴散到腫瘤中，但是由于它對外周腫瘤結合的SAv-Mab具有高親和性，放射性標記生物素的劑量太低則不能深度穿透至瘤結中。
3)與直接標記的MAbs相比，兩步SAv-MAb/放射性標記的生物素法可在放射性注射之后瞬間成像，并產生較高的腫瘤/血液比。
4)與使用直接標記的Mabs相比，24小時的腫瘤/血液比例高2倍。
在模擬實驗中，有高百分比的放射性與循環的SAv-MAb結合，并且在注射放射性標記生物素之前加入清除劑可提高腫瘤/血液的比例。
已在動物模型以及患者中對一種采用生物素化的MAbs和放射性標記的SAv的兩步法進行了試驗(Paganelli G.等，Eur.J.Nucl.Med.1992，19卷，322-329Khawli LA等，Abs.Immunoconj．Radiopharm.1993，6卷，13-27Kassis AI.等，J.Nucl.Med.1996，35卷，1358-1365)。在該方法中，靶向劑和成像劑均是具有較大分子量并可從血液中緩慢清除的物質。完成全部操作需歷時多天，放射性在器官中積蓄并會隨著代謝而從體內緩慢消除。然而，這些研究顯示，與直接標記MAbs相比，生物素/SAv的結合可在體內完成，形成了正像(positive image)并提高了腫瘤活性。
對由生物素化Mab、抗生物素蛋白和lllIn-DTPA-生物素組成的三步法也進行了試驗(Paganelli G等，Canc.Res.1991，51卷，5960-5966Dosio F.等，J.Nucl.Biol.Med. 1993，37卷，228-232)。在注射之間的這一程序需要1-3天以使其在腫瘤中蓄積并從血液清除。總之，所有這些研究顯示了體內利用SAv/生物素系統的免疫學方法的可行性。然而，由于其長時間循環和非特異性器官蓄積，使高分子量靶向劑的循環水平成為難題。
也對另一預靶向(pretargeting)方法進行深入的研究，該方法包括單獨注射以下三種組分[1]SAv-Mab，[2]清除劑，和[3]含有放射性金屬螯合部分DOTA的放射性標記生物素衍生物(Axworthy DB等，J.Immunother.1994，16卷，158)。注射腫瘤特異性Mab與SAv的共價結合物，并使其在腫瘤部位積蓄。在充分的腫瘤攝取之后(24-48小時)，施用一種生物素清除劑，經肝臟清除血液中的結合物。最終，注射放射性標記生物素-DOTA衍生物。該文所用的清除劑典型地為結合有半乳糖殘基的生物素化的蛋白質。半乳糖受體存在于肝細胞中，并對具有暴露的末端半乳糖殘基的大分子表現出高度親和性和專屬性。肝攝取與結合到SAv上的半乳糖殘基數量有關(Rosebrough SF，J.Nucl.Med. 1996，37卷，344-350)。
然而，所有這些原理必將陷入矛盾之中，即一方面是靶向分子初始濃度與其深入穿透腫瘤的能力間的矛盾，另一方面是在施用放射性/細胞毒性劑之前能否迅速并完全地從血液中清除靶向分子。原則上，放射性/細胞毒素劑適用于同樣的調節。足夠高的初始血液濃度，對于達到并使靶向分子飽和來說是必要的。同時，該毒性劑不應滯留在血液循環和暴露于敏感組織(例如骨髓)中。即使毒性劑從身體中清除相當迅速，象腎和泌尿道等器官所接受的積蓄毒性劑量通常也會相當于或高于在腫瘤組織的劑量。
因此，非常需要優化這些方法和其他治療方案的條件，特別是需要適用于治療實體瘤的方法。如果這些原理具有相當的通性，那將是至關重要的，這樣就會有盡可能多的參數獨立于疾病的類型和定位，并且會盡可能多地獨立于個體患者的藥動力學參數和代謝速率。
發明概述本發明的目的是與消除上述提及的體液中毒性或不想要化合物有關的問題。采用本發明用于調節體外裝置的方法，以及用于體外從與哺乳動物狀況或疾病的診斷或治療相關的哺乳動物體液中提取毒性物質的方法，即可實現這一目的。在該方法中，采用了能從體液中提取毒性物質的試劑，其通式如下 其中生物素部分為天然生物素或其衍生物，a、b和c為相同或不同的鏈接子，和其中d為三官能交聯部分，該試劑在說明書也稱作調節劑；或者在所述方法的優選實施方案中，該試劑的毒素結合部分是用于體外從哺乳動物體液中提取毒性物質的生物素或其衍生物，所述體液與哺乳動物狀況或疾病的診斷或治療相關。其他目的和優勢將通過本發明的詳述和權利要求書得以體現。
在本發明一個方面中，反應性二生物素化合物與配體結合，該配體能選擇性地結合血液中天然存在或人工引入的組分，所得結合物用來調節含有抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的醫藥用途柱基質的。在本發明另一方面中，含有柱(經二生物素結合物調節)的體外裝置，與一種儀器連接，該儀器可泵送患者體內的全血循環通過柱，并最終將其送回患者體內，以清除患者血液中與二生物素偶聯物結合的物質。因此，本發明目的還包括使體外清除毒性物質更為容易，這可通過使用含有兩個生物素部分的水溶性分子將生物素結合裝置一步轉化成毒性物質結合裝置而得以實現。
