專利名稱：一種短肽及其衍生物,以其為活性成分的藥物與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種短肽及其衍生物，以該短肽及其衍生物為活性成分的鎮痛藥物與應用鎮痛藥能選擇性地減輕或消除疼痛及伴隨的焦慮不安情緒，并為其他治療贏得良好的條件。目前，臨床上使用的止痛藥物基本上只有嗎啡及其衍生物，它們都是阿片類受體，特別是μ-型阿片受體的激動劑，具有相似的分子結構和作用機制，具有快速強效的鎮痛作用，同時也有較強的成癮性。因此，這類藥物都具有兩重性，既是藥，也是毒，用以治病是藥，用以過癮是毒。
本發明通過高通量篩選方法得到了一個五肽化合物，具有明顯的鎮痛活性，動物實驗表明該五肽的衍生物具有更好的穩定性和一致的鎮痛活性，分子水平的研究證實該五肽的衍生物與μ-型阿片受體的親和力極低，而與k-型阿片受體的親和力極高，因此該五肽衍生物可能成為良好的低成癮性的鎮痛藥物。
本發明短肽的氨基酸殘基序列為Y-A-A-F-M它的衍生物有 本發明短肽及其衍生物的獲得，采用現有技術中的公知方法進行，既可以用多肽自動合成儀進行化學合成，又可以將短肽序列推導成核苷酸序列，然后克隆到表達載體中進行生物合成。
實驗證明，本發明的5肽Y-A-A-F-M與它的衍生物(I)、(II)在基本特性，特別是在鎮痛作用上，其機理與效果是一致的，但由于小肽在體外不穩定，因此在實際應用中一般以衍生物(I)、(II)為主。
本發明的鎮痛藥以上述短肽或其衍生物為活性成分，含有治療有效量的本發明短肽或其衍生物。
需要的時候，在上述藥物中還可以含有一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發明的藥物可以制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液及注射液等多種形式，各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。
本發明化合物的藥用量可根據患者的年齡、體重、疾病的嚴重程度進行調整，日劑量一般為10mg/kg體重。
以本發明的短肽或其衍生物為活性成分的藥物，既有與嗎啡相近似的鎮痛功效，同時由于它是k-型阿片受體的激動劑，因此使用者不會產生成癮性。本發明的短肽及其衍生物在制造鎮痛藥物中將會得到廣泛的應用，并且將會帶來巨大的社會及經濟效益。
圖2為本發明短肽與其它配體介導的信號比較分析直方圖。
圖3為本發明短肽與U69593和嗎啡鎮痛活性的比較。
CHO衍生工程細胞株CHO-OPR8 CGMCC №06 13及CHO衍生工程細胞株CHO-PCGMCC №0612的獲得過程為1、取人體正常分娩胎盤為組織供體，保存于-70℃低溫冰箱中備用。
2、RNA的提取從-70℃低溫冰箱中取出胎盤組織樣品1克，置于已經降溫處理的研缽中，加入少量液氮將組織塊磨碎，然后加入10ml Trozol試劑，轉入冰浴的勻漿器中進行勻漿破碎細胞，然后加入2毫升氯仿，混勻后離心取上清，進行異丙醇沉淀，離心沉淀后用70％乙醇洗滌，室溫干燥后溶解于100μl水中，取2μl進行紫外檢測，5μl用來進行逆轉錄，其余樣品置于-70℃備用。腦組織的總RNA購自CLONTECH公司，用于逆轉錄PCR擴增μ-型阿片受體。
3、逆轉錄取5μlmRNA樣品加入2μlSMARTIII/3’PCR引物，混均后72℃保溫2分鐘，迅速置于冰上冷卻2分鐘，依次加入4.0μl5×buffer，2.0μlDTT，2.0μldNTPMix，1.0μlRNase Inhibitor和2.0μlSuperscriptII逆轉錄酶，混均后至于42℃溫箱中保溫1小時，-20℃保存備用。
