專利名稱：生物材料消毒方法
技術領域：
本發明涉及對生物材料進行消毒以減少其中的活性生物污染物，如病毒、細菌、酵母菌、霉菌、支原體和/或寄生蟲含量的方法。
背景技術：
一些備制用于人體、獸體或實驗用途的血液制品中可能含有不希望或具有潛在危險性的污染物，如病毒、細菌、酵母菌、霉菌、支原體和寄生蟲。因此，在使用制品之前將制品中含有的所有生物活性污染物進行去活化處理至關重要，特別是當制品在輸血、器官移植和其他形式的人體治療中直接施行于人體時尤其如此，并且對于在含有各種類型的原生質的介質中培育的，并可能含有支原體或其他病毒污染物的各種生物技術制品來說，去活化處理也尤其重要。
過去，人們采取的最多的方法是從制品中篩選或檢測出某種特定的污染物，而不是將制品中的污染物去除或去活化。污染物檢測呈陽性的制品不再被使用。例如，篩選步驟可包括從捐血者的血液中檢測某種特定的病毒。然而，這些步驟并不總是可靠，因為其無法檢測出數量很小的病毒。由于可導致虛假的陽性結果，檢測的價值或可靠性打了折扣。虛假陽性結果在某些情況下可危及生命，比如可能導致感染獲得性免疫缺損綜合癥(艾滋病)。此外，在某些情況下，需要幾周，甚至幾個月來判斷制品中是否含有污染物。
較新的方法旨在去除或去活化制品中的污染物。這些方法包括熱處理，過濾和向制品中添加化學去活化劑或敏化劑。熱處理要求將制品加熱到約60℃，并保持70小時，但這可能會對敏感制品造成破壞。熱去活化可破壞制品中多達50％的生物活動。過濾是指對制品進行過濾，用物理方法去除污染物。遺憾的是，這種方法會將分子重量較大的制品一并去除，并且，在某些情況下，由于制品的分子結構較大，較小的病毒無法通過過濾方法去除。化學敏化步驟是指在制品中添加有毒試劑，使其與病毒的脫氧核糖核酸(DNA)/核糖核酸(RNA)結合，并通過紫外線(UV)或離子輻射進行活化，產生自由基，突破病毒DNA/RNA主鏈中的化學鍵，或者將其復雜化，使病毒無法復制。由于敏化劑有毒，甚至可誘變或致癌，不能直接施行于人體，因此該步驟要求將未結合的敏化劑從細胞制品中洗出。
另一種對制品進行消毒的方法是用伽馬射線進行照射。在進行大劑量照射時，伽馬輻射可有效地破壞病毒和細菌。(參看基斯利，Keasly等，《照射之后生命是否存在？》“Is There Life AfterIrradiation？第二部分，《生物制藥》(BioPharm)1993年7-8月，和萊特曼，Leitman，《血液細胞照射在防止輸血后的移植體抗宿主疾病中的應用》“Use of Blood Cell Irradiation in the Prevention ofPost Transfusion Graft-vs-Host Disease”，《輸血科學》(Transfusion Science)10219-239(1989))。然而，本領域公開發表的論文同時揭示，伽馬輻射可破壞輻射敏感制品，如血液。特別是大劑量的輻射會對紅細胞、血小板和粒細胞造成傷害(萊特曼)。美國第4,620,908號專利案提出，蛋白質制品必須在照射之前進行冷凍，以維持蛋白質制品的存活能力。該專利指出，“如果在環境溫度下對蛋白質材料進行伽馬照射，材料將被完全破壞，即材料的活性將變得極低，實質上不再有效。”然而，如果為了照射目的將生物制品進行冷凍，然后在施行于人體前將其融化，那么許多敏感生物制品，比如血液，將失去生存力和活性。
由于存在上述困難，我們仍需要尋找對生物材料進行消毒的方法，其既能降低活性生物污染物的含量，又不會對生物材料造成反作用。
發明概述因此，本發明的目的是提供既能降低活性生物污染物含量，又能避免對生物造成反作用的生物材料消毒方法。本發明的其他目的、特征和優點將在下文的較佳實施例部分進行詳細闡述，通過本說明書的說明和對本發明的實踐，本發明的目的、特征和優點將更加明顯。本發明的這些目標和優點可通過說明書和權利要求書中所特別指明的組合物和方法實現和獲得。
依照這些和其他目標，本發明的第一實施方案是一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，其包括(i)將生物材料的溶劑殘留量減低到足以有效保護生物材料抵御離子輻射的水平；和(ii)按有效劑量率用射線對生物材料照射一段有效時間，使其得到消毒。
本發明的第二實施方案是一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，其包括(i)向生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護生物材料抵御離子輻射；和(ii)按有效劑量率用射線對生物材料照射一段有效時間，使其得到消毒。
本發明的第三實施方案是一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，其包括(i)將生物材料的溶劑殘留量減低到足以有效保護生物材料抵御離子輻射的水平；(ii)向生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護生物材料抵御離子輻射；和(iii)按有效劑量率用射線對生物材料照射一段有效時間，使其得到消毒。在本實施例中，步驟(i)和(ii)可互相顛倒。


圖1和2顯示某些穩定劑對暴露于45kGy低劑量伽馬照射的凍干的抗胰島素單細胞抗體的保護效果。圖3A-3C顯示某些穩定劑對暴露于45kGy低劑量伽馬照射的凍干的抗胰島素單細胞抗體的保護效果。圖4顯示首次凍干和二次凍干對單細胞抗體敏感性的保護效果。圖5顯示冷凍干燥和/或添加穩定劑對因子VIII(Factor VIII)活性的保護效果。圖6顯示某些穩定劑對暴露于25kGy低劑量伽馬照射的液體或凍干的抗血凝酶III的保護效果。圖7-14顯示某些穩定劑對凍干的抗胰島素單細胞抗體的活性的保護效果。圖15顯示當以高劑量率(30kGy/小時)照射試樣時，穩定劑對凍干的抗胰島素單細胞抗體的活性的保護效果。圖16顯示穩定劑對接受伽馬射線照射的凍干的凝血酶的效果。圖17顯示穩定劑對接受伽馬射線照射后的免疫球蛋白M(IgM)的活性的效果。圖18為色譜圖，顯示伽馬照射對白蛋白的效果。圖19顯示凍干和/或添加穩定劑對接受伽馬射線照射后的凝血酶活性的保護效果。圖20-25顯示某些穩定劑對暴露于45kGy伽馬照射(1.8kGy/小時)的液體免疫球蛋白(IVIG)多細胞抗體的保護效果。圖26顯示pH值對添加穩定劑之后接受照射的尿激酶(液體或凍干)恢復的效果。
具體實施例方式
A.定義除非另外定義，否則本說明書中使用的所有技術和科學術語均與所屬技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本說明中提及的所有的專利案和出版物均以引用方式明確并入本文中。
本說明書中所使用的術語“生物材料”指任何源自或來自活生物體的物質。生物材料包括，但不僅限于以下幾種細胞；組織；血液或血液成分；蛋白質，包括重組蛋白質和轉基因蛋白質；植物制劑；食物材料，等等。生物材料的較佳實例包括，但不僅限于以下幾種韌帶；腱；神經；骨骼，包括去礦質骨基質、骨質移植物、關節、股骨、股骨頭等等；牙齒；皮膚移植片；骨髓，包括全部或已處理的骨髓細胞懸液；心臟瓣膜；軟骨；角膜；動脈和靜脈；可移植器官，如心臟、肺、肝、腎、腸、胰臟、四肢和手、腳趾；類脂；碳水化合物；(天然、無原纖維、可溶性和不溶性)膠原；幾丁質(chitin)及其衍生物，包括幾丁多糖(chitosan)及其衍生物，包括NO-羧基幾丁多糖(NOCC)；干細胞、郎格罕氏島(islet of langerhans)細胞，以及其他移植細胞，包括基因改變的細胞；紅血球；白血球，包括單核細胞和干細胞；以及血小板。
本說明書中所使用的術語“消毒”指依照本發明降低所處理的生物材料中的至少一種生物污染物的含量。