至于其中涉及三生物素化的試劑的其他方面，將在以下實施例中進行描述。
附圖簡述附

圖1表示用衍生的二生物素化合物調節(鏈霉)抗生物素蛋白基質。
附圖2表示毒性物質與經調節柱的結合。
附圖3表示柱調節劑通式結構。
附圖4為生物素-三聚體ELISA的標準曲線。
附圖5為抗生物素蛋白經生物素-三聚體/抗生物素蛋白柱后的典型耗損(depletion)曲線。
優選實施方案本發明還涉及調節方法，該方法可將生物素結合基質轉化成能與對身體有毒性的多種物質結合的基質。本發明使用特定抗生物素蛋白或SAv包被的柱，這是因為它們可為附著有生物素的毒性化合物(例如放射性標記的抗體)提供結合表面(Nilsson.R.等，EPC567514)。這些柱具有使全血通過并在合理時期內得到良好清除的特性。通過兩個步驟的操作，本發明將抗生物素蛋白/SAv柱轉化成能結合其他類型分子的柱，從而極大地擴展其應用。在第一步中，用附圖1所示的過量二生物素衍生物，調節生物素結合性的(鏈霉)抗生物素蛋白包被的柱，將其將轉化為能結合毒性物質的柱。在第二步驟中，經調節的柱可在體外裝置中用于清除血液中的毒性物質。附圖2顯示了毒性物質與經調節柱的結合。兩個步驟無需連續，經調節的柱可貯存備用。
在本發明的一個優選實施方案中，從血液中除去用于治療人疾病的毒性醫藥物質，以提高該物質對靶向/非靶向的濃度比。這種改善的靶向/非靶向比率提供了更佳的治療指數。醫藥物質的特異性組織或器官定位在其有效應用中是非常重要的因素。在采用醫藥物質的治療中，當其預期效應是殺死某些類型的細胞(例如癌癥治療)時，特異性組織定位的缺乏是尤其重要的。為了提高特異性，可采用腫瘤特異性單克隆抗體作為多種細胞毒素劑(例如但不限于放射性核素、細胞毒素)的載體(免疫結合物)，和采用前藥方案中所用的酶(Meyer等，Biocon jugate Chem.6，Houba等，Biocon jugate Chem.7，606-611，1996Blakey等，Cancer Res.56，3287-3292，1996)。
術語“試劑”(也是“調節劑”)在此是指一種化合物，它含有用于與單一生物素結合分子特異性作用的兩個官能團和用于結合毒性物質的獨立(separate)官能團。它能將生物素結合基質轉化成一種基質，后者能從體液中提取特殊的毒性物質，或者能將生物素結合基質轉化成連接生物素結合分子的基質。
術語“效應子分子”在此是指能連接到靶向分子或連接到作用于靶向分子的分子上的任何分子(靶向分子復合物)，它可以增加靶向分子/靶向分子復合物的效力，或者單獨具有所需的藥理學或診斷效力。
術語“毒性物質”在此是指任選與效應子分子、化合物簇、細胞等結合的任何化合物，使用試劑可將其從哺乳動物體液中提取出來。
術語“毒性結合部分”在此是指通過與毒性物質的特定作用而從哺乳動物體液中提取毒性物質的任何部分。在本發明的一些優選實施方案中，毒性結合部分為生物素或其衍生物。
術語“生物素化的分子”在此是指相對于免疫球蛋白可更容易地穿透哺乳動物組織的分子，例如含有放射性金屬螯合部分的放射性標記的生物素衍生物。
術語“靶向生物分子”在此是指能選擇性結合到哺乳動物某些細胞結構上的生物分子。
至于基質(M)上的親和性吸附劑，可以是各種形狀并含有許多化學成分。例如，可構成填有顆粒狀的聚合物的柱室，所述聚合物為天然或人造來源。顆粒可以是大孔性的或其表面是經嫁接(graft)處理的，后者是為了擴大其表面積。顆粒可以是球形或細粒狀的，并以多糖、陶瓷物質、玻璃、二氧化硅、塑料或它們的組合或類似物質為基礎。例如，它們的組合可以是用適宜天然來源或人造聚合物包被的固體顆粒。也可采用人工膜。它們可以是由纖維素、聚酰胺、聚砜、聚丙烯或其他類型物質制成的平板型膜，該膜應具有足夠的惰性，是生物相容和非毒性的，并且受體能直接或者對膜表面進行化學修飾后固定于其上。也可采用毛細膜，例如由纖維素、聚丙烯或適于該類型膜的其他物質組成的中空纖維膜。優選的實施方案是以瓊脂糖為基礎并適于體外施用的顆粒狀物質。
可通過各種方法將生物素-結合分子固定在基質上。所用的結合方法取決于生物素-結合分子以及載體基質的性質。對于蛋白質，可利用官能團例如羥基、氨基、羧基或巰基。糖蛋白例如抗生物素蛋白可經由其糖基殘基與該基質連接。可對固體載體進行活化，使其能與蛋白質的側鏈或主鏈結構經特異性或非特異性反應形成鍵，而將蛋白質結合到載體上。固體載體與生物素-結合分子之間的鍵也可以是非共價性的(靜電、氫鍵結合或疏水力)。非共價附著在免疫測定中是最合適的。在基質與生物素-結合分子之間也可采用間隔基。