4、PCR擴增根據K-型及μ-型阿片受體的cDNA的序列和序列內限制性內切酶識別位點的情況以及將要克隆載體上酶切位點的有關情況，設計下列引物5’-CATGCCATGGACTCCCCGATCCAGATC-3’(a)5’-CCGCTCGAGTCATACTGGTTTATTCATC-3’(b)5’-CCGGGTACCATGGACTCCCCGATCCAGATC-3’(c)5’-TCCACGACTGGTTTATTCATC-3’(d)采用Oligo(dT)18(PROMEGA公司產品)作為逆轉錄引物合成cDNA的一條鏈之后，采用外側引物(c)和(d)進行第一輪PCR擴增，再采用內側引物(a)和(b)進行PCR擴增，PCR擴增的反應循環參數為95℃ 5分鐘，1個循環；95℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘，30個循環；72℃ 10分鐘，1個循環。
克隆K-型及μ-型阿片受體基因時采用高保真的Taq DNA聚合酶，并采用二輪PCR擴增，反應體系為100ul，檢測用普通Taq DNA聚合酶PCR體系，反應體系為25ul。
5、克隆到T載體中并進行酶切鑒定和序列分析將采用高保真PCR擴增的片段進行末端補A，然后進行初步純化，將純化的PCR產物與T載體進行連接，連接后的產物進行電激，轉化JM109，然后涂LB氨芐青霉素平板。平板上含有IPTG和X-Gal，首先進行藍白斑篩選，挑取白斑進行接種培養，提取質粒進行酶切鑒定，將鑒定含有目的的片段大小的克隆進行序列分析進行進一步的鑒定。測序結果顯示所獲得片段的序列與文獻報道的K-型及μ-型阿片受體的cDNA序列完全一致。
6、將K-型及μ-型阿片受體cDNA克隆至真核表達載體中將經過序列分析的K-型及μ-型阿片受體cDNA進行PCR擴增，更換兩端的酶切位點，將PCR產物進行初步純化后進行酶切，將酶切的片段與已經完全雙酶切的載體質粒pcDNA3.1(+)進行連接，連接后進行電激轉化JM109，然后涂LB氨芐青霉素平板，挑取12個單菌落進行接種培養，提取質粒進行酶切鑒定。一共挑選了11個單克隆的質粒進行酶切鑒定，獲得了10個重組質粒，分別命名為pOPR5-10和pMOR1-5。
7、CHO細胞的復蘇及培養凍存的CHO細胞(來自ATCC)從液氮中取出后迅速置于37℃恒溫水浴鍋進行融化，一旦融化，迅速轉入裝有已經預熱的培養基的試管中，混勻后離心收集細胞，然后再用培養基洗滌一次，最后懸浮于8ml培養基中，裝入細胞瓶中進行培養。
8、質粒轉化CHO細胞取3個細胞培養皿(φ35mm)，各接種1-2×105細胞約1ml，37℃，5％CO2培養過夜，制備轉染液A(1-10ugDNA，用無血清的培養基稀釋到100ul)和B(10ul脂質體，用無血清的培養基稀釋到100ul)；輕輕混勻A和B，室溫靜置15分鐘；用2ml無血清培養基洗滌培養皿中的細胞2次，再加入1ml無血清培養基；然后緩慢加入A和B的混合液；混勻后37℃，5％CO2培養24小時，吸除無血清培養基，約一個星期后對照出現細胞大量死亡，而質粒轉化的CHO細胞則出現大量的細胞集落，用維持培養基(含有200ug/mlG418)進行繼續培養。
9、單克隆細胞株的篩選及PCR鑒定將分隔良好的細胞集落用胰酶進行消化，用彎曲的平口注射器針頭吸取消化的細胞集落，轉入96孔板中，進行10倍稀釋直至107稀釋度，共吸取2板24個細胞集落，37℃，5％CO2培養直到長出單菌落，然后分別轉入細胞培養瓶中進行大規模培養，提取DNA進行PCR鑒定。
