專利名稱：Dfmo的d－對映體及其使用方法
背景技術：
本專利申請要求共同未決的美國臨時專利申請序列號60/187.441(2000年3月7日申請)和共同未決的美國臨時專利申請序列號60/215.866(2000年7月1日申請)的優先權。
1.發明領域本發明涉及癌癥和生物學領域。更具體地講，本發明涉及在癌癥的治療中使用二氟甲基鳥氨酸的D-對映體的方法。
2.相關技術描述二氟甲基鳥氨酸(DFMO)是一種鳥氨酸脫羧酶(ODC)的不可逆抑制劑，該酶是哺乳動物多元胺生物合成的關鍵酶(Pasic等，1997)。據報道，DFMO的兩種對映體在抑制ODC的能力上有所不同，L型比D對映體更有效(Danzin等，1987)。雖然多元胺的生理學作用還不完全清楚，但已證實它們的細胞內濃度是受到高度控制的，并且正常的細胞生長、復制、分化、分泌和修復功能均需要多元胺(Pegg和McCann.，1982；Oka等，1981；Pegg，1986；Bachrach，1973；Williams-Ashman和Canellakis，1979；Thet等，1984；Luc和Baylin，1984)。已發現在許多腫瘤細胞中含有高濃度的多元胺(Pasic等，1997)，它供養細胞的持續生長，而這是癌癥發展的多步驟過程所必需的。在結腸癌發生的動物模型中，用DFMO抑制ODC可以減少結腸腺瘤和結腸癌的數量和大小(Meyskens和Germer，1995)。在膀胱的過渡期細胞癌中也發現了ODC水平的升高并且報道了用DFMO來治療膀胱癌的患者(Messing等，1995)。
用DFMO治療的一個不利的副作用是聽覺功能的破壞。在耳蝸發現了多元胺，但它們的在聽覺中的作用卻不清楚(Schweitzer等，1986)。多元胺在耳蝸中的一個可能的作用是允許與疏水性的環境相互作用(例如在膜中所發生的那些)并且可以調節無機陽離子的流出(Canellakis等，1979)。耳蝸功能密切依賴于內淋巴獨特的電解質濃度和正極化。因此，多元胺濃度的變化可以改變構成內耳蝸電位基礎的電解質的動力學，從而影響耳蝸的功能(Schweitzer等，1986)。
已知有兩種類型的耳毒性，眩暈綜合征和聽力損失(Meyskens和Gerner，1995)。隨著D，L-DFMO每日劑量的增加(0.5g/m2/天至3g/m2/天)，閾值改變的大小和發生率增加，而開始發生閾值改變的時間縮短(Pasic等，1997)。具有正常基線聽力圖的患者(閾值小于30dB)比那些具有異常基線聽力圖的患者(閾值大于或等于30dB)以更高的頻率顯示更嚴重的聽力損失(Crogham等，1991)。這兩種副作用在停止給藥后均是可逆的(Mevskens和Gerner，1995)，閾值的恢復顯示出與閾值改變的大小或D，L-DFMO的給藥劑量無關(Pasic等，1997)。
開發具有較少耳毒性的化療劑由于缺乏在動物模型中的劑量數據以及對DFMO耳毒性敏感的物種的不確定性而變得復雜。DFMO最常用的給藥途徑是服用摻有藥物的引用水。但是，對水的攝取量(即藥物劑量)沒有進行過精確的定量。體重降低是這樣服用DFMO的一個嚴重后果(Meyskens等，1995)，還不清楚體重的降低究竟是由于個體限制其攝取的含有藥物的水的量(可能是由于味道等因素)引起的還是由于藥物本身的毒性作用所引起的。
DFMO研究的模型產生了相互矛盾的數據。在豚鼠中，D，L-DFMO可以抑制耳蝸組織中的ODC活性并引起耳蝸多元胺的明顯缺乏(Marks等，1991)。此外，腦干聽力測定顯示用摻有1％D，L-DFMO的水治療可以產生伴有鉤(hook)和第一轉彎的損傷的聽力損失，在所有的排均有毛細胞損失。內側毛細胞的損失比例大于外側的毛細胞(OHC)(Salzer等，1990)。當使用大鼠作為模型時，耳蝸多元胺并沒有減少到被認為對于破壞其它系統中多元胺依賴性的過程是很重要的水平。通過腦干激發電位評估的聽覺閾值在D，L-DEMO治療的大鼠中保持不變(Schweitzer等，1986)，雖然僅研究了有限的劑量范圍。
目前仍需要顯示較低毒性和/或其它副作用的治療組合物和使用這些組合物治療癌癥的方法。
發明概述本發明涉及在患者中預防和/或治療癌癥的方法，該方法包括向患者施用有效量的明顯富集的二氟甲基鳥氨酸的D對映體(D-DFMO)或其類似物。D-DFMO或其類似物以約0.05至約20.0gm/m2/天的劑量給藥。在優選的實施方案中，D-DFMO以大約0.1至約2.0gm/m2/天的劑量給藥。在治療和/或預防癌癥時，可將DFMO或其類似物給藥一次以上。
癌癥可以是膀胱癌、結腸癌、乳腺癌、胰腺癌、腦癌、肺癌、胃癌、血癌、皮膚癌、睪丸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、食管癌以及它們的各種組合。在優選的實施方案中，癌癥是結腸癌，并且可以包括家族性腺瘤性息肉病病。在另一個優選的實施方案中，癌癥是膀胱癌，并且可以包括表淺性膀胱癌。通過施用D-DFMO或其類似物在患者中預防和/或治療癌癥可以包括實體瘤的切除術。D-DFMO或其類似物可以切除術前或切除術后給藥。
通過施用D-DFMO或其類似物在患者中預防和/或治療癌癥可以通過選自下列的機制來完成誘導細胞凋亡、抑制細胞分化、抑制轉移的可能性、減少腫瘤負荷、增加對化療或放療的敏感性、殺死癌細胞、抑制癌細胞的生長、誘導腫瘤消退及其各種組合。
D-DFMO或其類似物的給藥通過選自下列的途徑來進行口服、靜脈內、肌肉內、腫瘤內、腹膜內、真皮內、真皮、鼻、直腸、陰道、局部、頰部和淋巴內給藥。在優選的實施方案中，將DFMO直接向腫瘤給藥。還可將D-DFMO或其類似物向腫瘤的區域性脈管系統內進行系統給藥或者向所述腫瘤的區域淋巴系統內給藥。在更優選的實施方案中，將D-DFMO口服給藥。
明顯富集是指D對映體占所施用的二氟甲基鳥氨酸劑量的至少60％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥氨酸劑量的至少70％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥氨酸劑量的至少80％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥氨酸劑量的至少90％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥氨酸劑量的至少95％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥氨酸劑量的至少97.5％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥氨酸劑量的至少99％(重量)。優選的實施方案中，D對映體占所施用的二氟甲基鳥氨酸劑量的至少99.5％(重量)。
本發明還涉及藥物組合物，該組合物含有明顯富集的二氟甲基尿氨酸的D對映體(D-DFMO)或其類似物和可藥用載體。D-DFMO藥物組合物可以配制成用于向患者給藥單位劑量。藥物制劑的形式選自快速釋放、定時釋放、延遲釋放、持續釋放、口服混懸液、片劑、膠囊、散劑、錠劑、栓劑、脂質體、納米顆粒、吸入劑、鼻用溶液、眼用溶液、耳用溶液、沖洗液、靜脈內混合物、表皮或經皮溶液、口含片、糖漿、霜劑、軟膏、洗劑、凝膠、乳劑、酏劑、灌洗液、灌腸劑、含漱劑、植入劑和氣霧劑。
在優選的實施方案中，本發明的藥物組合物含有占組合物中的總DFMO或類似物至少60％(重量)的D-DFMO或其類似物或占組合物中的總DFMO至少70％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少80％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少90％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少95％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少97.5％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少99％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少99.5％(重量)的D-DFMO。
附圖概述以下附圖構成了本說明書的一部分，包含這些附圖是為了進一步說明本發明的某些方面。通過參照其中的一個或多個附圖并結合對于具體實施方案的詳細描述可以更好地理解本發明。


圖1通過管飼法用D，L-DFMO治療54天大鼠的體重增加。選擇四種情況來表示數據。 對照(n＝3)，■200mg/kg D，L-DFMO(n＝3)，400mg/kg D，L-DFMO(n＝3)；▲600mg/kg D，L-DFMO(n＝3)，◆800mg/kg D，L-DFMO和●1.2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標準誤差(SE)。
圖2A、圖2B、圖2C、圖2D和圖2E管飼D，L-DFMO54天所引起的大鼠CAP閾值升高。動物與圖1中相同。圖2A. 對照(n＝3)，■200mg/kg D，L-DFMO(n＝3)，圖2B. 對照(n＝3)，400mg/kgD，L-DFMO(n＝3)；圖2C. 對照(n＝3)，▲600mg/kg D，L-DFMO(n＝3)；圖2D. 對照(n＝3)，◆800mg/kg D，L-DFMO；圖2E. 對照(n＝3)，●1.2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標準誤差(SE)。
圖3A、圖3B、圖3C、圖3D和圖3E管飼D，L-DFMO54天所引起的大鼠1μV RMS CM等幅曲線的升高。動物與圖1中相同。圖3A. 對照(n＝3)，■200mg/kg D，L-DFMO(n＝3)，圖3B. 對照(n＝3)，400mg/kg D，L-DFMO(n＝3)；圖3C. 對照(n＝3)，▲600mg/kgD，L-DFMO(n＝3)；圖3D. 對照(n＝3)，◆800mg/kg D，L-DFMO；圖3E. 對照(n＝3)，●1.2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標準誤差(SE)。