調節劑由含有兩個生物素部分以及毒性物質結合部分的分子組成。本發明的兩個生物素部分是重要的，因為這種排列能使生物素部分與柱上的相同(鏈霉)抗生物素蛋白分子結合，其亞單位交聯并且可使柱穩定至適于血液通過的狀態。由于生物素二聚物會與相鄰生物素結合袋(分子內結合)迅速結合，而不是與相鄰分子上的生物素結合袋(分子間結合)結合，因此生物素部分不會與相鄰(鏈霉)抗生物素蛋白部分交聯[Wilbur等，Bioconjugate Chem.8，819-832，1997)。與生物素結合后，抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白會更穩定，并且交聯的亞單位也提供了附加穩定性(Biomolecular Engineering 16，67-72，1999)。
如附圖3所示，調節劑包括兩個生物素部分、毒素結合部分、三官能交聯部分和三個鏈接子分子(a-c)。兩個生物素部分包括通過生物素羧基經酰胺鍵與鏈接子分子(a、b)結合的天然生物素或生物素衍生物。生物素部分通過鏈接子分子與三官能交聯劑結合，生物素羧基碳原子間的間距為最小20至最大60(呈完全線性形式時測得)。鏈接子分子a、b和c也簡稱為鏈接子，可以是相同的或者每個鏈接子的性質不同。該鏈接子分子為直鏈或支鏈分子，并在鏈中含有水增溶性官能團(例如醚/-硫醚鍵、胺)，或者附著于包含胺、羧基或羥基官能團的鏈上的附屬物。與生物素酰胺鍵連接的鏈接子α上的原子可以是未取代的(例如CH2)或可含有甲基、羥亞甲基或羧基官能團。較大的官能團可減少與(鏈霉)抗生物素蛋白柱的結合。后一官能團可提供穩定性(抗生物素酶)，但是對于結合了柱上的(鏈霉)抗生物素蛋白的兩個生物素部分而言，由于其不會被生物素酶分解，所以不要求這種穩定性。如果毒素結合部分是另一生物素部分，則需要生物素酶穩定性。三官能交聯劑是用于結合鏈接子分子的含有三官能團的脂族或芳族化合物，它們是親核試劑或可與親核試劑反應。優選的三官能交聯劑為1，3，5-取代的芳環。最優選的是1，3，5-苯三甲酸、3，5-二氨基苯甲酸、5-氨基-1，3-二羧基苯(氨基間苯二酸)衍生物。毒素結合部分是對毒性物質具有高親和性的分子。這種結合分子的示例包括單克隆抗體(或碎片或遺傳工程對應物)，適體，肽，寡聚脫氧核苷酸(或結合碎片)，嵌入劑(例如，染劑、化療劑、天然物質)，以及可特定地與毒素或附著于毒性物質上的效應子分子結合的金屬螯合物。示例性毒性物質包括金屬離子，化療劑，游離的放射性核素，與其他化合物結合的放射性核素，攝入的毒素，細菌產生的毒素，病毒性感染產生的毒素，疾病狀態產生的毒素，病態細胞，涉及免疫應答的細胞，血型或HLA不容以及與異種抗體不相容的物質等。
生物素殘基優選是生物素或其衍生物。在大多數實施例中，生物素部分是可通過酰胺鍵與鏈接子結合的天然生物素。在一些實施例中，采用其結合不如天然生物素那樣緊密的生物素衍生物，或者能優先于天然生物素與經化學修飾或遺傳學變異的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結合的生物素衍生物，將是有利的。示例性生物素包括降生物素、高生物素、氧化生物素、亞氨基生物素、脫硫生物素、二氨基生物素、生物素亞砜和生物素砜。其他生物素變體包括對上述示例的進一步修飾。本發明試劑中兩個生物素部分可選擇性地包括上述任何生物素衍生物。
在本發明的一個優選實施方案中，毒素結合部分為生物素或生物素衍生物。抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白柱經這種試劑(三生物素試劑)的調節后，可消除與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結合的毒性物質(或者這些試劑經化學修飾、被酶促消化截短或通過遺傳突變方法改變)。優選的含有3生物素的示例調節劑如方案1所示。這種調節劑的優選醫藥應用是從患者血液中除去結合有治療放射性核素的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。在所示的實施例中(化合物1-3)，除了鏈接子基團性質和長度之外，它們的調節作用是相同的。所用的交聯劑是1，3，5一苯三甲酸，所用的鏈接子含有用于水增溶作用的醚官能團。在化合物3中，鏈接子也含有天門冬氨酸(可提供有助于水增溶的游離羧基并阻斷生物素酶的作用)。方案1含有3個用于結合放射性標記鏈霉抗生物素蛋白衍生物的生物素二聚物示例A.生物素三聚體(生物素羧基的間距為31)
