專利名稱：作為胞液型磷脂酶的調制劑的甘油磷酸肌醇衍生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及甘油磷酸肌醇在制備用于抑制花生四烯酸釋放的治療藥物中的應用，具有甘油磷酸肌醇結構的新衍生物及它們的制備。磷脂酶是催化膜磷脂水解的酶，根據所含的化學鍵類型，分為磷脂酶A1、A2、B、C、D。
在哺乳動物中，花生四烯酸從磷脂的sn2酯鍵的活動化主要是由于在大量激動劑(包括激素、神經遞質、神經肽和生長因子)誘導受體活化后，胞液型磷脂酶(cytosolic phospholipase)A2(cPLA2)的活化造成的。
關于PLA2通過激動劑-受體相互作用的活化機理，提出了G-蛋白質通過兩種不同的機理介導受體誘導的活化(i)直接與PLA2相互作用，因為用百日咳毒素處理降低酶的活性是眾所周知的；或(ii)通過磷脂酶C(PLC)活化、由促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)造成的PLA2的磷酸化和活化來間接介導。
在哺乳動物中已鑒定了磷脂酶A2的兩種同等型，14 kDa分泌型和85 kDa胞液型(cPLA2)，它們不共有氨基酸序列同源性，并且它們的催化和調節機理不同。胞液型磷脂酶A2位于休眠細胞(例如，血小板和白細胞)的胞液中脂多糖、凝血酶或細胞因子(例如，白介素1β)、腫瘤壞死因子α，而且神經肽如速激肽、緩激肽或神經遞質如嘌呤，特別是ATP，以及5-羥色胺能激動劑、腎上腺素能激動劑和毒蕈堿性激動劑通過蛋白激酶C活化酶，使細胞內鈣水平上升以及酶的快速磷酸化，并隨后轉移到質膜，在這里它與磷脂底物結合。這些介質也誘導酶的從頭合成(E.Armandiburgermeister，U.Tibes，B.M.Kaiser，W.G.Friebe，W.V.Scheuer，“Suppression of Cytockine Synthesis，integrin expression and chonic inflammation by inhibitors of cytosolicphospholipase A2”Europ.J.Pharmacol.，326(1997)237-250)。
G蛋白、PKC、cPLA2體系的密切互調，以及在生成脂質和脂溶(lysolipid)介質時包含cPLA2(“胞內信號中的甘油磷酸肌醇-4-磷酸酯”(Glycerophosphoinositol-4-phosphate in intracellular signaling)C.P.Berrie，M.Falasca，A.Carvelli，C.Iurisci和D.Corda，in Bioactive Lipids，Vanderbock YY/ed.Plenum Publisching Corporation New York，1998)使PLA2成為具有潛在重要性的藥理學目標。
申請人現在最先發現，伴隨花生四烯酸的釋放而產生的物質，即L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇(GPI)，是一種自體有效物質，另外，通過化學半合成獲得并具有下述通式(I)的其鉀鹽、鈣鹽和鋅鹽及其它新衍生物和同系物，通過離體活化的PLA2的負調制對花化四烯酸的釋放發揮強有力的抑制作用，可以有效地用于處置由PLA2的活化介導的疾病。
本發明的目的是2、3、4、5、6或1’和2’位選擇性地O-取代的甘油基-磷酸基-D-肌醇，其特征在于由下面的通式表示 式中R1’、R2’、R2、R3、R4、R5、R6相互之間相同或不同，可以為H、或C(O)A或B，其中A、B、X、Y和M的含義在后面詳細說明。
本發明還涉及L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇(GPI)及其鹽，特別是與堿金屬或堿土金屬，特別是鈣的鹽，及與鋅的鹽，及式(I)的新衍生物在制備用于處置通過PLA2的活化或過度活化介導的疾病的藥劑中的應用。