圖4通過每天腹膜內注射用D，L-DFMO治療45天豚鼠的體重增加。由于毒性，2g/kg的D，L-DFMO提前結束。數據僅代表進行了聽力測定的動物。 對照(n＝3)，■500mg/kg D，L-DFMO(n＝5)，●1g/kgD，L-DFMO(n＝3)，▲2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標準誤差(SE)。
圖5A、圖5B和圖5C通過每天腹膜內注射用D，L-DFMO治療所引起的豚鼠CAP閾值升高。動物與圖4中相同。圖5A. 對照(n＝3)，■500mg/kg D，L-DFMO(n＝5)；圖5B. 對照(n＝3)，●1g/kgD，L-DFMO(n＝3)；圖5C. 對照(n＝3)，▲2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標準誤差(SE)。
圖6A、圖6B和圖6C通過每天腹膜內注射用D，L-DFMO治療所引起的豚鼠1μV RMS CM等幅曲線的升高。動物與圖4中相同。圖6A. 對照(n＝3)，■500mg/kg D，L-DFMO(n＝5)；圖6B. 對照(n＝3)，●1g/kg D，L-DFMO(n＝3)；圖6C. 對照(n＝3)，▲2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標準誤差(SE)。
圖7A、圖7B、圖7C、圖7D、圖7E和圖7F在一個用D，L-DFMO治療(1g/kg/天，治療45天)的動物中的毛細胞損失和聽力損失。定位是距離基底膜頂端的百分比。所有光學顯微照片的放大率均相同。圖7A.26％；圖7B.63％；圖7C.74％；圖7D.90％；圖7E.1g/kg/天D，L-DFMO(■)和平均對照(n＝5， )的CAP閾值；圖7F.1g/kg/天D，L-DFMO(●)和平均對照(n＝5，○)的1μV RMS CM等幅曲線。
圖8通過每天腹膜內注射用1g/kg D，L-DFMO、D-DFMO或L-DFMO治療45天豚鼠的體重增加。所有動物均存活至聽力測試。 對照(n＝5)，■1g/kg D，L-DFMO(n＝5)，●1g/kg D-DFMO(n＝5)，▲1g/kg L-DFMO(n＝5)。垂直的條是標準誤差(SE)。
圖9通過每天腹膜內注射用1g/kg D，L-DFMO、D-DFMO或L-DFMO治療所引起的豚鼠CAP閾值升高。動物與圖8中相同。(A) 對照(n＝5)，■1g/kg D，L-DFMO(n＝5)；(B) 對照(n＝5)，●1g/kgD-DFMO(n＝5)；(C) 對照(n＝5)，▲1g/kg L-DFMO(n＝5)。垂直的條是標準誤差(SE)。
圖1OA、圖10B和圖10C通過每天腹膜內注射用1g/kg D，L-DFMO、D-DFMO或L-DFMO治療所引起的豚鼠1μV RMS CM等幅曲線的升高。動物與圖8中相同。圖10A. 對照(n＝5)，■1g/kg D，L-DFMO(n＝5)；圖10B. 對照(n＝5)，●1g/kg D-DFMO(n＝5)；圖10C. 對照(n＝5)，▲1g/kg L-DFMO(n＝5)。垂直的條是標準誤差(SE)。
圖11在裸鼠中的MCF-7人乳腺腫瘤的平均腫瘤重量。將D-、L-或D，L-DFMO在動物的飲用水中以如下濃度隨意(ad libidum)給藥0.0％對照(●)0.5％D-DFMO(○)0.5％L-DFMO()0.5％D，L-DFMO()；3.0％D，L-DFMO(■)。
圖12比較D-和L-DFMO異構體的相對抑制活性的劑量響應研究。將給定劑量的DFMO通過管飼法向一組雌性小鼠口服給藥一次。在用DFMO處理1小時后，涂抹TPA(5nmol)在0.2ml丙酮中的溶液剃除小鼠背部的毛。每個治療組有3只小鼠。涂抹TPA5小時后，測定可溶性表皮ODC活性。每一數值均為重復測定從3只小鼠制備的表皮提取物的ODC活性的平均值±S.E。
圖13接受口服給藥400mg/kg外消旋D，L-DFMO(○)、200mg/kgD-DFMO(■)或200mg/kg L-DFMO(▲)的大鼠平均血漿濃度。
示例性實施方案的描述人們需要有效并且毒性小的預防和/或治療癌癥的方法。目前的治療方法、特別是用于治療結腸癌和息肉的方法包括腫瘤切除術、化療和放療。本發明涉及開發有效并且安全的藥物，該藥物可改善某些癌癥的預后。本發明提供了使用二氟甲基鳥氨酸的D對映體(D-DFMO)預防和/或治療癌癥的治療組合物和方法。I.二氟甲基鳥氨酸(DFMO)D，L-DFMO，也稱為依洛尼塞，其化學名為2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸。它是鳥氨酸脫羧酶的抑制劑，該酶是多元胺生物合成途徑的限速酶。由于可以抑制多元胺的合成，該化合物可以在多種器官系統中有效地預防癌癥的形成、抑制癌癥生長并且減小腫瘤的大小。它還與其它抗腫瘤劑具有協同作用。該藥物在O.4gr/M2/天的低劑量下對人是相對無毒的并且可以對腫瘤的腐胺合成產生抑制作用。在大鼠腫瘤模型中的研究證實，輸注D，L-DFMO可以使腫瘤的腐胺水平降低90％而不會抑制外周的血小板計數。
還可用D-DFMO的類似物代替D-DFMO來預防和/或治療癌癥。所述類似物可以是如下形式的D異構體 其中R是C1-4烷基或C2-4鏈烯基，這些基團均可以是未取代的或被最多3個選自下列的取代基所取代NHR″’、氯、氟、OR″’或SR″’，其中R″’是氫或C1-4烷基；R’是被最多3個選自氯和/或氟的鹵原子取代的C1-3烷基；R″是氫或C1-4烷基。類似物包括但不僅限于α-甲基鳥氨酸、α-乙基鳥氨酸、α-氯甲基鳥氨酸、α-氟甲基鳥氨酸、α-二氟甲基鳥氨酸、α-二氯甲基鳥氨酸、α-氯氟甲基鳥氨酸、α-三氟甲基鳥氨酸、α-三氯甲基鳥氨酸、α-二氯氟甲基鳥氨酸、α-氯二氟甲基鳥氨酸、α-乙炔基鳥氨酸、α-氰基甲基鳥氨酸、α-乙烯鳥氨酸、α-乙烯基鳥氨酸、α-丙二烯基鳥氨酸、α-羥基甲基鳥氨酸、α-甲氧基甲基鳥氨酸、α-乙炔基-δ-甲基鳥氨酸、α-乙炔基-δ，δ-二甲基鳥氨酸、δ-甲基-乙炔鳥氨酸、α-甲基脫氫鳥氨酸、α-乙基脫氫鳥氨酸、α-氯甲基脫氫鳥氨酸、α-氟甲基脫氫鳥氨酸、α-二氟甲基脫氫鳥氨酸、α--二氯甲基脫氫鳥氨酸、α-氯氟甲基脫氫鳥氨酸、α-三氟甲基脫氫鳥氨酸、α-三氯甲基脫氫鳥氨酸、α-二氯氟甲基脫氫鳥氨酸、α-氯二氟甲基脫氫鳥氨酸、α-乙炔基脫氫鳥氨酸、α-氰基甲基脫氫鳥氨酸、α-乙烯脫氫鳥氨酸、α-乙烯基脫氫鳥氨酸、α-丙二烯基脫氫鳥氨酸、α-羥基甲基脫氫鳥氨酸、α-甲氧基甲基脫氫鳥氨酸、α-二氟甲基腐胺、α-氟甲基腐胺、α-氟甲基脫氫腐胺、δ-甲基-乙炔腐胺、α-乙炔基-δ-甲基腐胺、3-氨基-3-(甲基)-2-哌啶酮、3-氨基-3-(羥基-甲基)-2-哌啶酮、3-氨基-3-(氟甲基)-2-哌啶酮、3-氨基-3-(氯甲基)-2-哌啶酮、3-氨基-3-(二氟甲基)-2-哌啶酮、α-甲基賴氨酸、α-乙基賴氨酸、α--氯甲基賴氨酸、α-氟甲基賴氨酸、α-二氟甲基賴氨酸、α-二氯甲基賴氨酸、α-氯氟甲基賴氨酸、α-三氟甲基賴氨酸、α-三氯甲基賴氨酸、α-二氯氟甲基賴氨酸、α-氯二氟甲基賴氨酸、α-乙炔基賴氨酸、α-氰基甲基賴氨酸、α-乙烯賴氨酸、α-乙烯基賴氨酸、α-丙二烯基賴氨酸、α-羥基甲基賴氨酸、α-甲氧基甲基賴氨酸、α-乙炔基-δ-甲基賴氨酸、α-乙炔基-δ，δ-二甲基賴氨酸、δ-甲基乙炔賴氨酸、α-甲基鳥氨酸甲酯、α-乙基鳥氨酸甲酯、α-氯甲基鳥氨酸甲酯、α-氟甲基鳥氨酸甲酯、α-二氟甲基鳥氨酸甲酯、α-二氯甲基鳥氨酸甲酯、α-氯氟甲基鳥氨酸甲酯、α-三氟甲基鳥氨酸甲酯、α-三氯甲基鳥氨酸甲酯、α-二氯氟甲基鳥氨酸甲酯、α-氯二氟甲基鳥氨酸甲酯、α-乙炔基鳥氨酸甲酯、α-氰基甲基鳥氨酸甲酯、α-乙烯鳥氨酸甲酯、α-乙烯基鳥氨酸甲酯、α-丙二烯基鳥氨酸甲酯、α-羥基甲基鳥氨酸甲酯、α-甲氧基甲基鳥氨酸甲酯、α-乙炔基-δ-甲基鳥氨酸甲酯、α-乙炔基-δ，δ-二甲基鳥氨酸甲酯、δ-甲基-乙炔鳥氨酸甲酯、α-甲基鳥氨酸乙酯、α-乙基鳥氨酸乙酯、α-氯甲基鳥氨酸乙酯、α-氟甲基鳥氨酸乙酯、α-二氟甲基鳥氨酸乙酯、a-二氯甲基鳥氨酸乙酯、α-氯氟甲基鳥氨酸乙酯、α-三氟甲基鳥氨酸乙酯、α-三氯甲基鳥氨酸乙酯、α-二氯氟甲基鳥氨酸乙酯、α-氯二氟甲基鳥氨酸乙酯、α-乙炔基鳥氨酸乙酯、α-氰基甲基鳥氨酸乙酯、α-乙烯鳥氨酸乙酯、α-乙烯基鳥氨酸乙酯、α-丙二烯基鳥氨酸乙酯、α-羥基甲基鳥氨酸乙酯、α-甲氧基甲基鳥氨酸乙酯、α-乙炔基-δ-甲基鳥氨酸乙酯、α-乙炔基-δ，δ-二甲基鳥氨酸乙酯和δ-甲基-乙炔鳥氨酸乙酯。在一個或多個位置上用氘代替了氫的以上所列化合物也認為是DFMO的類似物。
所觀察到的D，L-DFMO的副作用包括在4gr/M2/天的高劑量下對聽力的影響，該副作用可在停藥時消除。當以0.4gr/M2/天的低劑量給藥長達一年時，未觀察到對聽力的影響(Meyskens等，1994)。此外，觀察到了少量的頭暈/眩暈，可在停藥時消除。血小板減少癥主要見于使用高“治療”劑量D，L-DFMO(＞1.0g/m2/天)的研究中和以前經歷過化療的癌癥患者或有骨髓抑制的患者中。雖然與D，L-DFMO治療有關的毒性通常并不象其它類型的化療那樣嚴重，但在有限的臨床試驗中已發現它可以促進與劑量有關的血小板減少癥。此外，在大鼠中的研究證實，與對照相比，連續輸注D，L-DFMO12天可以明顯減少血小板計數。其它研究產生了類似的觀察結果，即，血小板減少癥是連續靜脈內D，L-DFMO療法的主要毒副作用。這些發現表明，D，L-DFMO可以顯著抑制巨核細胞的骨髓前體的ODC活性。DFMO可以抑制增生性的修復過程，例如上皮的傷口愈合。
雖然D，L-DFMO可以有效地阻斷腫瘤腐胺的生物合成，但所產生的抗腫瘤作用是對細胞生長的抑制而不是細胞毒性。例如，D，L-DFMO可以減慢MCA肉瘤的生長速率但不會產生腫瘤的消退。該發現與其它研究者的報道是一致的，他們證實D，L-DFMO是一種細胞生長抑制劑。但是，研究表明了DFMO具有重要作用，因此可以在將來開發包含DFMO的聯合化療方案。