本說明書中所使用的術語“生物污染物”指當與生物材料直接或間接接觸時可對生物材料造成有害作用的污染物。這些生物污染物包括所屬技術領域的技術人員已知的各種病毒、細菌和寄生蟲，通常存在于或感染全血或血液成分等生物材料。生物污染物包括，但不僅限于以下幾種病毒，比如人類免疫缺陷病毒和其他逆病毒、皰疹病毒、副粘病毒、巨細胞病毒、肝炎病毒(包括乙型肝炎和丙型肝炎)、痘病毒、披膜病毒、埃布斯滕巴爾病毒(EbsteinBarr virus)和小病毒；細菌，比如埃希氏桿菌、芽孢桿菌、彎曲菌、鏈球菌和葡萄球菌；寄生蟲，比如錐蟲和瘧原蟲，包括瘧原蟲種；酵母菌、霉菌、支原體；以及蛋白病毒。本說明書中所使用的術語“活性生物污染物”指有能力導致有害作用的生物污染物。
本說明書中所使用的術語“血液成分”指可從全血中分離出來的一種或更多種成分，包括，但不僅限于血液細胞成分，比如紅血球、白血球和血小板；血液蛋白質，比如凝血因子、酶類、白蛋白、血纖維蛋白溶酶原、血纖維蛋白原和免疫球蛋白；以及液體血液成分，比如血漿和含血漿的化合物。
本說明書中所使用的術語“血液細胞成分”指包含細胞，比如紅血球、白血球或血小板的一種或更多種全血成分。
本說明書中所使用的術語“血液蛋白質”指通常存在于全血中的一種或多種蛋白質。存在于哺乳動物(包括人類)體內的血液蛋白質包括，但不僅限于，凝固蛋白質(依賴維生素K蛋白，如因子VII或因子IX，以及不依賴維生素K蛋白，如因子VIII和馮威樂布蘭氏(vonWillebrands)因子、白蛋白、脂蛋白(高密度脂蛋白和/或低密度脂蛋白)、補體蛋白、球蛋白(如免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和IgE)，等等。血液蛋白的較佳群組包括因子I(凝血因子)、因子II(凝血酶原)、因子III(組織因子)、因子IV(鈣)、因子V(促凝血球蛋白原)、因子VI(促凝血球蛋白)、因子VII(前轉變素、血清凝血酶原轉變加速因子)、因子VIII(抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(斯圖爾特因子(Stuart-Prower Factor))、因子XI(血漿凝血活素前質)、因子XII(海格曼因子(Hageman Factor))、因子XIII(Protansglutamidase)，馮威樂布蘭氏因子(vWF)，因子Ia、因子IIa、因子Va、因子VIa、因子VIIa、因子VIIIa、因子IXa、因子Xa和因子XIIIa。
本說明書中所使用的術語“液體血液成分”指全血中的一種或更多種液體、非細胞成分，比如血漿(人類或動物血液凝固前的液體、非細胞部分)或血清(人類或動物血液凝固后的液體、非細胞部分)。
本說明書中所使用的術語“生物相容溶液”(指通過懸浮或溶解等方式含有生物材料，并保持其活性，即保持其基本生物和生化特征的溶液。這些生物相容溶液最好含有有效劑量的至少一種抗凝劑。
本說明書中所使用的術語“生物相容緩沖溶液”指pH值和滲透屬性(如滲透壓、滲透濃度和/或膠體滲透壓)適合于保持生物材料完全性的生物相容溶液。適當的生物相容緩沖溶液的pH值通常在5到8.5之間，并且等滲，或適度低滲或高滲。所屬技術的技術人員了解并可方便地得到生物相容緩沖溶液。
本說明書中所使用的術語“穩定劑”指一種化合物或材料，能夠在當生物材料接受照射的劑量不足，妨礙了該材料的安全和有效使用時減少對生物材料的破壞。穩定劑包括，但不僅限于以下幾種抗氧化劑，如抗壞血酸和生育醇；以及自由基凈化劑，如乙醇。穩定劑的較佳實例包括，但不僅限于以下幾種脂肪酸，包括6，8二巰基辛酸(硫辛酸)及其衍生物和類似物(α、β、二氫化、雙降和四環硫辛酸)、硫辛酸，6，8二巰基辛酸、dihydrolopoate(DL-6，8-二硫辛酸甲酯)、硫辛酰胺、二硫甲酯和四環二硫辛酸、呋喃脂肪酸；油酸、亞油酸和棕櫚酸及其酸鹽和衍生物；類黃酮、苯基丙醇和黃酮醇，如槲皮黃酮、蕓香苷及其衍生物，芹菜素、氨基黃酮、兒茶酚、桔皮苷以及柚苷；胡蘿卜素，包括β胡蘿卜素；C0-Q10；葉黃素；多羥基醇，如丙三醇、甘露醇；糖類，如木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、果糖、海藻糖；氨基酸類，如組氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷氨酸、色氨酸、鈉carpryl N-乙酰氨酸癸酰基鈉和甲硫氨酸；疊氮化物，如疊氮化鈉；酶，如超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫酶；尿酸及其衍生物，如1，3-二甲基尿酸和二甲基硫脲；別嘌呤醇；硫醇類，如谷胱甘肽和巰基丙氨酸；微量元素，如硒；維生素，如維生素A、維生素C(包括其衍生物和鹽類，如抗壞血酸鈉和棕櫚酰抗壞血酸維生素C)和維生素E(及其衍生物和鹽類，如醋酸生育酚和α三烯生育酚)；色原烷醇-α-C6；6羥基2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2羧基酸(Trolox)及其衍生物；外源蛋白質，如凝膠和白蛋白；三-3-甲基-2-苯基-2-吡唑啉-5-1(MCI-186)；西替沃酮；puercelin；柯因；二甲基亞砜(DMSO)；哌嗪二乙磺酸(PIPES)；咪唑；甲氧基補骨脂素(MOPS)；1，2-二噻烷-4，5-二醇；還原物質，如丁羥甲醚(BHA)和丁羥甲苯(BHT)；膽固醇；丙丁酚；吲哚衍生物；水楊乙汞；氨基類固醇衍化物(Lazaroid)和甲磺酸替拉扎特；proanthenols；原花青素；硫酸銨；聚乙烯醇超氧化物歧化酶(PEG-SOD)；N-第三丁基-α-苯基硝酸靈(PBN)；和4-異煙肼-2，2，6，6-四甲基胡椒酸-1-烴氧基(Tempol)。
本說明書中所使用的術語“溶劑殘留量”指生物材料中的自由液體(freely-available liquid)含量。自由液體是指存在于生物材料中，但是不與生物材料中的某種或更多種非液體成分(如蛋白質、金屬離子或鹽類等等)結合或復合的水或有機溶劑(如乙醇、異丙醇、聚乙二醇，等等)液體。自由液體包括細胞內水分。本說明書所引用的溶劑殘留量是指采用經美國食品及藥物管理局(FDA)批準的，經過修正的卡爾-費歇爾法(Karl Fischer method)測定的含量(梅爾(Meyer)和博伊德(Boyd)，《化學分析》(Analytical Chem.)，31，215-219，1959；梅(May)等人，《化學標準化》(Biol.Standardization)，10，249-259，1982；FDA生物制品鑒定和研究中心，備審案件號89D-0140，83-93；1990)。
本說明書中所使用的術語“敏化劑”指一種能夠選擇性地針對病毒、細菌和/或寄生蟲污染物的物質，使其對輻射去活化更加敏感，因而與不添加敏化劑的情況相比，可以采用較低的輻射率和/或較短的照射時間。適當的敏化劑包括，但不僅限于以下幾種補骨脂素及其衍生物和類似物(包括3-碳乙氧基補骨脂素(3-carboethoxy psoralens)；白芷素、凱林(khelins)和含有鹵代物和半水溶物(watersolubilization moiety)的香豆素，如四價銨離子或磷離子；核酸結合化合物；溴化血卟啉；鄰-二苯；羥基茜草素；卟啉(porphorin)；二聚血卟啉酯衍生物的鹵代物或金屬代物、二聚血卟啉衍生物、苯卟啉衍生物、氫化二苯卟啉(hydrodibenzoporphyrin)二順丁烯二酰亞胺、氫化二苯卟啉、二氰化二磺(dicyano disulfone)、四乙酸二苯卟啉，和四乙酸二苯卟啉三丙酸氨基化合物；可用鹵素或金屬原子改良的阿霉素和道諾霉素；紡錘菌素；BD肽、S2肽；S-303(ALE化合物)；染料，如金絲桃素、亞甲基藍、四溴熒光素、熒光素(及其衍生物)，黃素、部花青540；感光化合物，如佛手柑內酯；和SE肽。