B.生物素三聚體(生物素羧基的間距為41) c.生物素三聚體(生物素羧基的間距為53) 將含有親核試劑或者是親核試劑反應性二生物素化合物與毒性物質結合部分結合，可很容易地制備本發明方法涉及的其他毒性物質結合性二生物素調節劑。反應性二生物素化合物的合成示例如方案2和3所示。在這些示例中，采用經四氟苯基酯活化和N-tBoc保護的氨基間苯二酸酯(化合物4)作為三官能交聯劑。結合了生物素的4與鏈接子4，7，10-三氧雜十三烷二胺(trioxatridecanediamine)的反應，得到二生物素化合物5。用純的三氟醋酸，可很容易地將5中的N-tBoc保護基團轉化成游離胺6。苯胺基化合物6與毒性物質結合化合物反應，后一化合物含有活化的羧酸酯或將進行其他親核置換反應。6的游離胺也很容易轉化成能與親核試劑反應的官能團，所述親核試劑例如異硫氰酸酯，7；馬來酰亞胺，8，或其他試劑例如α-鹵代乙酰胺。異硫氰基-二生物素化合物7與含有胺的毒性物質結合分子反應，馬來酰亞胺基-二生物素8與含有巰基(或者胺)的毒性物質結合分子反應。采用相同方式可很容易地制備另外的反應試劑。與氧化的糖和醇反應的試劑是羥胺衍生物10。在方案2的示例中，鏈接子c或者是不出現，或者是首先與毒性物質結合分子連接。在許多情況下，希望鏈接子分子能使毒性物質結合部分更利于同血液中毒性物質作用。因此，在與毒性物質結合分子反應之前，可先使鏈接子成為分子的組成部分。其中引入鏈接子分子的示例如方案3所示(化合物11-14)。
方案2合成能與其它分子結合的二生物素試劑
方案3合成二生物素試劑(含有鏈接字部分和能與其它分子結合的 實施例以下提供的實施例，描述了制備本發明公開的各種類型化合物的方法，以及這些化合物在從全血中除去毒素的柱的調節中用作試劑的應用。這些實施例旨在說明，并不作任何限制。從所述實施例中可以預見出許多進一步的實施例。
實施例1制備可與毒素結合分子結合的二生物素化合物步驟1制各N-叔-Boc-5-氨基間苯二酸 冰/水浴溫度下，將二叔丁基碳酸氫鈉(1.27g，5.80mmol)加至5-氨基間苯二酸(1.0g，5.52mmol)、氫氧化鈉(0.49g，12.14mmol)、DMF(10mL)和水(10mL)的溶液中。反應混合物在環境溫度下攪拌16小時。在冰/水浴溫度下，溶液用53.0mL的0.5 N HCl中和，然后過濾白色沉淀，用水洗滌并真空干燥。殘渣在MeOH/H2O中結晶，得到白色固體的純化合物。收率為0.94g(61％)。mp＞300℃。1H NMR(DMSO-d6)δ1.50(s，9H)，8.08(t，J＝1.5Hz，1H)，8.31(d，J＝1.5Hz，2H)，9.80(s，1H)。HRMS計算1cd C13H16N6(M+H)+282.0977。發現282.0981。HPLCtR＝11.3分鐘。步驟2制備N-叔-Boc-5-氨基間苯二酸雙四氟苯基酯 室溫下，將2，3，5，6-四氟苯基三氟醋酸酯(0.47mL，2.71mmol)滴加至叔-Boc-5-氨基間苯二酸(0.35g，1.23mmol)、NEt3(0.52mL，3.70mmol)、DMF(4.0mL)和水(10mL)的溶液中。反應混合物在室溫下攪拌30分鐘后，加入60mL水，過濾白色沉淀，用水洗滌，真空干燥得到粗品。粗品經硅膠柱層析法(40g)純化得到無色固體，其中用10％ EtOAc/己烷洗脫。收率為0.213g(30％)。mp為159.7-161.8℃。1H NMR(CDCl3)1.55(s，9H)，6.83(s，1H)，7.08(m，1H)，8.54(d，J＝1.5Hz，2H)，8.67(t，J＝1.5Hz，1H)。HRMS分析C25Hl5F8NNaO6(M+Na)+600.0669。發現600.0674。HPLCtR＝16.1分鐘。步驟3制備N-(13-氨基-4，7，10-三氧雜十三烷基)生物素酰胺 氬氣下，將生物素(10g，40.9mmol)溶于在200mL熱(70℃)DMF中。溶液冷卻至環境溫度，加入10mL(82mmol)三乙胺，隨后添加16g(61mmol)的2，3，5，6-四氟苯基三氟醋酸酯。反應物室溫下攪拌30分鐘，并真空除去溶劑。產物在100mL醚中研磨并過濾。分離出的產物經真空干燥，得到收率為14g(83％)的無色固體生物素TFP酯，mp為185-187℃。1HNMR(DMSO-d6，()1.4-1.8(m，6H)，2.5(m，1H)，2.6-2.9(m，3H)，3.1(m，1H)，4.2(m，1H)，6.4(d，2H)，7.9(m，1H)；IR(KBr，cm-1)3250，2915，1790，1710，1520，1480，1090。分析計算C16H16F4N2O3SC，48.98；H，4.11N，7.14。發現C，48.90；H，4.14；N，6.86.