D，L-DFMO及其在治療良性前列腺增生中的應用記載于兩項美國專利--4,413,141和4,330,559中。美國專利4,413,141記載了可以在體外和體內用作有效的ODC抑制劑的D，L-DFMO。施用D，L-DFMO可以在通常很活躍地產生多元胺的細胞內引起腐胺和精脒濃度的降低。此外，當以常規的腫瘤模型進行試驗時，證實D，L-DFMO可以減慢腫瘤細胞的增殖。美國專利4,330,559記載了D，L-DFMO和DFMO衍生物用于治療良性前列腺增生的用途。象許多以迅速的細胞增殖為特征的疾病狀態一樣，良性前列腺增生也伴隨著多胺濃度的異常升高。在該參考文獻中所描述的治療方法可以是向患者口服或胃腸外給藥。
由于D，L-DFMO是有效的ODC抑制劑，一些研究者正在嘗試使用D，L-DFMO作為與其它治療劑的聯合療法的一部分。例如，美國專利4,499,072描述了通過將干擾素與ODC抑制劑聯用來改善ODC抑制劑(包括D，L-DFMO)的減少多元胺的作用。此外，它還描述了將ODC抑制劑和干擾素與已知的細胞毒藥物例如甲氨碟呤聯用。美國專利5,002,879描述了類似的聯合療法，其中，將ODC抑制劑、優選D，L-DFMO與淋巴因子激活的殺傷(LAK)細胞和白介素-2聯合使用。
美國專利4,859,452描述了另一種使D，L-DFMO更易于被人類患者所接受的方案。該專利描述了D，L-DFMO的制劑，其中含有必需氨基酸以及精氨酸或鳥氨酸以幫助降低D，L-DFMO所引起的毒性。II.DFMO的D對映體本發明描述了另一種降低與DFMO有關的毒性的方法。正如文中所描述的，DFMO的D對映體及其類似物雖然仍是ODC的抑制劑，但在動物模型中的毒性、包括耳毒性較低。使用D對映體來治療癌癥以及D-DFMO的藥物組合物將可以克服許多與使用D，L-DFMO有關的問題。
Wagner等(1987)描述了通過高效液相色譜用手性洗脫劑以及通過氣相色譜在Chirasil-Val上拆分各種α-取代的鳥氨酸和賴氨酸類似物的方法。描述了通過使用L-脯氨酸和銅作為手性流動相的反相高效液相色譜法來對映體拆分各種α-取代的鳥氨酸和賴氨酸類似物。雖然鳥氨酸不能通過所用的手性洗脫劑來分離，但對于各種α-烷基-、α-鹵代甲基-、α-乙烯基-和α-乙炔基-取代的鳥氨酸、包括DFMO，卻獲得了極佳的拆分效果。對于脫氫鳥氨酸和賴氨酸類似物也觀察到了類似的分離效果。在手性固定相Chirasil-Val上的氣相色譜可以在將鳥氨酸和賴氨酸類似物衍生成其相應的內酰胺的單氟酰基衍生物后對其進行拆分。對于脫氫鳥氨酸類似物的二-N-全氟酰基烷基酯，在Chirasil-Val上的GC不能拆分或拆分效果很差。手性洗脫劑HPLC方法很容易升級用于半制備拆分各種鳥氨酸類似物，即α-氟甲基鳥氨酸、α-二氟甲基鳥氨酸(DFMO)、α-氯氟甲基鳥氨酸和α-氟甲基脫氫鳥氨酸，已知這些物質在體外和體內是有效的鳥氨酸脫羧酶抑制劑。
美國專利5,217,886描述了通過將2-取代的-哌啶酮與酶L-α-E-氨基己內酰胺-水解酶在二價陽離子的存在下反應然后純化所生成的L-DFMO來生產(-)-4-二氟甲基-鳥氨酸(L-DFMO)的方法。該酶從真菌Cryptococcus laurentii Toray2001得到。
美國專利4,496,588教導了-種合成2-取代的鳥氨酸的光學異構體的方法。該方法包括將外消旋的2-哌啶酮用(-)聯萘磷酸拆分。然后將哌啶酮的各光學異構體分別水解產生2-取代的-鳥氨酸的所需光學異構體。III.人類癌癥本發明還涉及向個體施用治療化合物來減少或抑制癌癥細胞。靶癌細胞包括膀胱、肺、腦、前列腺、腎臟、肝臟、卵巢、乳腺、皮膚、胃、食道、頭和頸部、睪丸、結腸、子宮頸、淋巴系統和血液的癌癥。特別令人感興趣的是許多器官的上皮癌，包括結腸和息肉的上皮癌，它們傾向于表達活化的Ki-ras。同樣特別令人感興趣的是膀胱癌，包括表淺性膀胱癌。
本發明還涉及向表現出癌癥前期癥狀的個體施用治療化合物來預防癌癥的發作。該類型的細胞包括息肉和其它癌癥前期的損傷、惡化前的、腫瘤發生前的或其它顯示可能發展為癌癥狀態的畸變表型1.Kirsten-Ras依賴型的癌癥Ras是指在染色體11上發現的原癌基因產物。它存在于正常的細胞中，在這些細胞中，它通過起到開關的作用來傳播信號(Lowv和Willumsen，1993)。當細胞表面的受體受到刺激時(例如受到激素的刺激時)，Ras打開并轉導讓細胞生長的信號。如果細胞表面受體沒有受到刺激，Ras不會被激活，于是導致細胞生長的途徑將不會被引發。在約30％的人類癌癥中，Ras發生了變異，于是它永久性的打開并指示細胞生長，而不管細胞表面上的受體是否被激活。細胞ras基因(c-ras)的點突變也可以引起可以轉化哺乳動物細胞的p21蛋白。
Ras是一族與逆轉錄病毒有關的DNA序列，它最初從Harvey(H-ras、Ha-ras、rasH)和Kirsten(K-ras、Ki-ras、rasK)鼠肉瘤病毒分離得到。Ras基因廣泛保留于動物內，對應于H-ras和K-ras基因的序列也已經在人、鳥類、鼠科動物和無脊椎動物的基因組內被檢測到。密切相關的N-ras基因已經在人成神經細胞瘤和肉瘤細胞系中被檢測到。該家族的所有基因均具有類似的外顯子-內含子結構并且均編碼p21蛋白。
2.家族性腺瘤性息肉病，癥狀，基因家族性腺瘤性息肉病(FAP)，一種遺傳性的息肉綜合征，是由多發性結腸腺癌(APC)腫瘤抑制基因的種系突變引起的(Su等，1992)。該伴有可變表達的常染色體顯性狀態與成百上千的結腸腺癌的出現有關，它們均在40歲時發展為腺癌，比偶發性結腸癌的平均診斷年齡早20年(Bussey，1990)。在對患有FAP的癥狀前個體的早期研究中，當與正常家族成員對照相比較時，在表面正常的結腸直腸活組織檢查中發現了多元胺精脒和精胺以及它們的二胺前體腐胺水平的升高(Giardiello等，1997)。在FAP患者的表面正常的結腸粘膜活組織檢查中，鳥氨酸脫羧酶(ODC)，哺乳動物多元胺合成的第一個和限速酶的活性也升高了(Giardiello等，1997；Luk和Baylin，1984)。這些發現非常有價值，因為多元胺是最佳的細胞增殖所必需的(Pegg，1986)。此外，用酶激活的不可逆抑制劑DFMO抑制ODC的活性可以在用致癌物處理的嚙齒動物中抑制結腸癌的發生(Kingsnorth等，1983；Tempero等，1989)。
與FAP具有共同的突變APC/apc基因型的Min(多發性腸癌)小鼠可以作為有用的人類FAP患者的實驗動物模型(Lipkin，1997)。Min小鼠可以在120天的生命里在整個胃腸道發展出大于100的胃腸腺瘤/腺癌，導致胃腸出血、梗阻和死亡。
3.表淺性膀胱癌膀胱腫瘤可以根據其在顯微鏡下的形狀分為多種類型。影響膀胱的三種主要癌癥類型是過渡型細胞癌(TCC)、鱗狀細胞癌和腺癌。同樣類型的癌癥也可以在腎臟內層(稱為腎盂)、輸尿管和尿道出現。事實上，膀胱癌的患者在腎臟內層、輸尿管和尿道有同樣類型的癌癥并不罕見，這也就是在評估這些患者時建議對整個泌尿系進行評估的原因。
過渡型細胞癌(TCC)是目前最常見的膀胱癌形式。其占這些癌癥的約90％。TCC是形成膀胱內層的過渡型細胞的癌變形式。鱗狀細胞癌占膀胱癌的約8％。在顯微鏡下，該細胞看起來更象是皮膚癌的細胞。幾乎所有的鱗狀細胞癌都是侵入性的。腺癌占膀胱癌的約1％至2％。該細胞與腸癌的腺形成細胞有許多共同之處。幾乎所有的膀胱腺癌都是侵入性的。
過渡型細胞癌、鱗狀細胞癌和腺癌對手術、放療和化療均有不同的反應，因此，治療方法可能會不同。并不是所有的TCC都是相同的；根據它們是表淺性的還是侵入性的，或根據它們的形狀是乳頭狀的還是平的，可將它們分成多種亞型。
表淺型TCC沒有擴散到膀胱的主要肌肉層(固有肌層)。癌癥可能完全局限于最靠近膀胱內層的過渡型細胞層，或者也可能擴散到在過渡型細胞下方的薄的結締組織層(固有肌層)。
侵入型TCC擴散的更深并且涉及膀胱的肌肉層，而且還有可能侵入該肌肉層外的脂肪層。
乳頭狀TCC可以生長進入膀胱的凹穴中心。它們可能有窄的莖并且看起來象一個微型的蘑菇。某些乳頭狀TCC僅向著膀胱的中心生長。這些稱為表淺型非侵入性乳頭狀TCC。其它的向著中心生長并且還向外生長進入膀胱壁的肌肉層。這些稱為侵入型乳頭狀TCC。
扁平TCC完全不向膀胱的凹穴部分生長。其中的一些僅涉及最靠近膀胱內層或凹穴部分的細胞層。這些稱為非侵入型扁平TCC。非侵入型扁平TCC的醫學名稱為扁平原位癌(CIS)。某些扁平TCC會侵入到較深的層(離開凹穴部分)、特別是肌肉層。這些稱為扁平侵入型TCC。IV.治療癌癥的方法在一個具體的方面，本發明提供了治療各種惡性腫瘤的方法。治療方法涉及用有效量的含有D-DFMO或其類似物的治療組合物對個體進行治療。有效量通常是指足以可檢測到地并且重復地改善、減輕、最小化或限制疾病或其癥狀的程度的量。可以采用更嚴格的定義，包括消除、根除或治愈疾病。
用含有富集的D-DFMO或其類似物的治療組合物治療的優選的癌癥的一個例子是膀胱癌，特別是早期或表淺型膀胱癌。早期膀胱癌幾乎都可以進行治療而不用切除膀胱。治療選項包括單獨的經尿道切除術(TUR)或是在TUR之后進行電灼療法(灼燒)、膀胱內免疫療法或膀胱內化療。
對0期膀胱癌很少做部分膀胱切除術。對于該階段的治療，進行根治性膀胱切除術更為少見。只有當存在許多表淺型癌癥或者當表淺型癌癥持續生長或者雖然采用了其它療法但后來又在膀胱的許多區域鑒定出表淺型癌癥時，才考慮該手術。
0a期膀胱癌的預后是極佳的。這些非侵入型乳頭狀癌癥幾乎都可以通過適當的治療和長期的隨訪護理得到治愈。
雖然這些患者很容易在其泌尿系的其它部位發展出一種或多種表淺型癌癥，但這些癌癥很少是深入侵入型和威脅生命的。0a期癌癥的5年存活率在95％以上。
對0期膀胱癌(也稱為原位癌或扁平非侵入型癌癥)的預后不很理想，因為它們很容易最終發展成為有肌肉侵入的癌癥。5年存活率約為85％。
膀胱內化療是指將藥物直接置于膀胱內而不是通過口服或注射到靜脈內。當直接給藥到膀胱內時，這些藥物可以到達靠近膀胱內層的癌細胞而不會到達腎臟、輸尿管和尿道內的癌細胞、可能已經深入地侵入到膀胱壁內的癌細胞或已經擴散到其它器官的癌細胞。基于這一原因，該療法僅用于表淺型(0期)或最低侵入型(I期)的膀胱癌。該療法使用可以殺死活躍生長的癌細胞的藥物。許多相同的藥物用于全身性給藥(通過口服或注射到靜脈內)來治療更晚期的膀胱癌。噻替哌、絲裂霉素和阿霉素鹽酸鹽最常用于膀胱內化療的藥物。膀胱內化療的一個主要的優點是藥物不會擴散到整個體內。這限制了在全身性化療中可能出現的對其它器官的不利副作用。