本說明書中所使用的術語“蛋白質材料”指至少包括一種蛋白質或肽的細胞材料。該材料最好主要由蛋白質和/或肽組成。其可以是以自然狀態存在，或經過處理/提純和/或衍生作用的天然存在的材料。該材料還可通過化學合成或采用基因重組/轉基因技術進行人工制造。該人工制造的材料同樣可以進行處理/提純和/或衍生。蛋白質材料包括，但不僅限于以下幾種通過組織培養產生的蛋白質/肽；奶(乳制品)；腹水；荷爾蒙；生長因子；醫藥材料，包括從動物組織(如肝磷脂、胰島素)或植物物質中分離或提取的醫藥品；血漿(包括新鮮、冷凍或凍干血漿)；纖維蛋白原、纖維蛋白和/或纖維蛋白密封劑；全血；蛋白質C；蛋白質S；α-1抗胰島素(α-1蛋白酶抑制劑)；丁基膽堿脂酶；抗凝因子，如香豆素藥品(滅鼠靈)；鏈激酶；組織纖溶蛋白激活因子(TPA)；促紅細胞生成素(EPO)；尿激酶；白血球生成素；抗凝血酶-3；α-葡(萄)糖苷酶；(胎兒的)牛血清/馬血清；肉類；免疫球蛋白，包括抗血清、單克隆抗體、多克隆抗體和基因改造或制造的抗體；白蛋白；α球蛋白；β球蛋白；γ球蛋白；可凝固蛋白；補體蛋白質；和干擾素。
本說明書中所使用的術語“離子輻射”指具有足夠能量使被照射生物材料離子化(產生離子)的輻射。離子輻射包括，但不僅限于以下類型(i)粒子輻射(亞原子粒子流，如中子、電子、和/或質子流)；(ii)電磁輻射(從不同的電磁場中產生，如無線電波、可見光和不可見光、X射線和γ射線等)。B.特別優選實施方案本發明的第一優選實施方案為一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，其步驟包括(i)將生物材料中的溶劑殘留量減低到足以有效保護該生物材料抵御離子輻射的水平；以及(ii)按有效劑量率用射線對生物材料照射一段有效時間，使其得到消毒。
本發明的第二實施例是一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，其包括(i)向生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護生物材料抵御離子輻射；和(ii)按有效劑量率用射線對生物材料照射一段有效時間，使其得到消毒。
本發明的第三實施例是一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，其包括(i)將生物材料的溶劑殘留量減低到足以有效保護生物材料抵御離子輻射的水平；(ii)向生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護生物材料抵御離子輻射；和(iii)按有效劑量率用射線對生物材料照射一段有效時間，使其得到消毒。在本實施例中，步驟(i)和(ii)可互相顛倒。
依照本發明的方法進行消毒的生物材料可以是源自或從活或死生物體中獲得的任何材料，包括固體材料或液體材料，或任何固體在任何液體中的懸浮液，或生物或非生物基質上的任何固定或液體涂覆層。
依照本發明的方法，在用離子輻射對生物材料進行照射之前，應降低生物材料的溶劑殘留量。溶劑殘留量應降低到足以保護生物材料抵御離子輻射的水平。溶劑殘留量的適當水平取決于接受照射的特定生物材料的性質和特點，也可由所屬技術領域的技術人員根據經驗確定。當溶劑是水時，溶劑殘留量應低于約2.0％，低于0.5％更好，最好是低于0.2％。
盡管不希望與任何操作性理論結合，但是人們公認降低溶劑殘留量可降低生物材料的自由度，因而保護其抵御電離性輻射的影響。通過將生物材料的溫度降低到其低共熔點或凝固點以下來降低生物材料的自由度可獲得相似結果。這些結果允許采用更高的照射率。
可采用所屬技術領域的技術人員已知的任何方法和技術來降低生物材料中的溶劑殘留量，將溶劑從生物材料中去除。降低生物材料溶劑殘留量的一種特別較佳方法是凍干法。根據本發明的特別優選實施方案，可將生物材料在照射之前儲存在真空或惰性空氣中(惰性氣體較佳，如氦或氬，高分子重量惰性氣體更佳，最好是氬)進行凍干。
本發明中所采用的離子輻射可以是任何能夠將需處理的生物材料中的一種或更多種生物污染物有效去活化的離子輻射。較佳的離子輻射為電磁輻射，特別較佳的離子輻射形式是伽馬輻射。
根據本發明的方法，用離子輻射照射生物材料的劑量率應足以將生物材料的一種或更多種生物污染物有效去活化。適當的照射劑量率取決于離子輻射的特定形式以及被照射的特定生物材料和被去活化的特定生物污染物的性質和特點。適當的照射劑量率也可由所屬技術領域的技術人員根據經驗確定。在消毒程序持續過程中，照射劑量率最好保持不變。
根據本發明的一個特別優選實施方案，照射的劑量率不應超過約3.0Kgy/小時，在約0.1kGy/小時和3.0kGy/小時之間較佳，在約0.25kGy/小時和2.0kGy/小時之間更佳，在約0.5kGy/小時和1.5kGy/小時之間更佳，在約0.5kGy和1.0kGy/小時之間最佳。
根據本發明的另一特別優選實施方案，照射劑量率至少為約3.0kGy/小時，至少為約6kGy/小時較佳，至少為約16kGy/小時更佳，至少為約30kgy/小時最佳。
用離子輻射照射生物材料一段時間，使生物材料中的一種或更多種生物污染物有效地去活化。適當的電離時間取決于離子輻射的特定形式和劑量率，以及被照射的特定生物材料和被去活化的特定生物污染物的性質和特征。適當的電離時間還可由所屬技術領域的技術人員根據經驗確定。
在用離子輻射照射生物材料之前，可選擇向生物材料中添加至少一種有效劑量的敏化劑。適當的敏化劑為所屬技術領域的技術人員已知的敏化劑。
依照本發明的方法，對生物材料進行照射可在任何對需處理的生物材料無害的溫度下進行。根據本發明的一個優選實施方案，在環境溫度下照射生物材料。根據本發明的一個替代優選實施方案，在對比溫度下，最好在生物材料的低共熔點或更低的溫度下照射生物材料。C.實施例以下實施例用來說明，而并非限制本發明。所屬技術領域的技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，當可作各種修正和改進。實施例1 血液消毒本例采用一袋200ml一日型舊濃縮紅血球。細胞中添加了乙醇，以獲得最終乙醇濃度0.01％v/v。采用改良的檸檬酸鹽磷酸鹽葡萄糖(CPD)溶液按1比10的系數稀釋紅血球細胞，CPD溶液的pH值為約6.4到6.7之間，總容積為500ml，并含有以下成分一水檸檬酸 0.2克二水檸檬酸鈉 27.3克單堿式磷酸鈉 2.2克二堿式磷酸鈉 1.0克葡萄糖 3.2克細胞在含有一個鈷60源支架的工業規格伽馬輻照器內接受照射。照射在托架下的一個無防護的盒子里進行。以大約1kGy/小時的劑量率照射細胞24小時。照射階段結束后，通過目測發現紅血球具有活力，呈亮紅色。而由沒有經過上述CPD溶液稀釋的濃縮紅血球所組成的控制試樣在照射后沒有活力。
照射程序結束4天之后，對稀釋細胞中的各種血液成分的含量進行檢測，結果如表一所示。控制試樣與測試試樣來自同一袋血液，但是沒有經過照射。表一說明，對人類血液細胞進行稀釋和照射并不會顯著改變白血球的數量。血小板數量和血細胞含量值比控制試樣略低；然而，這些數值仍在成人血液的正常范圍以內。控制試樣中的血紅蛋白含量高意味著某些紅血球確實已在照射程序中溶解，這一點也可以從紅血球數量減少中得到證明。但是，與先前的論點相反，按照本程序進行的高達50kGy的輻射并沒有破壞血液成分。在經過以1kGy/小時的低劑量率進行的25kGy的伽馬照射之后，細胞數量沒有大量減少，而且具有活力。
表1

實施例2 葡萄糖消毒包含葡萄糖的溶液用于治療碳水化合物和體液缺失，用于治療低血糖，并作為血漿擴張劑用于腎透析，以及用來抵制肝毒素(默克索引，(The Merck Index)第11版，Merck & Co.，Inc.(1989)，和《馬丁代爾大藥典》、(MartindaleThe Extra Pharmacopoeia)p.l 265)。葡萄糖還是母體營養團(parental nutrition regiments)中較佳的碳水化合物來源(默克索引，第11版，(1989)，和《馬丁代爾大藥典》(Martindale’s The Extra Pharmacopoeia)p.l 265)。在以上所有應用中，葡萄糖都必須在使用前進行消毒。對含葡萄糖產品的消毒通常采用加熱消毒或高壓蒸汽滅菌。遺憾的是，據報道這些方法可導致含葡萄糖的溶液退化(degrade)或變成棕色，因而使溶液顏色改變。(《馬丁代爾大藥典》(Martindale’s The Extra Pharmacopoeia)p.l265)據報道，對葡萄糖進行伽馬照射也能分解含葡萄糖溶液(Kawakishi等人，《絕氧條件下輻射引起的D-葡萄糖退化》(“Radiation-Induced Degradation of D-glucose in AnaerobicCondition”)，《農業化學生物》(Agric.Biol.Chem.)1977年6月)因此，需要找到一種能夠避免制品本身產生退化的制品消毒方法。鑒于現有技術中的問題，我們按以下步驟，用本發明的方法來處理葡萄糖溶液。