本發明另外涉及藥物組合物，其含有至少一種式(I)的衍生物作為有效成分，以及適當的賦形劑，該組合物用于處置通過PLA2的活化或過度活化介導的疾病，特別是膿毒性休克及病毒和細菌感染；呼吸器官疾病，如急性肺部損傷(包括新生兒疾病)、慢性阻塞性支氣管病(包括哮喘)；皮膚病如牛皮癬、脂溢性皮炎、特異性皮炎，更一般的是皮膚活性不足(dis-reactivity)，也包括UV損傷后的氧化應力；由于細菌感染而對齒齦組織的損害；腸局部缺血；關節病如關節炎和關節痛，包括風濕性關節炎；眼科病、頭痛、血管重塑關聯的心血管病、腎病及任何與PLA2酶的過度刺激有關，甚至由特異受體和生長因子(如EGF、NGF)、或速激酶(如NK受體)、或嘌呤(例如ATP)如P2Y、或神經肽如蛙皮素或其它與活化PLA2的G蛋白偶聯的受體介導的疾病；腫瘤疾病，如前列腺癌或腎癌、或總是依賴于PLA2活化的疾病、疼痛和iperalgesia，中樞和周圍神經系統疾病和依賴于鞘磷脂循環的疾病，包括遺傳類型如Hermansky-Pudlak和Nieman-Pick綜合癥；與血管和神經系統間的屏障(如神經束膜和血腦屏障)的損傷有關的疾病，例如神經細胞水腫、中風、腦水腫和腦出血、暫時性腦缺血(TIA，Transient Ischemic Attack)；阿爾茨海默氏病或行為異常如精神分裂癥；代謝紊亂疾病如糖尿病；胰腺炎、與攝食異常有關的疾病如食欲過盛、食欲缺乏、惡病質(cachessia)、肥胖癥、抑郁癥。
以下將詳細說明作為能夠通過負調制磷脂酶A2、特別是其胞液同等型(cPLA2)的過度刺激，并隨后抑制花生四烯酸及其代謝物釋放的藥劑的式(I)的甘油基-磷酸基-D-肌醇的衍生物及同系物的特征和優點。
本發明涉及下式(I)的化合物、它們的對映異構體、非對映異構體、外消旋體、它們的混合物、它們的水合物及溶劑化物， 式中I)R1’、R2’、R2、R3、R4、R5、R6相互之間可相同或不同，為a)H或基團C(O)A、一元羧酸的非環殘基或二元羧酸的emiacylic殘基，其中A可以為直鏈或支鏈的飽和烷基或含1-4個雙鍵的不飽和的烷基，或單環或多環烷基或烯基、或芳基、芳烷基或含一個或多個雜原子的雜環基；這些基團可以任意被一個或多個基團置換，這些基團選自氧代、羥基、酰胺基、鹵素、巰基、烷硫基或烷基二硫基、-COOH，并且這些-COOH任意被中和形成COOM鹽，其中M具有與第(II)點中的相同含義；或-基團B，基中B為直鏈或支鏈的飽和烷基或含1-6個雙鍵的不飽和烷基；或單環或多環烷基或烯基、或芳基、烷芳基或含一個或多個雜原子的雜環基；這些基團可以任意被一個或多個基團置換，這些基團選自氧代、羥基、酰胺基、鹵素、巰基、烷硫基或烷基二硫基、-COOH，并且這些-COOH被任意中和形成-COOM鹽，其中M具有與第(II)點中的相同含義
((II)M為具有n+價的藥理學容許的無機元素的陽離子、或藥理學容許的有機堿的陽離子，其中n具有與下面的第(III)點中相同的含義；(III)n等于1或2或3；(IV)X與Y相互相同或不同，為O或S；以及其中，當Y為S時，式(I)的化合物也包括各自的未中和化合物。
更具體的A的說明i)當A為烷基時，優選為飽和或一元不飽和，并優選含1-8個碳原子，優選2-6個。
ii)當A為單環或多環烷基或烯基時，優選含5-30個碳原子，更優選6-24個碳原子。
當A為芳基、芳烷基或含一個或多個雜原子的雜環基時，優選其含4-15個碳原子，更優選4-8個。雜原子為1-5個，優選1-3個。它們可以是N、O或S，優選N。這些雜原子N可以被藥理學容許的有機或無機酸任意中和形成鹽。
B的說明i)當B為烷基，優選為飽和或一元不飽和。優選含1-8個碳原子，更優選2-6個碳原子。
ii)當B為單環或多環烷基或烯基時，優選其含5-30個碳原子，更優選6-24個碳原子。