D-DFMO或其類似物可以大約0.05至約20.0gm/M2/天的劑量給藥，因為預期D對映體的毒性較低。優選的D-DFMO或其類似物的給藥劑量為約0.1至約15.0gm/M2/天或約0.1至12gm/M2/天或約0.1至10gm/M2/天或約0.1至8gm/M2/天或約0.1至6gm/M2/天或約0.1至4gm/M2/天或約0.1至2gm/M2/天或約0.1至1gm/M2/天或約0.1至0.5gm/M2/天。
為了殺死細胞、抑制細胞生長、抑制轉移、減小腫瘤體積或逆轉或減少腫瘤細胞的惡性表型，使用本發明的方法和組合物，通常可以將“靶”細胞和治療組合物接觸。可將其與含有其它可有效治療癌癥的藥物的組合物聯合。這些組合物應以可有效殺死或抑制細胞增殖的聯合量提供。該方法可以包括將細胞同時與D-DFMO或其類似物以及藥物或因子接觸。這可以通過將細胞與單一組合物或同時含有兩種藥物的藥物制劑接觸來實現，或通過將細胞同時與兩種不同的組合物或制劑接觸來實現，其中的一種組合物含有D-DFMO或其類似物，而另一種含有第二種藥物。
或者，D-DFMO療法可在用其它藥物治療之前或之后間隔數分鐘或數周進行。在將其它藥物和D-DFMO或D-DFMO的類似物分別向細胞施用的實施方案中，通常應確保各給藥時間的間隔不會超過有效時間，從而使藥物和D-DFMO仍能夠對細胞產生有利的聯合作用。在該情況下，應將細胞與兩種代謝物在相互間隔約12-24小時內接觸，更優選在相互間隔約6-12小時內接觸，首選延遲的時間僅為約12小時。在某些情況下，可能需要延長治療的時間間隔，在各治療之間相隔數天(2、3、4、5、6或7天)至數周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
向患者施用本發明的治療性D-DFMO或其類似物的組合物可以按照化療的一般給藥方案來進行，并考慮D-DFMO或D-DFMO的毒性(如果有的話)。如需要，可以將治療周期重復進行。也可以將各種常規的療法以及手術介入和所述的療法聯合應用。
當在臨床上采用D-DFMO療法時，需要制備適于預定應用的藥物組合物。通常需要制備基本上不含熱原以及其它任何可能對人或動物有害的雜質的藥物組合物。通常還需要采用適宜的鹽和緩沖劑來使組合物穩定并使組合物能夠被靶細胞攝取。
本發明的含水組合物含有有效量的溶解或分散在可藥用載體或含水介質中的化合物。該組合物還可以稱為接種物。短語“可藥用的”是指在向動物或人給藥時不會產生相反的、過敏性的或其它不希望的反應的分子或組合物。本文所用的“可藥用載體”包括各種溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這些介質和試劑對于藥物活性物質的用途是本領域公知的。除了與活性成分不相容的任何常規介質或試劑外，其在治療組合物中的應用均是可行的。還可以在組合物中摻入另外的活性成分。
本發明的組合物可以包括傳統的藥物制劑。分散液還可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及油中制備。在常規的存放和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物的生長。
根據所要治療的具體癌癥，本發明的治療性組合物的給藥可以通過任何常規的途徑進行，只要能夠通過該途徑到達靶組織即可。這些途徑包括口服、鼻、頰部、直腸、陰道或局部的途徑。局部給藥對于皮膚癌的治療特別有利。或者，可以通過原位的、真皮內的、皮下、肌肉內、腹膜內或靜脈內注射進行給藥。這些組合物通常以含有生理可接受的載體、緩沖劑或其它賦形劑的可藥用組合物的形式給藥。
在某些實施方案中，還可以采用先體外后體內的療法。先體外后體內的療法涉及從患者中取出靶細胞。將細胞在患者體外進行處理然后送回到患者體內。先體外后體內療法的另一個例子涉及自身骨髓移植(ABMT)的一種改變形式。在許多時候，ABMT不能成功，因為在抽出的骨髓中存在一些癌細胞，向治療的患者回輸骨髓會導致向患者重新注入癌細胞。但是，在一個實施方案中，可以將抽出的骨髓在患者體外用靶向并可殺死癌細胞的病毒顆粒進行處理。一旦骨髓細胞被“凈化”，就可將其重新引入患者體內。
治療可以包括各種“單位劑量”。單位劑量被定義為含有根據其給藥方法、即適宜的途徑和治療方案計算出的可以產生所需響應的預定量的治療組合物。給藥量以及具體的給藥途徑和制劑是臨床技術人員所熟知的。所要治療的個體、特別是個體的狀態和所需的保護作用也是很重要的。單位劑量并不一定需要以單一注射液的形式給藥，還可以包括在一段時間內的連續輸注。
本發明的一個優選實施方案涉及將D-DFMO或其類似物的治療組合物用于特定的靶癌細胞。靶癌細胞包括肺、腦、前列腺、腎臟、肝臟、卵巢、乳腺、皮膚、胃、食道、頭和頸部、睪丸、結腸、子宮頸、淋巴系統和血液的癌癥。特別令人感興趣的是非小細胞肺癌，包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞未分化的癌。
根據本發明，可以通過直接向腫瘤注射D-DFMO或類似的組合物來治療癌癥。或者，可以用任何適宜的傳送載體向腫瘤輸注組合物。還可以采用對腫瘤的局部或區域性給藥。最后，還可以進行全身性給藥。如果適當的話，還可以采用連續給藥，例如，當腫瘤被切除并且對腫瘤床進行治療以消除殘余的、在顯微鏡下可以看到的病變時。優選通過注射器或導管給藥。所述連續輸注可以在治療開始后進行約1-2小時至約2-6小時、至約6-12小時、至約12-24小時、至約1-2天、至約1-2周或更常的時間。通常，通過連續輸注的治療組合物的劑量應等于通過單次或多次注射的給藥劑量，根據輸注的持續時間而調整。
對于＞4cm的腫瘤，給藥的體積應為約4-10ml(優選10ml)，而對于＜4cm的腫瘤，應使用約1-3ml的體積(優選3ml)。作為單一劑量給藥的多次注射含有約0.1至約0.5ml體積。病毒顆粒優選通過向腫瘤的多次注射給藥進行接觸，給藥間隔約為1cm。
在某些實施方案中，所治療的腫瘤是不能切除的，至少在開始時是這樣。用治療性D-DFMO或類似的組合物治療可以因為在邊緣處的收縮或通過消除某些侵入性的部分而增加腫瘤的可切除性。在治療后，切除可能是可行的。在切除術后的進一步治療可以消除腫瘤部位在顯微鏡下可見的殘余病變。
癌癥療法還包括與化學和放射療法的各種組合療法。聯合化療包括，例如順鉑(CDDP)、碳鉑、丙卡巴肼、氮芥、環磷酰胺、喜樹堿、異環磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、bisulfan、亞硝脲、放線菌素、柔紅霉素、阿霉素、博萊霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、紫杉酚、反鉑、5-氟尿嘧啶、長春新堿、長春堿和甲氨蝶呤或其各種類似物或衍生物。
其它可以引起DNA損傷并且被廣泛使用的因素包括γ射線、X射線和/或直接向腫瘤細胞輸送放射性同位素。還可以采用DNA損傷因子的其它形式，例如微波和UV輻射。很可能所有這些因子可以對DNA、DNA前體、DNA的復制和修復以及染色體的裝配和維持產生寬范圍的損傷。X射線的劑量范圍從長時間治療(3至4周)的50至200倫琴的每日劑量至2000至6000倫琴的單劑量。放射性同位素的劑量范圍可以有很寬的變化，并取決于同位素的半衰期、所發出輻射的強度和種類以及腫瘤細胞的攝取。
可以采用各種聯合形式，例如，當D-DFMO或類似的組合物是“A”而放療或化療劑是“B”時A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A當用于細胞時，本文中所用的術語“接觸”是指將治療性組合物和化療或放療劑輸送給靶細胞或直接和靶細胞放置在一起的過程。為了達到細胞殺傷或抑制細胞生長的作用，將兩種藥物以可以有效殺死細胞或預防其分化的聯合量向細胞給藥。V.藥物組合物本發明的含水組合物含有有效量的溶解或分散在可藥用載體或含水介質中的D-DFMO或其類似物。短語“可藥用的”是指在向動物或人給藥時不會產生相反的、過敏性的或其它不希望的反應的分子或組合物。
本文所用的“可藥用載體”包括各種溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這些介質和試劑對于藥物活性物質的用途是本領域公知的。除了與活性成分不相容的任何常規介質或試劑外，其在治療組合物中的應用均是可行的。還可以在組合物中摻入另外的活性成分。對于人類的給藥，制劑應滿足FDA生物制劑標準部所要求的無菌、致熱性、一般安全性和純度標準。
生物材料應進行充分地透析以除去不希望的小分子量分子和/或進行冷凍干燥以便更易于配制到所需的載體內。然后可將活性化合物配制成用于胃腸外給藥的形式，例如，配制成用于通過靜脈內、肌肉內、皮下、損傷內或腹膜內的途徑注射的形式。參照本文所公開的內容，制備含有headpin agent作為活性組分或成分的含水組合物是本領域技術人員熟知的。通常，所述組合物可以制成液體溶液或混懸液形式的可注射制劑；還可以制成適用于在注射前通過加入液體來制備溶液或混懸液的固體形式；該制劑還可以被乳化。
適于注射的藥物形式包括無菌含水溶液或分散液；含有芝麻油、花生油或含水丙二醇的制劑；以及用于現場制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。在所有情況下，這些形式必需是無菌的并且必需是易于注射的液體。其在生產和存放的條件下必需是穩定的并且需要防止微生物、例如細菌和真菌的污染作用。
游離堿或可藥用鹽形式的活性化合物的溶液可以在適當含有表面活性劑例如羥丙基纖維素的水中制備。分散液還可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及油中制備。在常規的存放和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以預防微生物的生長。