將5％的葡萄糖溶液以大約1kGy/小時的劑量率照射24小時。照射之后對制品進行檢測，發現與沒有接受照射的控制試樣相比，可見光譜沒有任何改變。因此，該方法能夠用于消毒含葡萄糖的制品。
除了上述實驗以外，我們將5％和50％的新鮮葡萄糖溶液在環境溫度下以25kGy的劑量照射36小時，結果與上述方法相似。此外，紫外光/可見光(UV/VIS)掃描結果說明，完全沒有出現《美國藥典》(USP)中所規定的283.4nm的“糠醛”峰值。相反，采用高壓蒸汽法進行消毒的葡萄糖試樣含有283.4nm的糠醛峰值。“糠醛”為致癌物質。實施例3 人類血清白蛋白消毒采用伽馬輻照裝置Gammacell220(Co60為該裝置中的伽馬射線源)將正常人類血清白蛋白作為25％貧鹽(salt-poor)溶液照射36小時，總照射劑量為25kGy。在照射過程中不控制溫度，但是估計容納白蛋白溶液的容器溫度約為23℃。HPLC分析結果如表二所示。
表2

結果說明，正常人類血清白蛋白可在室溫下安全地接受25kGy的照射(劑量率約為0.7kGy/小時)，并且蛋白質的基本屬性不會受到負面影響。這在以往沒有得到論證。照射血清白蛋白的其他嘗試要求在冷凍階段進行照射，這增加了照射的成本和難度。實施例4將來自健康捐血者的正常人類血液放進肝素化的試管，用標準CPD溶液沖洗三次，然后用含有0.01％v/v乙醇的CPD按1∶20的比例進行稀釋。含有0.01％v/v乙醇的CPD溶液被稱為SCPD。然后將兩毫升試樣放入10毫升塑料試管，并在室溫下以多達26kGy的不同劑量照射36小時以上。照射后沒有產生溶血作用，細胞保持完整，只是有些增大和形狀略微不規則。表三報告了三個不同實驗的結果。
表3

*試驗1和試驗21.紅血球數量細胞×1012/升2.血紅蛋白克/升3.紅細胞容量4.細胞平均體積千萬億分之一升5.血紅蛋白平均重量微微克6.血紅蛋白細胞平均濃度可/升我們可以很容易地將細胞放入懸浮液，在淡緩沖液中進行重組。
以下三個實驗(實施例5、6和7)是為了確定本方法在處理受人類免疫缺陷病毒(HIV)污染的血液時的功效。在各實施例中，細胞處理方式相似。在這些實驗中，在經過12、16和24小時的照射之后將細胞輕輕攪動。此外在第三個實驗(實施例7)中，細胞被放在T25燒瓶中，以增加表面面積和降低因在離心管底部產生沉淀所導致的濃縮作用。在所有情況下，照射細胞的劑量率總是為大約0.7kGy/小時。實施例5 含HIV血液的消毒以下實驗是為了實現下列特定目標1.評估該方法在處理紅血球(RBC)時的毒性。
2.評估該方法的抗逆轉錄活性。
方法首先，從一名HIV-血清反應陽性的捐血者體內抽取2毫升抗凝血血液。將血液離心，去掉血漿。將剩下的細胞球(cell pellet)重新懸浮進10毫升的CPD緩沖液，并離心。該沖洗方法總共進行三遍。將最終的細胞球重新懸浮進40毫升的CPD緩沖液，并按2毫升等份試樣分配到塑料試管，形成16個單獨試樣備用。在其中的8個試管中添加HTLV-IIIB試樣，這是HIV病毒的實驗室菌株，每個需感染的試管中還添加了100個組織培養感染劑量(TCID)。對于其他8個試管，通過添加少量非感染性實驗室緩沖液——磷酸鹽緩沖鹽水來進行“模擬”感染。用該方法處理4個感染的試管和4個未感染的試管。為了進行比較，另外的8個試管(4個受感染，4個未感染)也用類似方式進行處理，但是不經過該程序。
應當指出的是，在研究開始時，我們從捐血者身上抽取了一個單獨的試樣。該試樣在臨床血液學實驗室進行處理，并獲得了完整的血象。對研究試樣重復這些測試，并與這些基準結果進行比較，其中包括評估4個已處理和4個未處理的試樣，所有試樣均未感染HIV。
將每個受感染研究試樣中的0.5毫升等份試樣移植到三天前采集的單核細胞(MC)上。這些細胞已在RMPI培養基中懸浮，并添加了10％牛胎血清和其他添加劑(青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺和HEPES緩沖液)，以及1μg/ml PHA-P。在進行移植的同時，將細胞重新懸浮在rIL-2(20U/ml)淡培養基中。培養過程持續7天，每周兩次采集部分培養基，測量HIVp24抗原含量(工業用酶聯免疫試劑盒(ELISA kit)，Coulter Electronics，Hialeah，FL)以測定病毒生長狀況。
將8個受感染研究試樣的單獨等份試樣用于病毒滴定實驗。我們可以簡單地將連續四重(four-fold)稀釋的含病毒液體(從1∶16到1∶65，536)三重移植入96孔平底組織培養板。在每個孔中添加經PHA刺激(PHA-stimulated)的MC(2ml培養基中有400萬個細胞，包括IL-2)。每周兩次從每個培養孔中采集上層清夜等份試樣，用于測量HIVp24抗原含量。如果一個孔的HIVp24抗原含量值大于30pg/ml，則該孔被記錄為“陽性”。
根據史丕曼-卡伯法(Spearman-Karber method)(參看ACTG，病毒學規程手冊)，我們采用以下公式來計算病毒滴定度M＝xk+d
M滴定度(在log4中)xk最高稀釋劑量d稀釋之間的空間n每次稀釋的孔數r總孔數結果基準試樣，以及已處理和未處理研究試樣的紅血球參數如表4所示。
表4

表4中的縮略語見表3下的解釋。
如上所述，HIV培養基使用已處理和未處理的研究試樣的0.5ml等份試樣建立。表5顯示根據第4天和第7天培養基測定的研究試樣P24抗原含量(pg/ml)。
表5

最后，選擇一個已處理試樣和一個未處理試樣在沒有培養基的情況下進行直接病毒滴定，結果如表6所示。
表6

盡管觀察到一些可再生的巨紅細胞，但是紅血球在該方法中受到的影響微乎其微。盡管在共同培養已處理試樣過程中似乎出現了一些殘留活病毒，但是沒有得到直接滴定實驗的證實。實施例6本實驗的目標是以全面方式評估該方法在處理紅細胞時的毒性。
方法在本實驗中，與第一個實驗一樣，從一名HIV-血清反應陽性的捐血者體內抽取1毫升抗凝血血液。將血液離心，去掉血漿。將剩下的細胞球重新懸浮進10毫升的CPD緩沖液，并離心。該沖洗方法總共進行三遍。將最終的細胞球重新懸浮進20毫升SCPD緩沖液，并按2毫升等份試樣分配到塑料試管，形成10個單獨試樣備用。其中的8個試管按照該方法進行處理，余下兩個試管作為未處理的控制試樣。處理結束之后，將所有試管離心，將形成的細胞球懸浮進100μl緩沖液。再獲得這些重新濃縮的研究試樣的完整血象。
與第一個實驗一樣，在采集研究試樣時，我們從捐血者身上抽取了一個單獨的試樣，并獲得了該基準試樣的完整的血象。當研究試樣重新濃縮到其初始狀態的33-50％時，則可將其與基準試樣進行比我們先前的實驗更直接的比較。
結果基準試樣，以及未處理和已處理研究試樣的紅血球參數如表7所示。表7中的縮略語請參看表3中的定義。
表7

在所有已處理試樣中均出現巨紅細胞，從未處理和已處理試樣中測得可比的血紅蛋白。這些絕對值適合于殘留稀釋。紅血球得以保存。實施例7方法在本實驗中，與第兩個實驗一樣，從同一名HIV-血清反應陽性的捐血者體內抽取5毫升抗凝血血液。將血液離心，去掉血漿。將剩下的細胞球重新懸浮進100毫升CPD緩沖液，并離心。該沖洗方法總共進行三遍。將最終的細胞球重新懸浮進100毫升SCPD緩沖液，并按25毫升等份試樣分配到T25組織培養燒瓶中，形成4個等份試樣備用。其中的兩個燒瓶按照該方法進行處理，余下兩個燒瓶作為未處理的控制試樣。處理結束之后，觀察每個燒瓶的內容并目測細胞吸收氧氣的能力(當暴露于環境空氣時，呈現更亮的紅色)。然后，抽出和離心燒瓶的內容，并將殘留細胞球重新懸浮進少量緩沖液。再獲得這些重新濃縮的研究試樣的完整血象。