轉化pOPR1-5的CHO細胞株命名為CHO-OPR5-10，并選定CHO-OPR8為供篩選用細胞株，轉化空載體的CHO細胞株命名為CHO-P。
實施例1、本發明短肽與k-型阿片受體和μ-型阿片受體解離常數的測定采用競爭性結合的方法分析本發明5肽分別與k-型阿片受體和μ-型阿片受體的表觀解離常數。分別采用3H標記的U69593(購自Amersham Pharmacia Biotech公司)和3H標記的嗎啡(購自Sigma公司)作為特異性標記的配體，通過加入不同濃度的5肽進行競爭性結合，膜受體分別采用CHO-OPR8的膜受體混合物和大鼠腦組織的膜受體混合物，3H標記的U69593的濃度及3H標記的嗎啡的濃度均為0.5nmol/L，再加入不同濃度的合成5肽，通過液閃計數分析合成5肽濃度的增加與標記配體濃度的變化的關系。液閃計數分析結果如表1所示，其中，Con為5肽的濃度；T1是膜受體的總數，S1是5肽與k-型阿片受體的特異性結合量，B1是5肽與k-型阿片受體的特異性結合百分數；T2是膜受體的總數，S2是5肽與μ-型阿片受體的特異性結合量，B2是5肽與μ-型阿片受體的特異性結合百分數。
表1本發明5肽分別與k型阿片受體和μ型阿片受體的表觀解離常數

從表1中可以看出，隨著5肽濃度的增加，特異性結合量和特異性結合的百分數都有所降低，而且特異性結合到K型阿片受體上的同位素隨著5肽濃度的增加，下降的速度比結合到μ型阿片受體上的同位素要快，如

圖1所示，以5肽濃度的對數為橫坐標，以特異性結合的百分數為縱坐標作圖(B1本發明5肽與型阿片受體的競爭性結合曲線；B2本發明5肽與型阿片受體的競爭性結合曲線)，根據作圖的結果計算IC50，然后根據公式Ki＝IC50/(1+[L]/Kd)計算相應的表觀解離常數。
從圖1中可以得出IC50B1和IC50B2分別為4.38×10-8和2.76×100-6mol/L，根據公式Ki＝IC50/(1+[L]/Kd)算出相應的Ki分別為1.32nmol/L和＞1000nmol/L，Ki分別與相應的Kd相比，合成的5肽對于K型阿片受體Ki＝1.32nmol/L＜Kd＝1.49nmol/L，該結果表明合成的5肽與K型阿片受體親和力較U69593更強一些；合成的5肽對于μ型阿片受體Ki＞1000nmol/L，遠遠大于嗎啡與μ型阿片受體的解離常數，因此合成的5肽對于μ型阿片受體的親和力要遠遠弱于嗎啡。這些分析結果表明合成的5肽對于K型阿片受體具有很好的特異性和很強的親和力，而對于μ型阿片受體的親和力則很低。
從實驗結果分析可以看出，合成的5肽對于K型阿片受體的特異性以及親和力與U69593有很大的相似性，而與嗎啡有著較大的差異。可以推斷，合成的5肽在體內的作用機理上應該與U69593有很大的相似性而與嗎啡有著較大的差異。
實施例2、本發明短肽與CHO-OPR8相互作用后介導的信號分析以CHO-P細胞株作為對照細胞株，以U69593，嗎啡，納洛酮作為對照配體，觀察本發明5肽與CHO-OPPR8相互作用介導的信號反應，采用試劑盒檢測細胞內cAMP濃度變化。結果如表2所示表2細胞內cAMP濃度的變化

ΔOD450(實驗組-對照組)如圖2所示，以Δ的值為縱坐標，以不同的樣本號為橫坐標作圖，從圖2可以看出，CHO-P對五肽樣品沒有明顯的反應；而CHO-OPR8對所有的配體及樣品均有不同程度的反應。在對CHO-OPR8的作用中，5肽和U69593一樣，表現出明顯的激動劑特點，特異性地降低細胞內的cAMP濃度，而納洛酮則明顯表現出拮抗劑的特點，特異性地升高細胞內的cAMP濃度。實驗結果表明，本發明5肽能夠與CHO-OPR8結合，也能夠介導細胞內的信號轉導。從介導信號的效果來看，合成的5肽明顯屬于K型阿片受體激動劑。因此從分子以及細胞學水平證明化學合成的5肽至少具有與U69593相似的鎮痛活性。