將生物素TFP酯(5g，12.8mmol)加至含有200mL無水DMF的干燥燒瓶中。向另一含有28g(128mmol)4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺8的干燥燒瓶中加入4mL三乙胺。兩個燒瓶均用冰水浴冷卻至0-5℃。將生物素TFP酯滴加至三氧雜十三烷二胺溶液中，用時1小時。反應物于室溫下攪拌30分鐘，并真空除去溶劑。所得油狀物在500mL醚中研磨并攪拌30分鐘。過濾所得固體，然后溶于甲醇醋酸乙酯(41)中，然后填入二氧化硅柱中(2.5cm×35cm)。用相同的溶劑混合物洗脫柱子。收集含有產物的級分，真空下除去溶劑。分離出的產物經真空干燥，得到無色固體9，收率為4.5g(79％)，mp為104-106℃。1H NMR(MeOH，()1.46(m，2H)，1.6-1.8(m，9H)，2.2(t，2H)，2.7(d，1H)，2.75-2.9(m，3H)，3.2-3.3(m，5H)，3.5-3.6(m，14H)，4.3(m，1H)，4.5(m，1H)IR(KBr，cm-l)3280，2910，2850，1690，1640，1110，940。分析計算C20H38N4O5S-H2OC，51.70；H，8.68；N，12.06。發現C，51.95；H，7.98；N，11.65.步驟41-N-叔-Boc-3，5-二(13-(生物素胺基)-4’，7’，10’-三氧雜十三烷胺基)-氨基間苯二酸酯 室溫下，將無水DMF中的生物素-三氧雜二胺4(100mg，0.22mmol)滴加至無水DMF的3(65mg，0.11mmol)和三乙胺(47L，0.33mmol)溶液中。反應混合物于室溫下攪拌2小時，然后真空下將溶液蒸發干燥。殘渣用經20％MeOH/EtOAc洗脫的硅膠柱(40g)純化，得到收率為73mg(58％)的無色固體，mp為209-211℃。1H NMR(CD3OD，200MHz)δ1.43(t，3H)，1.54(s，9H)，1.69(m，6H)，1.88(m，3H)，2.19(m，4H)，2.69(d，4H)，2.92(m，2H)，4.30(m，2H)，4.48(m，2H)，7.83(m，1H)，8.00(m，2H)；質量計算C53H88N9O14S2(M+H))+1139。發現1139。質量計算C53H87N9O14S2Na(M+Na)+1161。發現1161。HPLC 11.8分鐘。步驟51-異硫氰基-3，5-二(13’-(生物素胺基)-4’，7’，10’-三氧雜十三烷基)-氨基間苯二酸酯
120mg的22(0.11mmol)溶于純TFA(1mL)中，并于室溫下攪拌10分鐘。然后，真空除去過量的TFA。將殘渣溶于2mL甲醇中，并用0.2mL三乙胺處理。真空下除去揮發性物質，然后分別地加入水(3mL)、氯仿(3mL)和二氯硫化碳(42μL，0.55mmol)。混合物于室溫下攪拌1小時。然后，氬氣流下，在通風櫥中蒸發掉過量的二氯硫化碳和氯仿。剩余的水相真空下蒸發至干，得到77mg(68％)發粘的淡黃色固體23。1H NMR(DMSO-d6，200MHz)δ1.24-1.35(m，6H)，1.43-1.67(m，14H)，1.77(t，J＝6.6Hz，6H)，2.05(t，J＝7.1Hz，6H)，2.58(d，J＝12.5Hz，2H)，2.82(dd，J＝4.8，12.5Hz，2H)，3.07(m，8H)，3.28-3.57(m，18H)，4.13(dd，J＝4.6，7.7Hz，2H)，4.31(dd，J＝4.6，7.7Hz，2H)，7.80(t，J＝5.0Hz，2H)，7.98(s，2H)，8.34(s，1H)，8.77(t，J＝5.1Hz，2H)。質量計算C49H78N9O12S3Na(M+Na)+1103。發現1103。HPLC 11.8分鐘。
實施例2二生物素化合物與毒素結合分子的結合將4μL DMSO中的108mg(15當量)的二生物素異硫氰酸酯化合物23加至150μL單克隆抗體53-6A2(1mg)的溶液中(6.7mg/mL)。混合物輕微渦流振蕩，然后室溫下反應過夜。采用Centricon 30，以6000rpm超速離心過濾過量的二生物素試劑，然后用0.9％鹽水4×1mL洗滌，純化結合抗體的二生物素。