與第五和第六個實驗一樣，在采集研究試樣時，我們從捐血者身上抽取了一個單獨的試樣，并獲得了該基準試樣的完整的血象。當研究試樣重新濃縮到其初始狀態的33-50％時，則可將其與基準試樣的一些特定參數進行直接的比較。
結果當目測時，已處理和未處理的研究試樣之間沒有明顯區別。特別來說，懸浮良好的細胞呈均勻分布。當暴露于環境空氣時，所有燒瓶的內容均變成更亮的紅色。沒有特別測定充氧量。
基準試樣，以及未處理和已處理研究試樣的紅血球參數如表8所示。表8中的縮略語請參看表3中的定義。
表8

本實驗設計用來更好地評估即將輸入人體的紅血球的狀態，因此實驗采集的試樣量更大。初步結論為，該方法并未削弱紅血球攜帶氧氣的能力，盡管對此沒有進行正式的測定。有趣的是，在本實驗中，已處理和未處理試樣的細胞大小沒有差別，均大于基準。我們測量了所有研究試樣中的血紅蛋白含量。實施例8在本實驗中，我們對凍干形式的免疫球蛋白G(IgG)進行照射。
方法對IgG進行HPLC分析的結果如表9所示。其結果顯示，在室溫下接受劑量為25kGy，劑量率為大約0.7kGy/小時的照射后，制品沒有受到影響。這一點是首次得到證明。
表9

結果格治利(Gergely)等人采用凍干IgG進行實驗后所提出的結果顯示，在按標準劑量率照射了12kGy到25kGy的劑量之后，部分蛋白質成為不可溶。(格治利，J，等人，《伽馬射線照射后的人類免疫球蛋白G研究》(“Studies of gamma-Ray-Irradiated Human ImmunoglobulinG”)SM-92/12 I.A.E.A.)但是，采用本發明以大約0.7kGy/小時的劑量率進行照射時，沒有蛋白質成為不可溶，這意味著蛋白質的變化和退化很小或根本沒有。此外，格治利等人發現人類IgG的一種液體劑型在照射之后喪失了活性。而采用本方法對液態的靜脈免疫球蛋白(IVIG)的研究顯示，超免疫IVIG中保持了70％以上的一種特定抗體。實施例9在本實驗中，我們對凍干形式的α1蛋白酶抑制劑和凝血因子進行照射。
方法將試樣放進伽馬輻照裝置Gammacell220中，依照本方法進行總劑量為25kGy的照射。然后試樣返回實驗室進行分析。劑量率為0.72kGy/小時。
結果已處理和控制α1蛋白酶抑制劑均為一個標準的正常合并(pooled)血漿試樣的40％。在化驗中采用孟氏放射免疫擴散技術(Mancini radical immunodiffusion technique)。
將當前討論的凝血因子化合物小試管在10ml的水中重組，將硫酸魚精蛋白小試管在10ml中重組。在試樣中添加濃縮度為10mg/ml的硫酸魚精蛋白。在全部三次備制中都立刻產生了單體。實施例10在本實驗中，我們對凍干形式的因子VII、VII和IV進行照射。
方法將試樣放進伽馬輻照裝置Gammacell220中，按大約1kGy/小時的劑量率進行總劑量不定的照射。
結果因子VII在接受20kGy的照射后保持67％的活性，在10kGy照射后保持75％的活性。因子VIII在接受20kGy的照射后保持77％的活性，在10kGy照射后保持88％的活性。同樣，因子IV在接受20kGy的照射后保持70％的活性，在10kGy照射后保持80％的活性。
三種因子的結果都十分優異。據我們所知，以往沒有人能夠在環境溫度下進行如此大劑量的照射之后還能獲得因子活性損失如此之小的結果。這與Kitchen等人的實驗結果形成鮮明對比，Kitchen等人在《伽馬照射對人類免疫缺陷病毒和人類凝固蛋白質的效果》(“Effectof Gamma Irradiation on Human Immunodeficiency Virus and humanCoagulation Proterins”一文中提出“對凍干濃縮物進行照射的程序是不可行的”。同樣，Hiemstra等人在《通過伽馬照射將人類免疫缺陷病毒去活化及其對血漿和凝固因子的影響》(“Inactivation ofHuman Immunodeficiency Virus by Gamma Radiation and Its Effecton Plasma and Coagulation Factors”)，《輸血》(Transfusion)3132-29(1991)一文中也指出“伽馬照射不可能成為血漿和血漿衍生制品的消毒方法，因為在血漿成分的生物活性能夠恢復的輻射劑量下，病毒的傳染性并不能得到有效降低。”實施例11
在本實驗中，我們按照0.5kGy/小時的劑量率對紅血球進行7.5到90分鐘的照射，以去除細菌污染物。
方法從健康的捐血者的EDTA中提取紅血球，用CPD溶液清洗三遍，并重新懸浮進DPC中，根據初始血液體積，按1∶20的比例進行稀釋。然后將細胞懸浮液分裝進14個試管。向其中的7個試管中添加大約1.0×104的表皮葡萄球菌(Straphylococcus epidermidia)。將細胞放在冰上并運送到照射裝置。將所有的試樣置于環境溫度下的輻照箱中，以0.5kGy/小時的劑量率進行照射，總劑量分別為0.625、0.125、0.250、0.375、0.500和0.750kGy。在各時間點移開并攪動試樣，然后將其放在冰上，運送到微生物實驗室或血液學實驗室進行分析。
結果表10為微生物化驗結果。
表10

因此，0.75kGy的劑量使細菌存活量減少4.5log10這是一個重要的血液安全系數。此外，D10值約為0.125kGy，與其他文獻中報道的葡萄球菌相似物質的各項數值相吻合(B.A.Bridges，《N-乙基馬來酰胺對細菌的放射敏感度的影響》(“The Effect of N-Ethylmaleimideon the Radiation Sensiviity of Bacteria”)J.Cen.Microbiol.26467-472(1962)，和Jacobs，G.P.和Sadeh，N.《羥基苯甲酸所導致的金黃色葡萄球菌放射敏化作用》(Radiosensitization ofStaphyloccocus Aureus by p-Hydroxybenzoic Acid”)Int.J.Radiat.Biol.41351-356(1982)。
為了說明紅血球在照射方法之后仍然具有活力，我們測定了細胞的以下參數白血球(WBC)、中性白細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜曙紅細胞和嗜堿細胞。這些參數僅計算細胞數量。當然，所有有核細胞可通過實施輻射劑量進行去活化。表11列舉了我們監測的其他的紅血球參數。即使經過了0.75kGy的輻射劑量，正鐵血紅蛋白值仍然保持不變，與控制試樣相同。該實驗說明，可以采用本方法在室溫下對紅血球進行劑量為0.75kGy的安全照射，而細胞功能不受損失。實施例12本實驗采用實施例11的方法進行，目的是證實實施例11的發現，并詳細闡述測量的某些參數。本實驗的結果參看表12。
結果(見以下表12)這些結果證實了先前的結果，并且意味著紅血球可接受足夠劑量的輻射，使細菌數量減少4.5log10。
可以預料，未來對血小板的實驗也將得到類似的結果。因此，無需，或只需進行很少的額外操作，并且無需添加外來物質就可利用本方法處理紅血球，并提供在細菌學上安全的制品，進而降低接受輻射的物質發生不良反應的風險。
表11接受一定輻射劑量照射后的紅血球功能值


表12接受一定輻射劑量照射后的紅血球功能值

nd＝未測出高鐵血紅蛋白含量誤差為±2％；在p50情況下為±4％(置信度95％)實施例13在本實驗中，我們通過將凍干抗胰島素單細胞抗體暴露于45kGy的低劑量伽馬輻射來評估某些穩定劑的保護效果。測試的穩定劑為抗壞血酸鈉、蛋氨酸和硫辛酸。
方法在2ml玻璃小試管中，將總容積為0.5ml，含有50μg抗胰島素單細胞抗體、5mg牛血清白蛋白(1％)和無穩定劑或50mM穩定劑的試樣凍干。在真空狀態中將試樣塞緊。用伽馬射線照射試樣(總劑量45kGy，劑量率1.83kGy/小時，溫度4℃)，然后用水重組。