實施例3、熱輻射法(甩尾法)測定本發明短肽的鎮痛作用熱輻射法測定小鼠對疼痛的敏感程度的方法是，將光輻射熱測痛儀熱板置于桌面上，將小鼠置于小鼠固定桶中，尾部暴露于桶外，實驗前先用75％的乙醇擦凈鼠尾，用記號筆在鼠尾的下1/3處作出標記，作為光輻射刺激點，測定各小鼠的正常痛反應(甩尾)時間，共測兩次，每次間隔5分鐘。
挑選8只具有正常痛反應的小鼠，分成4組，每組2只。第一組腹腔注射生理鹽水約0.3ml(15ul/g)；第二組注射嗎啡約0.3mg(15ug/g)；第三組注射U69593約0.3mg(15ug/g)；第四組注射0.3mg(15ug/g)的本發明結構式(I)短肽衍生物。給藥后15，30，45，60分鐘后分別測定痛反應時間，結果如表3所示，表中A、B是給藥前各小鼠的痛反應時間；C＝(A+B)/2；D-G是給藥后15，30，45，60分鐘時的痛反應時間。
表3不同處理小鼠的痛反應時間


從表3可以看出，生理鹽水沒有鎮痛活性，嗎啡、U69593以及化學合成的短肽(I)具有明顯的鎮痛活性。其中，嗎啡的鎮痛活性最強，在給藥后30分鐘后就達到很好的鎮痛效果，隨著時間的延長，鎮痛活性雖然有所上升，但上升的速度明顯放慢；U69593與5肽衍生物(I)隨著時間的延長，鎮痛活性穩步升高。從上表還可以看出，嗎啡產生明顯效果的時間很短，為30分鐘左右，而U69593以及5肽衍生物(I)達到同樣的效果則需要一個小時甚至一個小時以上的時間。根據表中的數據，計算痛閾提高百分率(用藥后痛反應時間減去用藥前同反應時間在初一用藥前同反應時間)，以兩只小鼠痛閾提高百分率的平均值作為該藥的痛閾提高百分率，結果如表4所示。
表4不同處理小鼠不同時間的痛閾提高百分率

以痛閾提高的百分數為縱坐標，以給藥后的時間為橫坐標作圖，結果如圖3所示。從圖3中可以看出，化學合成的5肽衍生物(I)具有明顯的鎮痛活性，其鎮痛效果的時間反應特性與U69593有著很好的相似性，與嗎啡則有著較大的區別。5肽衍生物(I)鎮痛活性的時間反應特性可能與在體內的作用機理有關，可以推測，其與嗎啡在體內的作用機理應有很大的差別，雖然5肽衍生物(I)的鎮痛效果不及嗎啡，但是由于其低成癮性，因此具有廣泛的應用前景。
權利要求
1.一種短肽，它的氨基酸殘基序列為Y-A-A-F-M
2.一種權利要求1所述短肽的衍生物，是結構式(I)或(II)的物質。
3.一種鎮痛藥，它的活性成分是權利要求1所述的短肽。
4.一種鎮痛藥，它的活性成分是權利要求2所述的短肽。
5.權利要求1或2所述的短肽在制造鎮痛藥物中的應用。
全文摘要
本發明的名稱為一種短肽及其衍生物，以其為活性成分的藥物與應用。本發明的短肽為本發明短肽的氨基酸殘基序列為Y－A－A－F－M，它的衍生物有化學式1。以本發明的短肽或其衍生物為活性成分的藥物，既有與嗎啡相近似的鎮痛功效，同時由于它是k－型阿片受體的激動劑，因此使用者不會產生成癮性。本發明的短肽及其衍生物在制造鎮痛藥物中將會得到廣泛的應用，并且將會帶來巨大的社會及經濟效益。
文檔編號A61P29/00GK1406947SQ01120370
公開日2003年4月2日 申請日期2001年8月23日 優先權日2001年8月23日
發明者段海清, 張兆山 申請人:段海清, 張兆山