當B為芳基、芳烷基或含一個或多個雜原子的雜環基時，優選含5-15個碳原子，更優選5-8個。雜原子優選為1-5個，更優選為1-3個。它們可以為N、O或S，優選N。這些雜原子N可以被藥理學容許的有機或無機酸任意中和形成鹽。
M的說明i)當M為藥理學容許的無機元素的陽離子時，優選其選自鈉、鋰、鉀、鎂、鈣、鋅、鐵、硒、鉻、銅。
ii)當M為藥理學容許的有機堿的陽離子時，優選為單烷基-、二烷基-、三烷基-或四烷基銨，更優選為N-(2-羥乙基)-二甲基銨，膽堿或氨基酸(優選賴氨酸或精氨酸)的陽離子，或一肽、二肽、三肽和四肽(優選肌肽)的陽離子，或黃嘌呤堿(優選咖啡因)的陽離子。
術語酰胺基優選指乙酰胺基。
術語烷氧基優選指甲氧基、乙氧基或烯丙氧基。
術語鹵素優選指氯、氟、溴或碘。
術語芳烷基優選指C7-C9芳烷基，更優選芐基。
術語芳基優選指C6-C12芳基，優選苯基。
術語雜環基優選指飽和或不飽和的5員或6員環基團，或5員或6員環的芳族雜環基。
術語環烷基或環烯基(cycloalkylenic)優選指單環或多環，并優選含5-30個碳原子，更優選6-24個碳原子。
X和Y相互相同或不同，為O或S，并優選相互一致，并優選都為O。
本發明的另一個目的是式(I)的化合物及相關的未成鹽產物在處置通過cPLA2的活化或過度刺激介導的疾病，特別是前面所列的疾病中的應用。本發明化合物的制備本發明化合物優選但不限于從L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇(GPI)開始制備；含有硫原子的GPI同系物甘油硫代磷酸肌醇(glycerophosphothioinositol)根據下面實施例中所述的方法，從市售中間體開始制備，或根據文獻記載的簡單方法制備。GPI是以鉀形式出售的已知物質。室溫下GPI在水溶液中僅在接近中性的pH值下才穩定。在不同的pH值下，分子發生水解反應并降解。發現下述的制備GPI新型鹽的方法在維持GPI結構的穩定性方面有效。
主要從鉀鹽開始制備下面的新GPI鹽，然而這里所述的方法適于從不同鹽開始制備工業需求的任何新型鹽。制備新型L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鹽(GPI)的一般方法方法I根據美國專利US 5,306,840制備L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇(GPI)的無機和有機鹽的一般方法簡述如下將起始的鹽溶于水或水與有機溶劑的混合物中，然后施加于陽離子交換樹脂柱(在4℃溫度下以H+的形式產生)上。收集洗脫的GPI酸型溶液并保持在0-4℃，然后用生物學容許的有機或無機陽離子的堿中和(摩爾/摩爾)，得到有關的鹽。該溶液可以原樣用于隨后的制劑操作，或可以在通過真空干燥或冷凍干燥或噴霧干燥而得到純凈干燥的GPI固體鹽后加以使用。
制備L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇(GPI)的-OH基烷基化或酰基化的衍生物的一般方法通常從根據美國專利US5,306,840制備的GPI鹽開始進行，制備的GPI鹽通常為鉀鹽或與季銨，優選在純有機溶劑或有機溶劑混合物或有機溶劑與水的混合物中，濃度為10-500mg/ml、優選50-200mg/ml的四丁基銨的鹽。其中優選以下有機溶劑丙酮、2-丁酮、甲基異丁基酮、二甲亞砜、環丁砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、吡啶、四氫呋喃、甲基四氫呋喃、乙腈、二甲氧基乙烷、二乙醚、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、1，1，1-三氯乙烷、甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇。反應在-30℃至120℃、優選5℃至40℃的溫度下進行15分鐘至48小時，優選1-15小時。