用標準ELISA規程測定獨立副樣的抗體結合活性96孔微滴定板，用2.5μg/ml的胰島素抗原覆蓋一夜。采用從5μg/ml開始的抗胰島素單細胞抗體試樣的三重連續稀釋液。使用50ng/ml的與磷酸酶共軛的山羊抗小鼠Ig。在DEA緩沖液中使用1mg/ml的∑104堿性磷酸酶基質。通過405-620nm的吸收率測定結合活性。
通過估算接受照射的試樣的滴定曲線相對于未接受照射試樣的位移(即觀察到同樣結合量所需的抗體濃縮)來測定相對保護作用，未接受照射試樣處于未接受照射試樣的最大吸收率標志的約50％處。
結果不含穩定劑的凍干試樣在經受45kGy的伽馬照射后保持50％的抗體活動性。這一結果與先前45kGy伽馬照射幾乎破壞了在溶液中接受照射的免疫球蛋白的全部活性的結果形成了對照。因此，顯而易見，通過凍干減少殘留水分可非常有效地保護蛋白質。
添加抗壞血酸鈉使試樣在接受照射之后能夠完全恢復其活性。經過與未接受照射的試樣相比可以發現，蛋氨酸和硫辛酸也能充分恢復活性(76-83％)。實驗結果如圖1和2所示。實施例14在本實驗中，我們通過將凍干抗胰島素單細胞抗體暴露于45kGy的低劑量伽馬輻射來評估某些穩定劑的保護效果。測試的穩定劑為抗壞血酸鈉、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽以及尿酸/trolox混合物和抗壞血酸/尿酸/trolox混合物。
方法在3ml玻璃小試管中，將總容積為1.0ml，含有100μg抗胰島素單細胞抗體、10mg牛血清白蛋白(1％)和無穩定劑或穩定劑的試樣凍干。在真空狀態中將試樣塞緊。用伽馬射線照射試樣(總劑量45kGy，劑量率1.83kGy/小時，溫度4℃)，然后用1.0ml水重組。
用標準ELISA規程測定獨立副樣的抗體結合活性96孔Maxisorb滴定板，用2.5μg/ml的胰島素抗原覆蓋一夜。采用從5μg/ml開始的抗胰島素單細胞抗體試樣的三重連續稀釋液。使用50ng/ml的與磷酸酶共軛的山羊抗小鼠Ig。通過405-620nm的吸收率測定結合活性。
采用平行線分析軟件包(PLA 1.2，Stegmann Systemberatung)測定相對保護作用。
結果不含穩定劑的凍干試樣在經受45kGy的伽馬照射后保持70％的抗體活動性。這一結果不同于先前45kGy伽馬照射幾乎破壞了在溶液中接受照射的免疫球蛋白的全部活性的結果。因此，顯而易見，通過凍干減少殘留水分可非常有效地保護蛋白質。
添加抗壞血酸鈉使試樣在接受照射之后使活性增加恢復20％，即照射之后，活動性恢復90％。其他穩定劑恢復活性77-84％。實驗結果如圖3A-3C所示。實施例15在本實驗中，我們測定首次凍干(制品中仍留有相對“高水分”)和二次凍干(使制品只含“低水分”)對單細胞抗體敏感度的效果。
方法在3ml玻璃小試管中，將總容積為1.0ml，含有100μg抗胰島素單細胞抗體(mAb)、10mg牛血清白蛋白(1％)和無穩定劑或100mM穩定劑的試樣凍干。在真空狀態中將試樣塞緊。用伽馬射線照射試樣(總劑量45kGy，劑量率2.03到2.13kGy/小時之間，溫度4℃)，然后用1.0ml水重組。
用標準ELISA規程測定獨立副樣的抗體結合活性Maxisorb滴定板，用2.5μg/ml的胰島素抗原覆蓋一夜。采用從5μg/ml開始的抗胰島素單細胞抗體試樣的三重連續稀釋液。使用50ng/ml的與磷酸酶共軛的山羊抗小鼠Ig。通過405-620nm的吸收率測定結合活性。
結果不添加穩定劑時，已經經過二次“低水分”干燥期的抗胰島素mAb在照射之后的恢復度更好，即在不添加穩定劑的情況下，較低的總水分含量可改善恢復度。
然而，在添加穩定劑時，抗體在經過45kGy照射后具有非常好的恢復度，無論是僅經過首次“高水分”干燥期的試樣還是經過了二次“低水分”干燥期的試樣。
本實驗的結果如圖4所示。實施例16在本實驗中，我們測定凍干和/或添加穩定劑對因子VIII活性的保護效果。測試的穩定劑為抗壞血酸鈉、尿酸鈉、trolox、抗壞血酸/trolox混合物、抗壞血酸/尿酸/trolox混合物、尿酸/trolox混合物、抗壞血酸/尿酸混合物。
方法在真空狀態中將試樣凍干并塞緊。用伽馬射線照射試樣(總劑量45kGy，劑量率1.9kGy/小時，溫度4℃)，然后用水重組。試樣中因子VIII活性可利用MLA Electra 1400C自動凝固分析儀進行單級凝結化驗來測算。
結果在不添加穩定劑時，凍干試樣在照射之后，因子VIII恢復良好(未照射的控制試樣的69-88％)。在添加穩定劑時，照射后的因子VIII的恢復度與不添加穩定劑時相似(未照射的控制試樣的69-89％)。
但是，穩定劑與凍干結合可以使因子VIII恢復到未照射的控制試樣的83-90％(抗壞血酸鈉+凍干恢復度90％；trolox+凍干恢復度84％；尿酸鈉+凍干恢復度83％)。本實驗結果如圖5所示。實施例17在本實驗中，我們通過將液體或凍干抗凝血酶III(ATIII)暴露于25kGy的低劑量伽馬輻射來評估某些穩定劑的保護效果。測試的穩定劑為抗壞血酸鈉(200Mm)。
方法單獨照射ATIII，或添加抗壞血酸作為穩定劑。可通過以下步驟與穩定劑混合(i)將ATIII與穩定劑混合成液體，然后凍干混合液，并在真空狀態下塞緊；或(ii)在當ATIII和穩定劑均為干燥粉末時將兩者混合(即各自事先分別凍干)。
照射(總劑量25kGy，劑量率1.8kGy/小時)之后，用水將凍干抗凝血酶III粉末(∑A9141，批號113H9316)+抗壞血酸重組為40U/ml的濃縮液。照射之后，將液體和重組的干ATIII粉末試樣(+抗壞血酸)在水中稀釋到20U/ml。備制凝血酶(1U/ml)和肝素(800U/ml)水溶液。
在預先冷凍的96孔板化驗中，備制ATIII試樣的雙重連續稀釋液。在每個孔中添加肝素(25μl 800U/ml溶液)或水，然后在37℃的溫度下保溫培育。添加凝血酶(50μl 1U/ml溶液)，再在37℃的溫度下保溫培育。
然后添加100μl水中的1600μM凝血酶基質(基質的最終濃縮液為800μM)，隨后在環境溫度下保溫培育。我們通過在添加基質后的固定時間測量405-620nm之間的吸收率來測定活性。
結果當接受25kGy的低計量率伽馬照射時，在不添加穩定劑的情況下，液體ATIII喪失了所有凝血酶抑制活性。但是，在添加抗壞血酸鈉的情況下，液體ATIII在照射之后保持了55-66％的活性。
當接受25kGy的低計量率伽馬照射時，在添加干粉末穩定劑的情況下，干粉末ATIII盡喪失43％的活性。
本實驗的結果如圖6所示。實施例18在本實驗中，我們某些穩定劑對凍干抗胰島素單細胞抗體的活性的保護效果。測試的穩定劑為抗壞血酸鈉、trolox/抗壞血酸/尿酸混合物、N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽。
方法凍干，并在真空狀態下塞緊添加了1％人類血清白蛋白(以及5％蔗糖，可選)的抗胰島素單細胞抗體，然后照射試樣(總劑量45kGy，劑量率1.83到1.88kGy/小時之間)采用上述的標準ELISA規程測定抗體結合活性。
結果以45kGy的劑量照射添加了1％HSA的抗胰島素單細胞抗體導致其活動性平均損失約33％。添加下列穩定劑可明顯改善恢復度20mM抗壞血酸鈉(恢復度100％)；200μM trolox/1.5mM尿酸/20mM抗壞血酸(恢復度87％)；20mM N-乙酰基-半胱氨酸(恢復度82％)以及20mM谷胱甘肽(恢復度76％)。
以45kGy的劑量照射添加了1％蔗糖的含有1％HSA的抗胰島素單細胞抗體導致其活動性平均損失約30％。添加下列穩定劑可明顯改善恢復度20mM抗壞血酸鈉(恢復度88％)；200μM trolox/1.5mM尿酸/20mM抗壞血酸(恢復度84％)；20mM N-乙酰基-半胱氨酸(恢復度72％)以及20mM谷胱甘肽(恢復度69％)。
這些實驗的結果如圖7-14所示。實施例19在本實驗中，我們測定當試樣經受高劑量率(30kGy/小時)照射時，穩定劑(抗壞血酸)對凍干抗胰島素單細胞抗體的活性的保護效果。