本發明的D-DFMO或類似物可以以中性的或鹽的形式配制成組合物。可藥用鹽包括與無機酸例如鹽酸或磷酸或有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成鹽(與蛋白質的游離氨基形成)。還可以從無機堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵以及有機堿例如異丙基胺、三甲基胺、組氨酸、普魯卡因等制得與游離羧基形成的鹽。
載體還可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、其適宜的混合物和植物油的溶劑或分散介質。可以通過例如使用包衣例如卵磷脂、在分散液的情況下通過保持所需的粒度以及通過使用表面活性劑來保持適宜的流動性。預防微生物的作用可以通過各種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等來進行。在許多情況下，優選含有等滲劑例如糖或氯化鈉。延長可注射組合物的吸收可以通過在組合物中使用延緩吸收的物質例如一硬脂酸鋁和明膠來實現。
無菌可注射溶液可以通過將所需量的活性化合物和根據需要的以上所列舉的各種其它成分一起摻入到適宜的溶劑中然后無菌過濾來制備。通常，分散液通過將各種無菌的活性成分摻入到含有基礎分散介質和以上所列的其它所需成分的無菌載體中來制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術，由此可以得到活性成分加預先無菌過濾的溶液中所存在的任何其它所需成分的粉末。制備用于直接注射的更濃或高度濃縮的溶液也是可行的，其中，預測使用DMSO作為溶劑可以導致向小區域內極為迅速地滲透、輸送高濃度的活性物質。
當制成制劑時，可將溶液以與給藥的制劑相容的方式和治療有效量給藥。該制劑很容易以各種劑量形式、例如以上描述的可注射溶液給藥，但也可以采用藥物釋放膠囊等形式。
對于以水溶液的形式進行胃腸外給藥，如需要，應對溶液進行適當的緩沖并且首先將液體稀釋劑用足夠量的鹽水或葡萄糖調至等滲。這些水溶液特別適于靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內給藥。就此而言，根據本文所公開的內容，可以采用的無菌含水介質是本領域技術人員熟知的。例如，可將1個劑量溶于1ml等滲氯化鈉溶液然后加入1000ml皮下輸注液中或在推薦的輸注部位注射(參見例如，“Remington’sPharmaceutical Sciences”，第15版，1035-1038和1570-1580頁)。根據所治療患者的情況，可能需要對劑量進行一些改變。在任何情況下，應由負責給藥者確定對于每一個體的適宜劑量。
除了將化合物配制成用于胃腸外給藥、例如靜脈內或肌肉內注射的制劑外，其它的可藥用形式包括，例如片劑或其它用于口服給藥的固體；脂質體制劑；定時釋放的膠囊以及任何其它常用的形式，包括霜劑。
還可以在本發明中使用鼻用溶液或噴霧劑、氣霧劑或吸入劑。鼻用溶液通常是含水溶液，用于以滴劑或噴霧劑的形式向鼻通道給藥。鼻用溶液被制備成在許多方面與鼻分泌物類似，從而可以保持正常的纖毛活動。因此，含水鼻用溶液通常是等滲的并且進行適當的緩沖以保持pH在5.5至6.5。此外，如需要，還可在制劑中含有抗菌防腐劑(與眼科制劑中所用的相同)和適宜的藥物穩定劑。已知有各種市售的鼻制劑，其含有例如抗生素和抗組胺藥并且用于預防哮喘。
適用于其它給藥方式的其它制劑包括陰道栓劑和子宮托。也可以使用直腸栓劑。栓劑是具有各種重量和形狀的固體劑量形式，通常被制成用于插入直腸、陰道或尿道的藥物形式。在插入后，栓劑在腔液中軟化、熔化或溶解。通常，對于栓劑，常規的粘合劑和載體可以包括，例如聚亞烷基二醇或甘油三酯；所述栓劑可以從含有0.5％至10％、優選1％-2％活性成分的混合物形成。
口服制劑含有常用的賦形劑，例如藥品級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物可以是溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或散劑的形式。在某些實施方案中，口服藥物組合物含有惰性稀釋劑或可同化的食用載體，或者可將其包封在硬或軟殼的明膠膠囊中，或者可將其壓制成片劑，或者可將其直接摻入到食物中。對于口服治療性給藥，可將活性化合物與賦形劑混合并以咀嚼片、口含片、錠劑、膠囊、酏劑、混懸液、糖漿、糯米紙囊劑等形式使用。這些組合物和制劑應含有至少0.1％的活性化合物。當然，組合物和制劑的百分比可以改變，通常可以在劑量單位的約2至約75％(重量)之間，或優選在25-60％之間。在所述治療用組合物中的活性化合物的量為可以獲得適宜劑量的量。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊等還可以含有如下成分粘合劑，例如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；甜味劑，例如蔗糖、乳糖或糖精或矯味劑例如薄荷、冬青油或櫻桃香精。當單位劑量形式是膠囊時，除上述類型的物質外，它還可以含有液體載體。可以存在各種其它物質作為包衣或用來改善固體單位劑量形式的外觀。例如，片劑、丸劑或膠囊可以用紫膠、糖或二者進行包衣。糖漿或酏劑可以含有活性化合物、甜味劑蔗糖或、防腐劑對羥基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和矯味劑例如櫻桃或橙香精。
在某些實施方案中，還可將脂質體和/或納米顆粒用于D-DFMO或其類似物的制劑和給藥。脂質體的形成和用途是本領域技術人員公知的，在下文中也進行了描述。
納米膠囊通常以穩定和可重現的方式包裹化合物。為了避免由于細胞內聚合物超負荷所引起的副作用，這些超細顆粒(粒度約為0.1μm)應使用可在體內降解的聚合物。滿足這些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸烷基酯納米顆粒可用于本發明，這些顆粒很容易制備。
脂質體由磷脂制備，將所述磷脂分散在含水介質中，其自發地形成多層的同心雙分子層囊(也稱為多層囊(MLV))。MLV的直徑通常為25nm至4μm。對MLV進行超聲處理可以導致小的單層囊(SUV)的形成，其直徑為200至500，在核心中含有水溶液。
以下資料也可用于脂質體制劑的生產。當在水中分散時，根據脂類與水的摩爾比，磷脂可以形成除脂質體之外的各種結構。在低比例時，脂質體是優選的結構。脂質體的物理性質取決于pH、離子強度和二價陽離子的存在。脂質體可以顯示對離子和極性物質的低通透性，但在升高的溫度下會發生相變，從而明顯改變了其通透性。該相變涉及從緊密填充的、有序的結構(稱為凝膠態)變成松散填充的、不很有序的結構(稱為流態)。這在特征性的相變溫度下發生，并導致對于離子、糖和藥物通透性的增加。
脂質體通過四種不同的機制與細胞相互作用通過網狀內皮系統的吞噬細胞例如巨噬細胞和嗜中性白細胞的胞吞作用；通過非特異性的弱的疏水或靜電力或通過與細胞表面成分的特異性相互作用吸附到細胞表面；通過脂質體的脂質雙分子層插入到漿膜中并同時將脂質體的成分釋放到細胞質內而與漿細胞膜融合；以及通過將脂質體的脂類轉移到細胞或亞細胞膜上(或反過來)而與脂質體的成分沒有任何締合。改變脂質體制劑可以改變其作用機制，盡管可能同時有一種以上的機制在起作用。VI.實施例以下實施例是用來說明本發明的優選實施方案的。本領域技術人員應當理解，以下實施例中所公開的技術代表了本發明人所發現的可以很好地實踐本發明的技術，因此可以認為是構成了該實踐的優選方式。但是，根據本公開的教導，本領域技術人員可以理解，可以對所公開的具體實施方案進行許多改變仍能得到相似或相同的結果而不超出本發明的實質和范圍。
實施例1DFMO的體內研究方法動物和試劑24只Long Evans色素沉著性大鼠(250-275g)從Harlan SpragueDawley(Indianapolis，IN)獲得，36只色素沉著性豚鼠從KuiperRabbit Ranch(Gary，IN)獲得，其開始時的重量為200-250g并關在Oklahoma大學健康科學中心的動物設施內。將試驗動物在12∶12小時光照/黑暗循環下飼養，可以自由接近食物和水，室溫控制在21℃。大鼠中的D，L-DFMO劑量響應將24只動物隨機分成8組，每組3只。治療組如下0、200、400和600mg/kg/天D，L-DFMO，每天通過管飼法給藥(5天/周)4和8周。再將另外4只動物隨機分成2組400和600mg/kg/天，通過管飼法每天兩次給藥(5天/周)8周。在周末時，將D，L-DFMO(通過重量評估確定體積)放在飲用水中(30ml/天/動物)。每天稱量體重(5天/周)并在給藥結束時進行聽覺功能評估。豚鼠中的D，L-DFMO劑量響應將31只幼年色素沉著豚鼠隨機分到每日接受(7天/周)腹膜內注射0.5g/kg D，L-DFMO(n＝5)、1g/kg/天D，L-DFMO(n＝5)、2g/kg/天D，L-DFMO(n＝2)、3g/kg/天D，L-DFMO(n＝4)和鹽水載體(n＝5)的治療組中。動物數量的變化是由于顯著的死亡率引起的，因此決定中斷向更高的劑量組增加動物。在給藥45天時，對0.5g/kg和1g/kg/天的試驗動物評估聽力閾值，而對于2g/kg/天的受試者，在給藥第22天時評估。因此，D，L-DFMO劑量為1g/kg/天和2g/kg/天的試驗動物每公斤體重接受了總量基本相同的D，L-DFMO劑量。每天稱量體重以確定注射的體積。在給藥結束時進行聽覺功能評估。DFMO對映體與外消旋體在豚鼠中的比較將20只試驗動物隨機分到接受1g/kg/天D-DFMO、1g/kg/天L-DFMO、1g/kg/天D，L-DFMO或鹽水的治療組(n＝5)中。每天進行腹膜內注射，共注射45天，通過每天稱量體重確定注射量。在給藥結束時，對試驗期間存活下來的所有動物進行聽覺功能評估。CAP和CM記錄和分析在治療周期結束時(最后一次給藥24小時后)，將大鼠用賽拉嗪(13mg/kg，肌肉內)和氯胺酮(87mg/kg，肌肉內)麻醉，將豚鼠用賽拉嗪(5mg/kg，肌肉內)、氯胺酮(30mg/kg，肌肉內)和尿烷(160mg/kg，腹膜內)麻醉。用腹側法手術暴露圓形窗口，并在手術顯微鏡下在圓形窗口上小心地放置一個銀線電極以記錄化合物動作電位(CAP)和耳蝸微動(CM)。在頸部肌肉內放置一個氯化銀電極作為對照。將CAP和CM信號用Grass A.C.前置放大器(P15型)放大。增益為1000。CAP的帶通頻率為0.1-1.0kHz，CM的帶通頻率為0.1-50kHz。用數字示波器(Nicolet Instrument Co.，2090-IIIA)觀察CAP信號。將CM信號送到SR530 Lock-in放大器(Stanford Research Systems，Inc.)然后再送到PC計算機上自動測定1μVRMS振幅。測定引起剛剛能檢測到的CAP的試驗頻率的聲級并用該值以頻率來評估閾值。通過計算機程序測定在各試驗頻率下引起1μV RMS CM的聲級并評估1μV RMS CM等幅曲線。通過在相同頻率下各治療動物的各CAP閾值和平均對照值(由僅接觸載體的試驗動物測得)之間的差異計算出CAP閾值改變。以類似的方式得到CM等幅曲線圖。