為插入詳細說明中第I點所定義的-C(O)A基團、一元羧酸的非環基團或二元羧酸的emiacylic基團，在優選但不限于有機或無機堿的存在下，將GPI與上述酸的活性衍生物反應，這些衍生物優選氯化物、溴化物、混合酸酐、環狀酸酐、活性酯如對硝基苯基酯、琥珀酰亞胺基酯、酰基咪唑、O-酰基異脲。這些堿優選堿金屬或堿土金屬，優選鋰、鈉、鉀、鎂、鈣的碳酸鹽、碳酸氫鹽、氧化物、氫氧化物、氫化物和醇鹽，三甲胺、三乙胺、三丁胺、四甲基氫氧化銨、四丁基氫氧化銨、吡啶或甲基吡啶。
為插入詳細說明中第(I)點所定義的B基團，將GPI與式Z-B(式中Z為鹵素)的活性衍生物反應，所述的活性衍生物優選氯化物、溴化物或碘化物，或烷基磺酸鹽基，優選甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽或三氟甲磺酸鹽。GPI與Z-B的反應優選但不限于在無機或有機堿的存在下進行。這些堿優選堿金屬或堿土金屬，優選鋰、鈉、鉀、鎂、鈣的碳酸鹽、碳酸氫鹽、氧化物、氫氧化物、碘化物和醇鹽，三甲胺、三乙胺、三丁胺、四甲基氫氧化銨、四丁基氫氧化銨、吡啶或甲基吡啶。
以同樣的方式制備GPI的含有S原子的烷基或酰基衍生物甘油硫代磷酸肌醇。
反應收率98％。
產物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鎂鹽的化學物理性質如下外觀白色粉末分子式 (C9H18H11P)2Mg分子量 690.71元素分析C＝31.3％，H＝5.25％，O＝50.96％，P＝8.97％，Mg＝3.52％在有機溶劑中的溶解度 微溶于有機溶劑在水中的溶劑度 ＞10mg/mlTLC 在硅膠玻璃上施加100微克；顯影劑A氯仿/甲醇/水3∶3∶1顯影劑B乙腈/水3∶1，噴霧堿性KMnO4(KMnO4basic)-符合GPI標準，沒有觀察到降解產物。
反應收率98％。
產物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鈣鹽的化學物理性質如下外觀 白色粉末分子式(C9H18H11P)2Ca分子量706.48元素分析 C＝30.6％，H＝5.14％，O＝49.82％，P＝8.77％，Ca＝5.6/％在有機溶劑中的溶解度 微溶于有機溶劑在水中的溶劑度 ＞10mg/mlTLC 在硅膠玻璃上施加100微克；顯影劑A氯仿/甲醇/水3∶3∶1顯影劑B乙腈/水3∶1，噴霧堿性KMnO4-符合GPI標準，沒有觀察到降解產物。
反應收率99％。
產物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鋅鹽的化學物理性質如下外觀 白色粉末分子式 (C9H18H11P)2Zn分子量 731.78元素分析 C＝29.54％，H＝4.96％，O＝48.1％，P＝8.47％，Zn＝8.93％在有機溶劑中的溶解度 微溶于有機溶劑在水中的溶劑度＞10mg/mlTLC 在硅膠板上施加100微克；顯影劑A氯仿/甲醇/水3∶3∶1顯影劑B乙腈/水3∶1，噴霧堿性KMnO4-符合GPI標準，沒有觀察到降解產物。
制備L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇的鈉鹽將3.7克GPI鉀鹽(10mmol)溶于35ml蒸餾水中。將溶液在4℃冷卻，然后施加于含有15ml陽離子交換磺酸基樹脂(以H+型產生，并在4℃恒溫)的柱上。然后用15ml蒸餾水洗脫柱子，并在4℃、流過氮氣流的條件下收集洗脫液，然后用0.53克堿性碳酸鈉中和。過濾、冷凍和真空干燥所得的溶液。
反應收率98％。
產物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鈉鹽的化學物理性質如下外觀白色粉末分子式 C9H18H11PNa分子量 356.2元素分析C＝30.35％，H＝5.09％，O＝49.41％，P＝8.70％，Na＝6.45％在有機溶劑中的溶解度 微溶于有機溶劑在水中的溶劑度＞10mg/mlTLC 在硅膠板上施加100微克；顯影劑A氯仿/甲醇/水3∶3∶1顯影劑B乙腈/水3∶1，噴霧堿性KMnO4-符合GPI標準，沒有觀察到降解產物。