方法凍干抗胰島素單細胞抗體，并以的30kGy/小時的劑量率對其進行照射(總劑量45kGy)。采用上述的標準ELISA規程測定抗體結合活性。
結果以45kGy的劑量照射凍干抗胰島素單細胞抗體導致其活動性平均損失約32％。添加20mM抗壞血酸鈉可將活性恢復到未照射試樣的85％。本實驗的結果如圖15所示。實施例20在本實驗中，我們對添加穩定劑的凍干凝血酶進行照射。
方法在環境溫度下對低劑量率試樣進行伽馬照射，劑量率0.326kGy/小時，總劑量45kGy。在環境溫度下對高劑量率試樣進行伽馬照射，劑量率30kGy/小時，總劑量45kGy。
照射結束之后，用500μl 50％甘油溶液重組所有樣品，形成100U/ml的濃縮液，然后將其稀釋到0.5U/ml。隨后再使用SAR-Pro-Arg-PNA基質，根據標準呈色化驗測定凝血酶的活性。
通過Sigma Plot2000程序，將單一矩形雙曲線符合度公式(singular rectangular hyperbolic fit equation)用于每組平均數據來測定凝血酶Vmax和Km值。還可通過在MLA1400C分析儀上進行凝結時間化驗來測定凝血酶活性。
結果計算出的在環境溫度下接受30kGy/小時照射的凝血酶的Vmax值為0.216，未照射的控制試樣的Vmax值是0.287，這意味著凝血酶活性恢復度為77％。
計算出的在環境溫度下接受0.326kGy/小時照射的凝血酶的Vmax值為0.189，未照射的控制試樣的Vmax值是0.264，這意味著凝血酶活性恢復度為72％。對低劑量試樣進行的凝結時間化驗顯示，其相對功效(relative potency)是未照射的控制試樣的74％。
本實驗的結果如圖16所示。實施例21在本實驗中，我們以低劑量率照射添加或不添加穩定劑的特別用于鼠IgG3的IgM單細胞抗體。
方法照射液體抗鼠IgG3單細胞IgM抗體(在含10mM疊氮化鈉的PBS緩沖液中；抗體濃度為666μg/μl)，劑量率1.8kGy/小時，總劑量為10kGy或45kGy。試樣不含穩定劑，或者含有包括20mM檸檬酸、300μM尿酸和200mM抗壞血酸的穩定劑混合物。
使用鼠IgG3作為覆蓋抗原，以及與磷酸酶共軛的抗白鼠IgM檢驗抗體，根據標準ELISA規程分析抗體活性。
結果在接受總劑量為10kGy或45kGy的伽馬照射后，不含穩定劑的液體試樣喪失了所有功能性抗體活性。但是，如果添加穩定劑混合物，接受10kGy伽馬照射后，活性可完全恢復，接受45kGy伽馬照射后，活性恢復88％。本實驗的結果圖17所示。實施例22在本實驗中，我們對凍干或液體白蛋白試樣進行伽馬照射。
方法對試樣進行照射的總劑量為10kGy或40kGy。照射之后，用1.1ml化驗緩沖液(50mMTris，Ph8.8；50mM NaCl；0.1％PEG8000)重組凍干試樣。
使用280nmUV檢驗系統裝置，根據尺寸排除柱(size-exclusioncolumn)色譜法(TSKgel G4000SW×l 30m×7.8mm；洗脫緩沖液0.1M磷酸鈉pH6.5/0.1M硫酸鈉；流率1ml/分鐘)分析(凍干和液體)試樣。
結果在進行總劑量為10kGy的伽馬照射后，從液體或凍干白蛋白試樣中觀察不到退化制品。盡管在進行總劑量為40kGy的伽馬照射后，從液體白蛋白試樣中觀察到一些退化制品，但是在接受了總劑量為40kGy的伽馬照射后的凍干試樣中沒有觀察到這一現象。本實驗的色譜分析結果如圖18所示。實施例23本實驗測定蛋白病毒(可傳播海綿狀腦病物質)對低劑量率離子輻射的敏感度。
方法在一個50ml聚丙烯試管中，將0.3ml含有10％勻漿(在瘙癢傳染病臨終期采集自敘利亞金地鼠的腦漿)的磷酸鹽緩沖鹽水添加進29.7ml白蛋白。對試樣進行總劑量為30kGy或55kGy的照射(控制試樣不照射)。
向剛斷奶的敘利亞金地鼠的腦內注射50μl未稀釋的試樣。然后評估所有動物的瘙癢病癥狀，記錄其搖晃步態、無法直立和臨終條件(實施無痛致死的時機)。計算注射之后每種癥狀出現的天數。
結果與未注射的控制試樣相比，高劑量照射(55kGy)使三種癥狀終點的平均誘導時間(incubation time)延長了13到15天，這相當于病原體滴定下降大約2log10ID50。低劑量照射(30kGy)使誘導時間延長了8到13天，這相當于病原體滴定下降大約1log10ID50，依然明顯低于未照射的控制試樣。
對數據進行線性回歸分析產生95％的置信區間(confidenceinterval)，這意味著在病原體滴定中病原體含量的真實減少量可能高達3.5log10ID50。實施例24本實驗評估凍干和/或添加穩定劑對45kGy照射后的凝血酶活性的保護效果。
方法備制包含1％牛血清白蛋白的凝血酶試樣，并將其凍干到希望的水分含量。將抗壞血酸鈉作為穩定劑添加到一些試樣的200mM濃縮液中。
然后用伽馬射線照射所有試樣(總劑量45kGy，劑量率2.03-2.13kGy/小時，溫度4℃)，隨后測量凝血酶的活性。
結果在不添加穩定劑的情況下，只經過首次干燥期的照射試樣的凝血酶活性恢復到67％。添加穩定劑將恢復度提高到86％。實驗結果如圖19所示。實施例25在本實驗中，我們通過將液體IVIG多細胞抗體暴露于45kGy伽馬照射(1.8kGy/小時)來評估某些穩定劑的保護效果。測試的穩定劑為抗壞血酸鈉和抗壞血酸/N-乙酰半胱氨酸混合物。
結果不含穩定劑的照射試樣呈現以下活性損失對于風疹病毒損失1log；對于腮腺炎病毒損失0.5-0.75log；對于CMV損失1log。與未照射的控制試樣相比，含有穩定劑抗壞血酸鈉和抗壞血酸/N-乙酰基-半胱氨酸混合物的照射試樣的活性沒有損失。
本實驗的結果如圖20-26所示。實施例26本實驗設計用來評估pH值對于添加穩定劑(抗壞血酸鈉、尿酸鈉或其混合物)的尿激酶(液體或凍干)在接受照射后的恢復度的效果。
方法將尿激酶(1000U/ml)與200mM抗壞血酸鈉和/或300μM混合，并添加各種pH值的35mM磷酸鹽緩沖液。對所有試樣按2kGy/小時的劑量率進行總劑量為45kGy的照射。
結果含有抗壞血酸鈉的凍干照射試樣在pH值為5.5-7.8(包括)時呈現約88-90％的尿激酶活性恢復度。含有抗壞血酸鈉的液體照射試樣在pH值為5.5-7.8時呈現約65-70％的尿激酶活性恢復度。本實驗如圖26所示。
以上通過實施例對本發明進行了充分說明，在不脫離本發明的范圍及其任何實施例的情況下，所屬技術領域的技術人員當可在更廣或等同的條件、模式和其他參數范圍內實施本發明。本說明書中所提及的所有專利或文獻均以引用方式并入本文中。
權利要求
1.一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，該方法包括(i)將生物材料的溶劑殘留量減低到足以有效保護所述生物材料抵御所述離子輻射的水平；和(ii)按有效劑量率用適當電離射線對所述生物材料照射一段有效時間，使所述生物材料得到消毒。
2.一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，該方法包括(i)向生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護所述生物材料抵御所述離子輻射；和(ii)按有效劑量率用適當電離射線對生物材料照射一段有效時間，使所述生物材料得到消毒。
3.一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，該方法包括(i)向生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護所述生物材料抵御所述離子輻射；和(ii)按低劑量率用適當電離射線對生物材料照射一段有效時間，使所述生物材料得到消毒。
4.一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，該方法包括(i)將生物材料的溶劑殘留量減低到足以有效保護所述生物材料抵御所述離子輻射的水平；和(ii)按低劑量率用適當電離射線對所述生物材料照射一段有效時間，使所述生物材料得到消毒。