用SR530Lock-in放大器(Stanford Research Systems.Inc.，Sunnyvale，CA)產生引起CAP和CM的純音。將信號通過可編程的衰減器衰減，然后通過高電壓放大器放大并傳送到放置在與暴露的外聽覺口相適應的張開器內的高頻音源(由ACO1/2″麥克風7013制成)。音頻為2、4、6、8、12、16、20、24、30、35和40kHz。用連續音引發CM。用音爆來引發CAP。音爆的持續時間為10毫秒，上升/下降時間為1.0毫秒，重復率為9.7次/秒。將所有試驗頻率下的聲級用位于鼓膜附近的探針麥克風校準。
用重復測量的ANOVA(NCSS軟件)來評估不同藥物接觸量和試驗頻率之間的總的顯著性及其相互作用。將頻率作為個體內變量來評估，治療組為個體間變量。通過Fisher最少二乘方差異進行Post hoc分析。組織學在有限數量的個體中評估柯替氏器官的表面制備物。在記錄了CAP和CM之后，在深度麻醉下將動物斬首。立即取出耳蝸。打開圓形和橢圓形的窗口并鉆開耳蝸的尖端以便于灌注。將耳蝸用SDH(琥珀酸脫氫酶)保溫溶液(0.05M琥珀酸鈉、0.05M磷酸鹽緩沖液和0.05％四硝基藍四唑)灌注然后在該溶液中浸泡1小時(37℃)。然后將耳蝸用10％福爾馬林固定至少2天。固定后，將耳蝸在10％EDTA溶液(乙二胺四乙酸)中脫鈣3天或根據需要脫鈣更長的時間。在光學顯微鏡下完成耳蝸的顯微解剖。
實施例2在用D，L-DFMO處理的大鼠中的劑量響應毒性和耳毒性當通過插管法使大鼠接觸劑量為200mg/kg/天至1.2g/kg/天的D，L-DFMO長達8周時，未產生任何明顯的重量改變或聽覺功能障礙。圖1顯示了在5天間隔期內所有治療組的平均重量增加(以克表示)。與對照的治療增加相比，200mg/kg/天至600mg/kg/天的劑量沒有引起任何的重量減輕。兩個最高劑量似乎可以減輕體重的增加，盡管這些組中所用的試驗動物的數量較少。當進行統計學分析時，這些數據不符合顯著性的標準(F[22，44]＝1.56，p＝0.103)。
在圖2和圖3中分別表示出了多劑量D，L-DFMO治療對CAP閾值和CM幅度的影響。D，L-DFMO對兩種測量結果均沒有影響。CAP閾值水平和1μV RMS等幅CM曲線與載體處理的對照個體相差不到5dB；這一大小的變化在與測量有關的誤差范圍內，沒有生物學意義(F[2，4]＝1.24，p＝0.381)。
實施例3在用D，L-DFMO處理的豚鼠中的劑量響應毒性和耳毒性與大鼠中觀察到的數據相反，當將豚鼠用劑量為500mg/kg/天至3g/kg/天的D，L-DFMO處理時，觀察到了明顯的全身毒性和耳毒性。所有3g/kg/天的試驗動物均在處理的前6天內死亡，有五分之二1g/kg/天的試驗動物不能在整個6周的給藥時間內存活。隨著3g/kg/天組的死亡，增加了兩個2g/kg/天的試驗動物。在第22天，2g/kg/天的動物事實上已經沒有體重的增加，于是在此時對動物的聽覺功能進行評估。圖4顯示進行了聽力評估的動物體重增加的速率。對于2g/kg/天的試驗動物，體重增加被有效地阻滯，而1g/kg/天的試驗動物似乎在給藥期的最后10天與對照產生了差異。500mg/kg/天D，L-DFMO的動物顯示沒有明顯的全身性毒性的癥狀；它們的生長速率實際上超過了對照。分析表明，500mg/kg/天以及1g/kg/天的試驗動物均與對照沒有顯著性差異(F＜1.0)。
在D，L-DFMO處理的豚鼠中觀察到了劑量依賴性的聽力閾值的升高。由于全身性毒性，聽力評估實際上是在5只500mg/kg/天D，L-DFMO、3只1g/kg/天D，L-DFMO、2只2g/kg/天D，L-DFMO和3只對照試驗動物(去掉了兩只動物，一只是由于麻醉劑過量，另一只是由于懷孕)上進行的。圖5顯示了各D，L-DFMO給藥組CAP靈敏度的減弱。接受500mg/kg/天藥物的試驗動物顯示CAP閾值升高的平均值為9dB，在整個頻率范圍內，靈敏度的減弱相對較為平坦。有限數量的2g/kg/天和1g/kg/天的動物顯示的閾值變化在高頻率試驗范圍內最為明顯。2g/kg/天組顯示在所有頻率下的平均損失為14dB，而1g/kg/天的試驗動物顯示10dB的平均偏移。當僅對20至40kHz之間的頻率進行評估時，聽力靈敏度的平均損失對于2g/kg/天的試驗動物為30dB，而對于1g/kg/天的試驗動物僅為17dB，對于500mg/kg/天的試驗動物為7.1dB。將重復測量值的ANOVA對不同的n進行校正，顯示出接受2g/kg/天D，L-DFMO、1g/kg/天D，L-DFMO、500mg/kg/天D，L-DFMO和鹽水的四個給藥組之間CAP的顯著性差異(治療之間，F[3，9]＝4.06，p＝0.044；頻率之間，F[10，190]＝25.98，p＜0.001；治療-頻率相互作用之間，F[30，190]＝10.89，p＜0.001)。Post hoc分析顯示所有3組藥物治療均與對照有顯著性差異(p＜0.05)。
有趣的是，與對CAP靈敏度的破壞相反，治療對CM的靈敏度沒有影響(參見圖6)。CM主要由外毛細胞、特別是耳蝸底部的細胞(靠近記錄電極)對聽覺刺激的反應而產生。CM不受任何劑量D，L-DFMO的影響表明在CAP中所看到的作用不是在OHC功能障礙的基礎上繼發的。所有治療均沒有產生相對于對照的具有統計學意義的CM曲線的改變(F＜1.0)。
對存在由D，L-DFMO(1g/kg/天，45天)引起嚴重的CAP閾值升高但CM靈敏度沒有改變的豚鼠的毛細胞損傷進行了組織學檢查。試驗動物相對于對照的CAP閾值改變隨著刺激的頻率而增加，最大升高值為在40kHz時的55dB(圖7E)。由于CM的干擾，沒有測得對低頻率的CAP閾值。通過與尖端的百分比距離來確定沿著基底膜表面的位置，并且可以與生理學數據相關，因為將聲音以音調排列的方式編碼，用最高的頻率表示耳蝸的最底部。在基底膜最頂端40％內的內毛細胞(IHC)和外毛細胞(OHC)均顯示正常的SDH(琥珀酸脫氫酶)染色。例如，圖7A是位于基底膜26％處的毛細胞圖像。基底膜的其余60％(圖7B)顯示出毛細胞損傷。在74％處(圖7C)，出現了OHC和IHC的減少。有趣的是，在非常靠近底部的某些位置，所有的IHC均消失了，但仍有許多OHC存活。(圖7D，90％)。CM的靈敏度正常(圖7F)表明在靠近圓形窗的基底轉彎處存活的OHC具有正常的功能。
實施例4L-DFMO和D-DFMO在豚鼠中的毒性和耳毒性在圖8、圖9和圖10中顯示了比較DFMO的對映體和外消旋體的數據。發現D-DFMO在豚鼠中不產生任何明顯的聽力損傷，而DFMO的L-對映體產生超過了D，L-DFMO處理的閾值變化。體重的數據表明該對映體不產生明顯的全身性毒性。
圖8顯示了動物的生長。盡管所處理的動物似乎比對照的生長速度較幔，但對于整個試驗期間的數據的統計學分析顯示沒有顯著性差異(F[3，16]＝0.95，p＝0.44)。對映體和外消旋體的體重增加之間彼此沒有差異。
圖9顯示了對映體、外消旋體和對照的CAP閾值改變。L-DFMO(實心的三角形)和D，L-DFMO(實心的正方形)均產生了25±2dB的平均閾值改變。當對D-對映體(圖9，實心圓)測定聽覺功能時，在所有頻率下均測得了2dB的CAP平均閾值改變，在40kHz處略有升高。重復測量值的ANOVA顯示出在接受1g/kg/天D，L-DFMO、1g/kg/天D-DFMO、1g/kg/天L-DFMO和鹽水的四個給藥組之間CAP的顯著性差異(治療之間，F[3，19]＝7.41，p＝0.002；頻率之間，F[10，190]＝7.99，p＜0.001；治療-頻率相互作用，F[30，90]＝2.90，p＜0.001)。當進行Fisher’s LSD時，發現L-DFMO(p＜0.005)和D，L-DFMO(p＜0.005)在所有試驗頻率下與對照均有顯著性差異，但D-對映體沒有。
與對CAP閾值的顯著影響相反，L-DFMO不產生CM靈敏度的改變(圖10，實心三角形)。在35和40kHz處的略微升高是由于一只動物在這兩個頻率下顯示高達40dB的聽力損失。D-DFMO也不會改變CM。與對照相比，所有治療均不會顯著影響CM(F[3，16]＝0.9，p＝0.45)。討論當用酶抑制劑對動物進行治療時，預期結果會是有某些飽和點的劑量依賴型的曲線。為了消除D，L-DFMO化療的耳毒性副作用，需要測定對該藥物的耳毒性劑量反應。以前的研究是在飲用水中給藥，這使得難以測定實際的藥物攝取量。因此，需要直接給藥以產生準確的耳毒性劑量反應。在該方法同時使用大鼠和豚鼠。
大鼠模型不產生明顯的體重減輕(毒性)和聽力范圍內的明顯閾值變化(耳毒性)。該結果暗示在大鼠中的D，L-DFMO治療不會產生以前在人類患者中所報道的耳毒性副作用。Schweitzer等(1986)發現，用1％DFMO在飲用水中對大鼠治療(約300mg/kg，假設每日攝取30ml水)不僅可以引起正常的腦干激發電位，多元胺的水平也不會減少至可能會影響其它系統的水平。本發明人通過使動物接觸(插管法)高達4倍的更大劑量擴大了該數據的范圍，仍未發現對聽力閾值的影響。如果多元胺的水平確實在聽覺功能中起作用，大鼠的代謝會使D，L-DFMO不能抑制多元胺的合成達到決定性的水平，因此不能將大鼠用作測定D，L-DFMO耳毒性的可靠模型。