反應收率98％。
產物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇膽堿鹽的化學物理性質如下外觀粉末分子式 C9H18H11P·C5H14NO分子量 437.37元素分析 C＝38.45％，H＝7.38％，N＝3.20％，O＝43.90％，P＝7.08％在有機溶劑中的溶解度 微溶于有機溶劑在水中的溶劑度 ＞10mg/mlTLC 在硅膠板上施加100微克；顯影劑A氯仿/甲醇/水3∶3∶1顯影劑B乙腈/水3∶1，噴霧堿性KMnO4-符合GPI標準，沒有觀察到降解產物。
反應收率 99％。
產物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇賴氨酸鹽的化學物理性質如下外觀 粉末式 C9H19H11P·C6H14N2O2分子式 C15H33N2O13P分子量 480.40元素分析 C＝37.50％，H＝6.92％，N＝5.83％，O＝43.30％，P＝6.45％在有機溶劑中的溶解度 微溶于有機溶劑在水中的溶劑度＞10mg/mlTLC 在硅膠板上施加100微克；顯影劑A氯仿/甲醇/水3∶3∶1
顯影劑B乙腈/水3∶1，噴霧堿性KMnO4-符合GPI標準；沒有觀察到降解產物。
反應收率98％。
產物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇精氨酸鹽的化學物理性質如下外觀 粉末式 C9H19H11P·C6H14N4O2分子式 C15H33N4O13P分子量 508.42元素分析 C＝35.44％，H＝6.54％，N＝11.02％，O＝40.91％，P＝6.09％在有機溶劑中的溶解度 微溶于有機溶劑在水中的溶劑度＞10mg/mlTLC 在硅膠板上施加100微克；顯影劑A氯仿/甲醇/水3∶3∶1顯影劑B腈/水3∶1，噴霧堿性KMnO4-符合GPI標準；沒有觀察到降解產物。
反應收率97％。
產物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇四丁基銨鹽的化學物理性質如下外觀 粉末式 C9H18H11P·C6H36N分子式 C25H54NO11P分子量 575.69元素分析 C＝52.16％，H＝9.46％，N＝2.43％，O＝30.57％，P＝5.38％在有機溶劑中的溶解度 微溶于有機溶劑，在DMF中≥10mg/ml在水中的溶劑度＞10mg/mlTLC 在硅膠板上施加100微克；顯影劑A氯仿/甲醇/水3∶3∶1顯影劑B乙腈/水3∶1，噴霧堿性KMnO4-符合GPI標準；沒有觀察到降解產物。
反應收率90％。
產物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鉀鹽的化學物理性質如下外觀 粉末分子式 C23H32O18PK分子量 666.58元素分析 C＝41.44％，H＝4.84％，O＝43.21％，P＝4.65％，K＝5.87％在有機溶劑中的溶解度 在DMF和乙醇中≥10mg/ml。
“將1.0克二酰基硫代甘油基磷酰基-肌醇在氮氣氛下懸浮在10ml無水甲醇中。加入50mg叔丁醇鉀，并將混合物在20℃下持續攪拌3小時。加入26.7mg乙酸，然后干燥混合物。將殘余物溶于10ml冷水中，并用10ml二乙醚萃取。然后丟棄有機層。”將該溶液冷卻至4℃，并施加到含有5ml陽離子交換磺酸基樹脂(以H+型產生，并在4℃恒溫)的柱上洗脫。然后用5ml蒸餾水洗脫柱子，并在流過氮氣流的條件下在4℃收集洗脫液，并用0.1M KOH中和至pH為7。過濾、冷凍并真空干燥所得的溶液。
反應收率95％。