實施例3用二生物素-毒素結合物調節抗生物素蛋白柱該實施例涉及含有另一生物素部分的二生物素化合物。其中兩個生物素部分將與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結合，余下的第三個生物素部分可用來結合毒性化合物，該毒性化合物也可與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結合，或者是含有融合蛋白的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。因此，該實施例中的二生物素化合物為生物素三聚體，但是也可采用含有其他高親和性結合配體的二生物素化合物以相同方法調節柱。生物素結合柱經調節轉化成抗生物素蛋白-結合柱將2mL的Mitra抗生物素蛋白-瓊脂糖填入柱室中，并用多于10mL的PBS洗滌，流速為1mL/分鐘(1.6cm/分鐘)。將在PBS中的5mL生物素-三聚體1mg/mL溶液循環通過抗生物素蛋白-柱20分鐘，速度為1mL/分鐘。再循環結束時，從再循環溶液中取出樣品(0.5mL)，并用Mitra Medical Technology AB公司開發的ELISA技術進行分析。用磷酸鹽緩沖劑洗滌生物素-抗生物素蛋白-瓊脂糖-柱20分鐘，流速為1mL/分鐘。通過測定再循環液中生物素-三聚體的濃度，可以估計吸附的生物素-三聚體量約為1.9mg，即再循環結束時的濃度為0.95mg/mL凝膠。用于測定生物素-三聚體濃度的標準曲線如附圖4所示。
將生物素-三聚體吸附到2mL的Mitra抗生物素蛋白瓊脂糖上。所用的抗生物素蛋白-瓊脂糖對生物素的靜態結合能力約為74g/mL。如果每一有效的結合位置上結合了一個生物素-三聚體，則相當于514g生物素-三聚體/毫升。當每毫升抗生物素蛋白-瓊脂糖結合了約0.95mg生物素-三聚體時，可以設想吸附劑已被生物素-三聚體飽和。評估抗生物素蛋白在經調節柱中的吸附用磷酸緩沖劑填裝(prime)經生物素三聚體(即附圖4，化合物#2)調節的抗生物素蛋白-瓊脂糖柱。然后，將20mL抗生物素蛋白溶液(1mg抗生物素蛋白/mL，在PBS中)再循環通過生物素-抗生物素蛋白-瓊脂糖-柱，流速為1.0mL/分鐘(1.6cm/分鐘)。在再循環開始之前，先用三體積的抗生物素蛋白溶液(3×20mL)進行，然后從容器中取出等分試樣，2分鐘之后以5分鐘的間隔取樣。用Mitra Medical TechnologyAB公司開發的ELISA技術分析等分試樣，以測定其中的抗生物素蛋白含量。再循環容器中抗生物素蛋白的濃度如附圖5所示。虛線表示理論上的期望值(即未出現飽和效應)。約40分鐘之后，柱被飽和(2體積)，此時約結合了16mg(80％)的抗生物素蛋白。在約20分鐘(1.0體積)之后，可觀察到飽和跡象，此時實驗曲線開始偏斜理論曲線(約有10mg抗生物素蛋白結合到柱上)。
再循環40分鐘之后，約有16mg抗生物素蛋白被結合，即8mg/mL生物素-抗生物素蛋白-瓊脂糖。這相當于結合到瓊脂糖上的抗生物素蛋白與生物素三聚體上吸附的抗生物素蛋白間的摩爾比為1∶1。約在一個再循環體積之后即可觀察到初始飽和效應。在2個體積之后，不再有抗生物素蛋白被結合。
實驗顯示，抗生物素蛋白-瓊脂糖能被生物素-三聚體飽和，生物素-三聚體能與適合單體生物素結合的所有部位結合，再循環的游離抗生物素蛋白可有效地與生物素-抗生物素蛋白-瓊脂糖填充的柱結合。每毫升吸附劑約結合8mg抗生物素蛋白，這相當于結合的抗生物素蛋白與在瓊脂糖顆粒上固定的抗生物素蛋白間的摩爾比為1∶1。
實施例4使用經調節的柱從血液中清除毒素使血液通過抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白包被的裝置，以促進從血液循環中消除特定毒素，其中該裝置在使用前通過流經包含攜帶有特定毒素結合部分的柱調節劑溶液，而轉化成特殊的裝置。這使抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白包被的裝置成為用來消除各種毒素的技術平臺。在特殊情況下，需要在同一處理過程中清除一種以上的毒素，通過使攜帶有不同專屬性毒素結合部分的柱調節劑混合物流經裝置，即可很容易地實現這一需求。這種多功能裝置的適宜應用，是在器官或細胞移植之前用于從血液清除抗HLA抗體、抗血型抗體或抗異種抗體。采用攜帶可直接作用于特定亞型(例如抗HLA抗體)的不同專屬性毒素結合部分的適宜柱調節劑混合物，可在處理前調節毒素清除裝置，而使其適用于不同的患者。
在醫院中，可如下進行調節將包含適宜調節劑的輸液袋與體外處理用的監控設備(可重編程的透析機)連接，其中調節劑攜帶可直接作用于特定亞型的不同專屬性毒素結合部分，可通過監控裝置手工或自動完成對抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白裝置的調節。在這種情況下，柱調節劑溶液進入裝置的流速決定了不同專屬性毒素結合部分在最終經調節裝置中的比例。