相反，用D，L-DFMO處理在豚鼠中產生了明顯的聽覺功能障礙(耳毒性)。同樣，以前的研究中的實際藥物攝取量的測定是很困難的，因此在本研究中所有的給藥均是通過腹膜內注射來進行的。在研究的前6天，D，L-DFMO在3g/kg/天的劑量下顯示明顯的毒性，100％的動物死亡。其余的治療組在試驗期間內未產生明顯的毒性(死亡或體重減輕)。對治療過程中死亡的一個動物以及一直存活到實驗結束的動物進行尸檢。結果支持這樣的結論，即，重復注射與試驗動物的死亡或對體重增加的抑制沒有影響。
CAP閾值表明D，L-DFMO可以在豚鼠中產生明顯而且是可重現的改變。正如所預期的，在整個試驗頻率下的平均閾值改變是劑量依賴型的。2g/kg/天的D，L-DFMO可以在較短的時間內產生較大的聽力損傷暗示最終決定耳毒性的是藥物的給藥量而不是治療的持續時間。
CM主要由耳蝸基底轉彎處的外毛細胞產生，它是檢測許多耳毒性藥物、包括氨基糖甙和順鉑所引起的損傷的一個靈敏的測量方法，但D，L-DFMO不會產生CM等幅曲線的改變。組織學表明，在基底轉彎處的大部分外毛細胞是完整的是對CM沒有影響的原因。但是，基底內毛細胞顯示出大范圍的損傷，大部分均消失了。耳蝸的中部顯示出外毛細胞和內毛細胞均有損傷和減少。在尖端，外毛細胞和內毛細胞均沒有損傷或減少。因此，D，L-DFMO可能對位于耳蝸基底轉彎處的毛細胞有一些選擇性。
劑量反應曲線的產生使得可以對D，L-DFMO及其對映體進行比較。由于本發明人發現了可重現的D，L-DFMO引起的豚鼠閾值變化，因此可以在豚鼠中繼續對對映體進行鑒定。由于在高劑量下的致死率，選擇1g/kg/天用于將對映體和外消旋體進行比較。
對映體不顯示明顯的毒性(通過體重增加來測定)。發現DFMO的D形式對化合物的動作電位或耳蝸微動均沒有影響。對聽覺功能的評估發現DFMO的L形式可以對正常的耳蝸電位產生明顯的破壞。以上描述的研究暗示了可以開發涉及DFMO的單一對映體的化療方案。
實施例5D-、L-和DL-二氟甲基鳥氨酸的比較。
對鳥氨酸脫羧酶(ODC)活性的影響材料和方法將重組鼠ODC在大腸桿菌中表達然后純化用于研究。用微量測定來測定ODC活性和DFMO的抑制作用。具體地講，將20μl重組的鼠ODC(濃度為0.6mg/ml)和系列稀釋液(0至80μM的D-、L-或D-L-DFMO)一起在1.5ml Eppendorf管中于室溫下預保溫30分鐘。通過加入27.5μlBrij35ODC試驗混合物(最終濃度40mM Tris HCl pH7.5，8mM DTT，0.64mM吡哆醛磷酸鹽(PLP)，0.80mM EDTA，0.04％ Brij35和0.2μCi(14C)L-鳥氨酸)在Eppendorf管中引發反應。將40μl CO2捕獲劑(乙醇胺/3-甲氧基乙醇.2∶1)置于20ml玻璃螺口液體閃爍瓶的底部，將含有樣品的開口Eppendorf管置于瓶內遠離捕獲劑的位置。立即用隔膜蓋將閃爍瓶蓋上，然后將小瓶于37℃的振搖水浴中保溫1小時。然后將小瓶從水浴中取出，通過隔膜向開口的Eppendorf管內加入100μl2M檸檬酸以停止ODC反應。將閃爍瓶繼續于37℃下保溫2小時以終止反應。將Eppendorf管從小瓶內取出并加入6ml閃爍液。將小瓶在Beckman LS-6500閃爍計數器上計數分鐘。通過對數據的最小二乘方擬合得到KI抑制值。結果在使用濃度為0.6μM至80μMD-、L-和D，L-DFMO的三次獨立的研究中，測定了抑制50％ODC活性(Ki)的有效濃度水平。有效濃度水平如下D-DFMO24.1μML-DFMO6.4μMD，L-DFMO 8.1μM兩種對映體以及外消旋混合物均有抑制作用。D-DFMO的KI值比L形式低4倍，比混合物低3倍。
實施例6D-、L-和D，L-DFMO在細胞系中誘導的細胞凋亡在6種人細胞系中研究了D-、L-和D，L-DFMO誘導細胞凋亡的能力MCF-7(乳腺癌，ATCC#HTB22)、LNCaP(前列腺癌，ATCC#CRL1740)、PC-3(前列腺癌，ATCC#CRL1435)、HT-29(結腸癌，ATCC#HTB38)、HSK612(正常的角質細胞，購自InCell.Inc.)和506SM(正常的結腸粘膜下層間質細胞，購自InCell.Inc.)。將所有三種形式的DFMO在兩種濃度(1和10μM)下進行試驗。用阿霉素和氯化鈣作為陽性對照。用按照細胞DNA斷裂ELISA試劑盒(Boehringer MannheimBiochemicais，目錄號1585-045)的多孔板DNA斷裂測定法和Hoechst染色測定細胞凋亡。
所有三種形式的DFMO均可以引起細胞凋亡，但在癌細胞系中沒有細胞毒性。在所測定的濃度下，不同形式的DFMO之間沒有總的顯著差異。所有DFMO溶液的細胞凋亡均比阿霉素陽性對照(其是細胞毒性的并且可以引起細胞凋亡)明顯。
實施例7DFMO對映體在MCF-7人乳腺癌異種移植模型中的體內評估在裸鼠中植入雌激素依賴型的人乳腺腫瘤細胞系MCF-7(ATCC#HTB22)。以0.5％w/v溶液的形式在動物的飲用水中隨意給藥D-、L-或D，L-DFMO，每組8只動物。另一組的8只動物給藥3.0％溶液形式的D，L-DFMO。實驗在第90天(當對照腫瘤達到400mg時)停止實驗。每周對小鼠稱重兩次并且每周兩次通過卡尺測量腫瘤，從DFMO給藥時開始(第1天)。將腫瘤測量值通過公式L2×W/2轉換成mg腫瘤重量。
對于接受D，L-DFMO的組，7/8的動物平均部分腫瘤縮小了60.4％，在第8只動物中，腫瘤生長的抑制為99.2％。對于接受L-DFMO的組，7/8的動物平均部分腫瘤縮小了50.0％，在第8只動物中，腫瘤生長的抑制為5.5％。對于接受D-DFMO的組，4/8的動物平均部分腫瘤縮小了62.6％，2/8的動物的腫瘤生長抑制為84.7％，其余兩只動物中毒死亡。將各組的平均結果與對照(包括3.0％D，L-DFMO組)進行比較，如圖11中所示。在這些組中觀察到的抗腫瘤活性的差異不能認為是顯著性的。
實施例8DFMO對映體對鳥氨酸脫羧酶體外活性的影響用兩種體外系統研究了D-、L-或D，L-DFMO抑制鳥氨酸脫羧酶(ODC)的作用。第一種采用在來自小鼠ODC cDNA的不含細胞的系統中合成的ODC。發現L-DFMO在低抑制劑底物比時是比D-DFMO更有效的ODC抑制劑。在該系統中測得D異構體的效力比L形式低10倍，而外消旋D，L-DFMO的效力介于中間。L-形式似乎以非競爭性的方式起作用(正如對不可逆抑制劑所預期的那樣)，而D-形式似乎以競爭性的方式起作用。
第二種系統著眼于對HCT-116結腸癌衍化的細胞中內源性ODC的抑制。同樣，在減少細胞內的多元胺(ODC活性的終產物)水平上，L-形式比D-形式更有效。所有形式的DFMO均可抑制腐胺(ODC的另一種終產物)水平在檢測限以下。在用D-DFMO處理的細胞中，多元胺水平的恢復比用L-DFMO處理的細胞更為迅速。
實施例9D-、L-和D，L-DFMO對ODC體內抑制作用的比較全身性給藥D-、L-和D，L-DFMO抑制佛波酯誘導的小鼠皮膚內ODC的能力。以100mg給藥(單劑量或分開的劑量)的所有形式的DFMO均完全抑制了ODC活性，每天給藥5mg劑量的所有形式5天的時間幾乎完全抑制了ODC活性，各異構體之間沒有顯著性差異。如圖12所示，單劑量的D-DFMO和L-DFMO顯示劑量依賴型的ODC抑制作用，在兩種異構體之間同樣沒有差異。
實施例10在生物流體中分析D，L-DFMO向大鼠給藥單劑量的D-、L-或D，L-DFMO并隨時測定血漿水平(圖13)。給藥400mg/kg D，L-DFMO的大鼠在給藥后1至2小時之間達到109μg/ml的最大血漿水平。接受200mg/kg D-DFMO或L-DFMO的大鼠在相同的時程內分別達到102μg/ml和45μg/ml的血漿水平。對L-DFMO觀察到的低的血液水平可能是由于該形式的生物利用度較低、排泄更迅速或更迅速地與組織或蛋白結合所引起的。
根據本文所公開的內容，所公開和要求保護的所有組合物和/或方法均不用過多的實驗就可以制備和實施。雖然以優選實施方案的方式對本發明的組合物和方法進行了描述，但本領域技術人員可以理解，可以對組合物和/或方法在本文所述方法的步驟或步驟的順序上進行改變而不超出本發明的概念、實質和范圍。更具體地講，可以用某些在化學和生理學上相關的物質代替本文中所描述的物質而達到相同或類似的結果。所有這些對于本領域技術人員顯而易見的類似的替換和改變均被認為是在所附權利要求所定義的本發明的實質、范圍和概念之內。
參考文獻以下參考文獻具體地引入本文作為參考，以提供示例性的方法或對以上所列內容的詳細補充。
Bachrach，“天然多元胺的功能”，Academic Press，1973。
Bussey，“家族性腺瘤性息肉病病的歷史發展”，Lemuel Herrera(編)，Familial Adenomatous Polyposis，1-22頁，Alan R.Liss.Inc.New York，1990。
Canellakis，Viceps-Madore，Kyriakidis，Helier，“鳥氨酸脫羧酶和多元胺的調節和功能”，Current Topics in CellularRegulation，Academic Press，15155-202，1979。
Croghan，Aickin，Meyskens，“劑量相關的α-二氟甲基鳥氨酸耳毒性”，Am.J.Clin.Oncol.，14(4)331-335，1991。
Danzin，Ducep，Schirlin，Wagner，“在自殺性抑制鳥氨酸脫羧酶中缺乏立體特異性”，Biochemistry of Vitamin B6，333-336，1987。
Giardiello，Hamilton，Hylind，Yang Tamez，Casero，“家族性腺瘤性息肉病病中的鳥氨酸脫羧酶和多元胺”，Cancer Res.，(57)199-201，1997。
Kingsnorth，King，Diekema，McCann，Ross，Malt，“用2-二氟甲基鳥氨酸抑制鳥氨酸脫羧酶降低二甲基肼誘導的小鼠結腸腫瘤的發病率”，Cancer Res.，(43)2545-2549，1983。
Lipkin，“用于研究化學保護劑的新的嚙齒動物模型”，J CellBiochem Suppl(28-29)144-7，1997。