5.一種用于消毒對離子輻射敏感的生物材料的方法，該方法包括(i)將生物材料的溶劑殘留量減低到足以有效保護所述生物材料抵御所述離子輻射的水平；(ii)向所述生物材料中添加至少一種穩定劑，其劑量應足以有效保護所述生物材料抵御所述離子輻射；和(iii)按有效劑量率用適當電離射線對所述生物材料照射一段有效時間，使所述生物材料得到消毒，其中步驟(i)和(ii)按顛倒順序實施。
6.根據權利要求2或3所述的方法，其步驟進一步包括，在實施所述照射所述生物材料的步驟之前減少所述生物材料中溶劑殘留量。
7.根據權利要求1、4、5或6所述的方法，其中所述溶劑為水。
8.根據權利要求1、4、5或6所述的方法，其中所述溶劑為有機溶劑。
9.根據權利要求7所述的方法，其中所述殘留水量通過添加一種有機溶劑來減少。
10.根據權利要求1-9所述的方法，其中所述生物材料在減少了所述溶劑殘留量之后懸浮在一種有機溶劑中。
11.根據權利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料為血液或血液成分。
12.根據權利要求1-11所述的方法，其中所述生物材料為蛋白質材料。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述蛋白質材料為血液成分。
14.根據權利要求1-13所述的方法，其中所述生物材料為凝血因子。
15.根絕權利要求14所述的方法，其中所述凝血因子選自凝血因子、因子II、因子V、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子XIIIa、馮威樂布蘭氏因子和血纖維蛋白原。
16.根據權利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料選自白蛋白、尿激素、多細胞免疫球蛋白、單細胞免疫球蛋白，以及一種或更多種多細胞和/或單細胞免疫球蛋白混合物。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白為免疫球蛋白G、免疫球蛋白M及其混合物。
18.根據權利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料為哺乳動物組織或經處理的哺乳動物組織成分。
19.根據權利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料為骨骼或經處理的骨骼成分。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述生物材料為去礦質骨基質。
21.根據權利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料為重組制造的生物材料。
22.根據權利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料為轉基因生物材料。
23.根據權利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料為食物或植物制品。
24.根據權利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料為碳水化合物或多糖。
25.根據權利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料選自幾丁質、幾丁多糖、NOCC-幾丁多糖及其衍生物。
26.根據權利要求1-10所述的方法，其中所述生物材料為細胞代謝制品。
27.根據權利要求1-26所述的方法，其中所述有效劑量率不大于約3.0kGy/小時。
28.根據權利要求1-26所述的方法，其中所述有效劑量率不大于約2.0kGy/小時。
29.根據權利要求1-26所述的方法，其中所述有效劑量率不大于約1.0kGy/小時。
30.根據權利要求1-26所述的方法，其中所述有效劑量率不大于約0.3kGy/小時。
31.根據權利要求1，2，5-26所述的方法，其中所述有效劑量率不大于約3.0kGy/小時。
32.根據權利要求1，2，5-26所述的方法，其中所述有效劑量率不小于約6.0kGy/小時。
33.根據權利要求1，2，5-26所述的方法，其中所述有效劑量率不小于約18.0kGy/小時。
34.根據權利要求1，2，5-26所述的方法，其中所述有效劑量率不小于約30.0kGy/小時。
35.根據權利要求1-34所述的方法，其中所述生物材料保持在低氧環境中。
36.根據權利要求35所述的方法，其中所述生物材料保持在氬氣中。
37.根據權利要求1，4-36所述的方法，其中所述溶劑殘留量通過凍干來減少。
38.根據權利要求1，4-37所述的方法，其中所述溶劑殘留量少于約10.0％。
39.根據權利要求1，4-37所述的方法，其中所述溶劑殘留量少于約5.0％。
40.根據權利要求1，4-37所述的方法，其中所述溶劑殘留量少于約2.0％。
41.根據權利要求1，4-37所述的方法，其中所述溶劑殘留量少于約1.0％。
42.根據權利要求1，4-37所述的方法，其中所述溶劑殘留量少于約0.5％。
43.根據權利要求1-42所述的方法，其中在實施所述照射所述生物材料的步驟之前向所述生物材料中添加至少一種敏化劑。
44.根據權利要求1-43所述的方法，其中所述生物材料包含至少一種蛋白病毒作為生物污染物。
45.根據權利要求1-43所述的方法，其中所述生物材料包含至少一種病毒作為生物污染物。
46.根據權利要求1和4所述的方法，其中在實施所述照射所述生物材料的步驟之前向所述生物材料中添加至少一種穩定劑。
47.根據權利要求2，3，5-46所述的方法，所述至少一種穩定劑為抗氧化劑。
48.根據權利要求2，3，5-47所述的方法，所述至少一種穩定劑為自由基凈化劑。
49.根據權利要求2，3，5-47所述的方法，所述至少一種穩定劑可減少由活性氧物質引起的破壞。
50.根據權利要求2，3，5-47所述的方法，所述至少一種穩定劑為下列中的一種抗壞血酸，或其鹽或酯；谷胱甘肽；6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧基酸；尿酸，或其鹽或酯；蛋氨酸；組氨酸；N-乙酰基-半胱氨酸；以及兩種或更多種所述穩定劑的混合物。
51.根據權利要求50所述的方法，所述兩種或更多種所述穩定劑的混合物為下列中的一種抗壞血酸，或其鹽或酯與尿酸，或其鹽或酯的混合物；抗壞血酸，或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧基酸的混合物；抗壞血酸，或其鹽或酯、尿酸，或其鹽或酯與6-羥基2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧基酸的混合物；以及尿酸，或其鹽或酯與6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧基酸的混合物。
52.根據權利要求1-51所述的方法，其中所述離子輻射為微粒輻射或電磁輻射，或兩者的混合。
53.根據權利要求52所述的方法，其中所述電磁輻射為下列中的一種無線電波、可見和不可見光、紫外光、X光射線和伽馬射線。
54.根據權利要求1-51所述的方法，其中所述的離子輻射為伽馬輻射。
55.根據權利要求1-51所述的方法，其中所述的離子輻射為電子束輻射。
56.根據權利要求1-51所述的方法，其中所述的離子輻射為可見光。
57.根據權利要求1-51所述的方法，其中所述的離子輻射為紫外光。
58.根據權利要求1-51所述的方法，其中所述的離子輻射為X光輻射。
全文摘要
本發明公開了對生物材料進行消毒以減少其中的活性生物污染物，如病毒、細菌、酵母菌、霉菌、支原體和寄生蟲含量的方法。
文檔編號A61L2/08GK1427729SQ01809086
公開日2003年7月2日 申請日期2001年3月23日 優先權日2000年3月23日
發明者R·S·肯特, E·A·霍頓 申請人:科利昂特有限公司