另外，也可采用特殊毒素結合部分的某些混合物，預先配制包含攜帶了不同專屬性毒素結合部分的柱調節劑混合物的輸液袋或者最終裝置。
實施例5應用調節柱改善免疫靶向作用(兩步法)為了在兩步法中提高免疫靶向，在第一步中，使血液通過生物素結合裝置，提供有效清除血液循環中生物素化的靶向分子的方法；在第二步中，使血液流經生物素結合裝置，而從血液中清除接著施用的抗生物素蛋白/-鏈霉抗生物素蛋白毒性衍生物，所述裝置由包含本發明試劑(例如生物素二聚物或三聚體)的溶液流經生物素結合裝置而制得。
也可如下改變該方法的操作順序。
為了在兩步法中提高免疫靶向，在第一步中，使血液通過抗生物素蛋白/-鏈霉抗生物素蛋白結合裝置(由含有生物素二聚物或三聚體的溶液流經生物素結合裝置而制得)，提供有效清除血液循環中SA/抗生物素蛋白結合的靶向分子的方法；在第二步中，通過使血液流經生物素結合裝置，而從血液中清除含有本發明方法試劑的分子(例如，生物素和放射性核素/細胞毒性部分)。
在提高免疫靶向的兩步法中，也可在第一步中提供監控腫瘤攝取生物素化的靶向分子的方法，所述靶向分子采用可由γ照相、PET-掃描、MRI或其他體內診斷技術檢測出的試劑標記，并在適當時間后，使血液流經生物素-結合裝置以清除血液中非靶向結合的靶向分子，和在適當的時間施用攜帶細胞殺傷放射性核素/細胞毒素劑的抗生物素蛋白/SA，然后使血液流經抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白結合裝置(由包含本發明例如二聚物或三聚體試劑的溶液流經生物素結合裝置而制得)，從而清除了血液循環中的細胞殺傷放射性核素/細胞毒素劑。
實施例6應用調節柱改善免疫靶向(三步法)為了提高三步法中免疫靶向作用，在第一步中，使血液流經生物素結合裝置，提供有效清除血液循環中生物素化的靶向分子的方法；和在第二步中，使血液流經抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白結合裝置，清除血液中施用的抗生物素蛋白/SA，所述裝置由含有本發明試劑(例如生物素二聚物或三聚體)的溶液流經生物素結合裝置而制得；和在第三步中，使血液流經生物素-結合裝置，以清除血液中含有生物素和放射性核素/細胞毒性部分的分子。
權利要求
1.用于調節體外裝置的方法，所述裝置用于從與哺乳動物狀況或疾病的診斷或治療相關的哺乳動物體液中提取毒性物質，其中包括將含有試劑的溶液流經具有生物素結合能力的裝置，其中所述試劑結合到該裝置中，由此將所述裝置從生物素結合裝置轉化成毒性物質結合裝置，所述試劑的通式如下 其中生物素部分為天然生物素或其衍生物，其中a、b和c為相同或不同的鏈接子，和其中d為三官能交聯部分。
2.如權利要求1的方法，其中含有親核性或能與親核試劑反應的三官能團的三官能交聯劑是脂族或芳族化合物，優選為1，3，5-取代的芳族化合物，最優選為1，3，5-苯三甲酸、3，5-二氨基苯甲酸或5-氨基-1，3-二羧基苯的衍生物。
3.如權利要求1的方法，其中毒素結合部分是對含有或不含效應子分子的毒性物質具有高親和性的分子，其選自包括碎片或遺傳工程對應物的單克隆抗體，適體，肽，包括結合碎片的寡聚脫氧核苷酸，包括染劑、化療劑、天然物質的嵌入劑，以及能特定地與含有或不含效應子分子的毒性物質或者與附著于毒性物質上的效應子分子結合的金屬螯合物。
4.如權利要求1的方法，其中一個或更多鏈接子a、b和c是直鏈或支鏈的，并含有水增溶性官能團或含胺、羧基或羥基官能團的側基，優選為α羧基或N-甲基，以提高生物素部分或其衍生物與間隔基之間的生物素酰胺鍵對酶促分解的穩定性。
5.如權利要求1的方法，其中生物素衍生物選自降生物素、高生物素、氧化生物素、亞氨基生物素、脫硫生物素、二氨基生物素、生物素亞砜，生物素砜，或能與抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和其衍生物結合的其他生物素分子。
6.如權利要求4的方法，其中呈完全線性形式時測得，鏈接子a和b提供的三官能交聯部分與每一生物素部分的羧基碳原子間的間距為最小20至最大60。
7.如權利要求3的方法，其中毒素結合部分具有以高親和性結合毒性物質的能力，所述毒性物質包括金屬離子，化療劑，游離的放射性核素，結合了其他化合物的放射性核素，攝入的毒素，細菌產生的毒素，優選內毒素或腸毒素，病毒感染產生的毒素，疾病狀態產生的毒素，病態細胞，涉及免疫應答中的細胞，抗血型抗體，抗HLA抗體，抗異種抗體，或者因疾病、失調或與治療不相容產生的以不希望的水平存在于體液中的任何其他不需要的內源性組分，優選TNF和細胞激肽類，或者與疾病、失調或醫藥不相容有關的任何外源組分，優選生物素結合分子。