Lowy，Willumsen，“ras的功能和調節”，Annu Rev Biochem(62)851-91，1993。
Luc和Baylin，“通過抑制多元胺的生物合成在大鼠中抑制空腸切除術后的腸表皮DNA合成和適應性增生”，J Clin Invest，74698-704，1984。
Marks，Mattox，Casero，“DFMO對內耳多元胺代謝的影響”，Hear.Res.，53(2)230-236，1991。
Messing，Verma，Storer，Sansiman，Bram，“正常和惡性尿道上皮中的鳥氨酸脫羧酶(ODC)活性-預防和治療膀胱癌(BC)的暗示”，Proc.Amer.Urological Assoc.，153，Supplement 523A，文摘號1177，1995。
Meyskens，Jr.和Gerner，“開發二氟甲基鳥氨酸作為治療結腸癌的化學保護劑”，J.Cell.Bio.，22126-131，1995。
Meyskens，Jr.，Emerson，Pelot，Meshkinpour，Shassetz，Einsphar，Alberts，Gerner，“在結腸息肉病患者中的α-二氟甲基鳥氨酸的劑量逐步降低的化學保護試驗”，J.Natl.Cancer Inst.，86(15)1122-1130，1994。
Oka，Perry，Takemoto，Sakai，Terada，Inoue，“多元胺在激素誘導乳腺發育中的多重調節作用”，Advances Polyamine Research，3309-320，1981Pasic，Heisey，Love，“α-二氟甲基鳥氨酸耳毒性化學保護臨床試驗結果”，Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.，123(12)1281-1286，1997。
Pegg，“真核生物中多元胺生物化學的新進展”，Biochem，J.234，249-262，1986。
Pegg和McCann，“多元胺代謝和功能”，Am.J.Physiol.，243212-221，1982。
Salzer，Wattox，Brownell，“在用α-二氟甲基鳥氨酸(DFMO)治療的豚鼠中的耳蝸損傷和閾值增加”，Hear，Res.，46101-112，1990。
Schweitzer，Casseday，Sjoerdsma，McCann，Bartolome，“大鼠耳蝸中多元胺的鑒定及其在聽力中的潛在作用”，Brain ResearchBulletin，16215-218，1986。
Su，Kinzler，Vogelstein，Preisinger，Moser，Luongo，Gould，Dove，“由鼠科動物同族體APC基因突變引起的多發性腸腫瘤”，Science(256)668-670，1992。
Tempero，Nishioka，Knott，Zetterman，“在用致癌物處理過程中和處理后二氟甲基鳥氨酸對小鼠結腸腫瘤的化學保護作用”，Cancer Res.，(49)5793-5797，1989。
Thet，Parra，Shelburne，“氧引起的成年大鼠肺損傷的修復鳥氨酸脫羧酶和多元胺的作用”，Am.Rev.Respir.Dis.，129，174-181，1984。
Wagner，Gaget，Heintzelmann，Wolf，“通過高效液相色譜用手性洗脫劑以及通過氣相色譜在Chirasil-Val上拆分各種α-取代的鳥氨酸和賴氨酸類似物的對映體”，Anal Biochem，164(1)102-16，1987。
Williams-Ashman和Canellakis，“哺乳動物生物學和醫學中的多元胺”，Prespective Biol.Med.，22421-453，1979。
權利要求
1.在患者中預防和/或治療癌癥的方法，該方法包括向所述患者施用有效量的明顯富集的二氟甲基鳥氨酸的D對映體(D-DFMO)或其類似物。
2.權利要求1所述的方法，其中的D-DFMO或其類似物以大約0.05至約20.0gm/M2/天的劑量給藥。
3.權利要求2所述的方法，其中的D-DFMO或其類似物以大約0.1至約2.0gm/M2/天的劑量給藥。
4.權利要求1所述的方法，其中所治療的癌癥選自膀胱癌、結腸癌、乳腺癌、胰腺癌、腦癌、肺癌、胃癌、血癌、皮膚癌、睪丸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、食管癌及其各種組合。
5.權利要求1所述的方法，其中的癌癥是結腸癌。
6.權利要求5所述的方法，其中的結腸癌是家族性腺瘤性息肉病。
7.權利要求1所述的方法，其中的癌癥是膀胱癌。
8.權利要求7所述的方法，其中的膀胱癌是表淺型膀胱癌。
9.權利要求1所述的方法，其中所述的預防和/或治療癌癥是通過選自下列的機制來完成的誘導細胞凋亡、抑制細胞分化、抑制轉移的可能性、減少腫瘤負荷、增加對化療或放療的敏感性、殺死癌細胞、抑制癌細胞的生長、誘導腫瘤消退及其各種組合。
10.權利要求1所述的方法，其中D-DFMO或其類似物至少給藥兩次。
11.權利要求1所述的方法，還包括切除實體瘤。
12.權利要求11所述的方法，其中，將D-DFMO或其類似物在所述的切除術前給藥。
13.權利要求11所述的方法，其中，將DFMO或其類似物在所述的切除術后給藥。
14.權利要求1所述的方法，其中的給藥途徑選自口服、靜脈內、肌肉內、腫瘤內、腹膜內、真皮內、真皮、鼻、直腸、陰道、局部、頰部和淋巴內給藥。
15.權利要求1所述的方法，其中，將DFMO或其類似物直接向腫瘤內給藥。
16.權利要求1所述的方法，其中，將D-DFMO或其類似物全身性給藥。
17.權利要求1所述的方法，其中，將D-DFMO或其類似物向腫瘤的區域性脈管系統內給藥。
18.權利要求1所述的方法，其中，將D-DFMO或其類似物向腫瘤的區域淋巴系統內給藥。
19.權利要求1所述的方法，其中，將D-DFMO或其類似物口服給藥。
20.權利要求1所述的方法，其中的D對映體占所施用的二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少60％。
21.權利要求1所述的方法，其中的D對映體占所施用的二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少70％。
22.權利要求1所述的方法，其中的D對映體占所施用的二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少80％。
23.權利要求1所述的方法，其中的D對映體占所施用的二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少90％。
24.權利要求1所述的方法，其中的D對映體占所施用的二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少95％。
25.權利要求1所述的方法，其中的D對映體占所施用的二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少97.5％。
26.權利要求1所述的方法，其中的D對映體占所施用的二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少99％。
27.權利要求1所述的方法，其中的D對映體占所施用的二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少99.5％。
28.藥物組合物，含有明顯富集的二氟甲基鳥氨酸的D對映體(D-DFMO)或其類似物以及可藥用載體。
29.權利要求28所述的藥物組合物，其配制成用于向患者給藥的單位劑量。
30.權利要求28所述的藥物組合物，其配制成選自下列的劑型快速釋放、定時釋放、延遲釋放、持續釋放、口服混懸液、片劑、膠囊、散劑、錠劑、栓劑、脂質體、納米顆粒、吸入劑、鼻用溶液、眼用溶液、耳用溶液、沖洗液、靜脈內混合物、表皮或經皮溶液、口含片、糖漿、霜劑、軟膏、洗劑、凝膠、乳劑、酏劑、灌洗液、灌腸劑、含漱劑、植入劑和氣霧劑。
31.權利要求28所述的藥物組合物，其中的D對映體占全部二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少60％。
32.權利要求28所述的藥物組合物，其中的D對映體占全部二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少70％。
33.權利要求28所述的藥物組合物，其中的D對映體占全部二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少80％。
34.權利要求28所述的藥物組合物，其中的D對映體占全部二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少90％。
35.權利要求28所述的藥物組合物，其中的D對映體占全部二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少95％。
36.權利要求28所述的藥物組合物，其中的D對映體占全部二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少97.5％。
37.權利要求28所述的藥物組合物，其中的D對映體占全部二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少99％。
38.權利要求28所述的藥物組合物，其中的D對映體占全部二氟甲基鳥氨酸或其類似物重量的至少99.5％。
全文摘要
本發明涉及在患者中預防和/或治療癌癥的方法，該方法包括向患者施用有效量的明顯富集的二氟甲基鳥氨酸的D對映體(D－DFMO)或D－DFMO的類似物。將D－DFMO或其類似物以大約0.05至約20.0gm/m
文檔編號A61K9/20GK1447686SQ01809107
公開日2003年10月8日 申請日期2001年3月7日 優先權日2000年3月7日
發明者C·萊文森, Z·沙克德 申請人:伊萊克斯腫瘤學公司