8.如權利要求7的方法，所述生物素結合分子可任選與效應子分子結合，所述生物素結合分子選自抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白或其衍生物或碎片，該碎片基本上具有與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白相同的結合生物素的功能。
9.如權利要求3的方法，其中效應子分子為放射性核素、細胞毒素劑、用于結合放射性核素的螫合劑、化療劑、天然毒素或其衍生物、或合成毒素。
10.如前述任一權利要求的方法，其中毒素結合部分為生物素，間隔基a、b和c為4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺，和三官能交聯部分為5-氨基-1，3-二羧基苯。
11.如權利要求1-9之一的方法，其中為
12.用于體外從與哺乳動物狀況或疾病的診斷或治療相關的哺乳動物體液中提取毒性物質的方法，其中直接或通過其他在前施用的分子已加到哺乳動物血液循環中，并在其中保持一定時間，使其富集于靶組織或細胞中的任選包括效應子分子的毒性物質，其未富集于所述靶組織或細胞中的毒性物質通過使哺乳動物血液或血漿流經含有權利要求1-11之一定義試劑的體外裝置，完全或部分地從血液循環中清除。
13.如權利要求12的方法，其中試劑的毒素結合部分為生物素或其衍生物，其中a)將生物素化的靶向生物分子加到哺乳動物的血液循環中，其中未富集于所述靶組織或細胞中的生物素標記的靶向生物分子經體外生物素結合裝置從血液循環中清除掉，b)在步驟a)之后，向血液循環中施用生物素結合分子，各自結合一個效應子分子，其中未富集于所述靶組織或細胞中的生物素結合分子流經體外裝置從血液循環中清除掉，所述裝置含有用于特異性吸附生物素結合分子及其結合的效應子分子的試劑。
14.如權利要求13的方法，其中a)生物素化的靶向生物分子各自與效應子分子結合，將其施用于血液循環中，以便于經γ照相、PET-掃描、MR工或其他體內診斷技術檢測效應子分子來監控腫瘤攝取，和其中步驟b)中的效應子分子為細胞殺傷性放射性核素或細胞毒素劑。
15.如權利要求13的方法，其中步驟b)中的生物素-結合分子不與效應子分子結合，和步驟c)中將效應子分子和生物素或試劑的結合物加到哺乳動物血液循環中，和任選地通過流經體外生物素-結合裝置清除血液中未富集于靶組織或細胞的上述結合物。
16.如權利要求12的方法，其中試劑的毒素結合部分為生物素或其衍生物，其中a)將附著于靶向分子的生物素結合分子加至哺乳動物血液循環中，其中未富集于靶組織或細胞的生物素結合分子經體外裝置從血液循環中清除掉，所述裝置含有用于特異性吸附生物素結合分子的所述試劑，和任選地，b)在步驟a)后，將用生物素或試劑生物素化的各自與效應子分子結合的分子施用于血液循環中，其中未富集于靶組織或細胞的生物素化的分子經體外生物素-結合裝置從血液循環中清除掉。
17.如權利要求13-16之一的方法，其中生物素化的靶向生物分子是含有天然生物素或其衍生物的靶向分子，其中生物素結合分子是含有抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白或其衍生物的分子，生物素化的分子是含有放射性金屬螯合部分的放射性標記的生物素衍生物，和效應子分子是放射性核素或細胞毒素劑。
18.如權利要求12的方法，優選在器官或細胞移植之前，用于從血液中同時清除多抗HLA抗體、多抗血型抗體或多抗異種抗體，其中包括含有所述試劑或具有不同特異性毒素結合部分的幾種試劑的體外裝置。
19.用于從與哺乳動物狀況或疾病診斷或治療有關的哺乳動物體液中提取毒性物質的體外裝置，其中包括能與如權利要求1-11任一定義試劑結合的生物素結合分子。
20.如權利要求19的體外裝置，其中裝置為柱，生物素結合分子是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，和試劑為三生物素化的試劑。
全文摘要
描述了調節體外裝置的方法，和用于體外從與哺乳動物狀況或疾病的診斷或治療相關的哺乳動物體液中提取毒性物質的方法，在本發明方法中包括能從哺乳動物體液中提取毒性物質的試劑，以及含有所述試劑的體外裝置。
文檔編號A61K47/48GK1457260SQ0181245
公開日2003年11月19日 申請日期2001年6月18日 優先權日2000年6月16日
發明者B·桑德伯格, S·威爾伯, R·尼爾森 申請人:華盛頓大學腫瘤放射部, 米特拉醫療技術股份公司