產物硫代甘油基-磷酸基-D-肌醇鉀鹽的化學物理性質如下外觀 粉末分子式C9H18O10PSK分子量388.38元素分析 C＝27.84％，H＝4.67％，S＝8.25％，O＝41.20％，P＝7.98％，K＝10.07％
在有機溶劑中的溶解度 微溶于有機溶劑在水中的溶解度 ≥10mg/mlTLC 在硅膠板上施加100微克；顯影劑A 氯仿/甲醇/水3∶3∶1顯影劑B 乙腈/水3∶1，噴霧堿性KMnO4-Rf＝0.38
將400mg 2，3，4，5，6-五-O-甲氧基甲基-D-肌醇(1mmol)溶于50ml四氫呋喃/二氯甲烷1∶4的混合物中，然后將混合物冷卻至-15℃。
加入70mg咪唑和220mg三乙胺，然后緩慢逐滴加入150mg三氯化磷在5ml無水二氯甲烷中的溶液。
將所得的混合物保持攪拌2小時，然后加熱至室溫，加入10ml三乙基碳酸氫銨并攪拌1小時。相分離后，收集下層，用5ml冷水洗滌兩次，蒸發并高真空干燥。
將殘余物懸浮在20ml無水吡啶中，然后加入200mg 5，5-二甲基-2-氧代-2-氯-1，2，3-二氧磷雜六環(phosphorinane)及132.2mg D-α，β-亞異丙基基油，然后將混合物在室溫下、在惰性氣氛中攪拌30分鐘。將混合物干燥、蒸發。將殘余物懸浮在50ml四氯化碳中，并加入100mg硫；在室溫下攪拌30分鐘然后真空干燥。將殘余物溶于20ml無水甲醇中，并加入100mg對甲苯磺酸。將混合物加熱2小時至40分鐘，然后冷卻至室溫，然后在攪拌30分鐘的條件下加入2ml水。用碳酸氫銨中和混合物，并干燥。通過制備型色譜，使用氯仿/甲醇/水35∶25∶7的混合物作為顯影劑在硅膠柱上進行純化。收集含有產物的部分并真空干燥。
將殘余物溶于5ml水中；將溶液在4℃冷卻，并通過5ml陽離子交換磺酸基樹脂(以H+型在4℃產生)洗脫。用5ml蒸餾水洗脫柱子，并在流過氮氣流的條件下在4℃收集洗脫液，并用0.1M KOH中和至pH為7.0。過濾、冷凍和真空干燥所得的溶液。
反應收率65％。
產物硫代甘油基-硫代磷酸基-D-肌醇鉀鹽的化學物理性質如下外觀粉末分子式 C9H18O10PSK分子量 388.38元素分析C＝27.84％，H＝4.67％，S＝8.25％，O＝41.20％，P＝7.98％，K＝10.07％在有機溶劑中的溶解度 微溶于有機溶劑在水中的溶解度≥10mg/mlTLC 在硅膠板上施加100微克；顯影劑A氯仿/甲醇/水3∶3∶1顯影劑B乙腈/水3∶1，噴霧堿性KMnO4-Rf＝0.35生物活性按照實施例對化合物編碼，并編號如下Es. 化學名L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鈣鹽L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鋅鹽L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鈉鹽L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鉀鹽
L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇膽堿鹽L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇賴氨酸鹽對細胞系體外、及在小鼠中用P物質及其肽P6-11誘導的炎癥模型中體內試驗了這些化合物。
縮寫、試劑和材料激素Gibco(Grand Island，NY)(6H-促甲狀腺激素、胰島素、鐵傳遞蛋白、皮質甾醇、生長激素釋放抑制因子、甘氨酰-L-組氨酰(istidil)-L-賴氨酸乙酸鹽)。
青霉素Gibeo(Grand Island，NY)根據Ham改進的庫恩F-12介質(coon’s F-12medium)Gibco(GrandIsland，NY)鏈霉素Gibco(Grand Island，NY)NaF、AlCl3Fluka Chem AG(CH)5，6，8，11，12，14，15-3H(N)花生四烯酸Du Pont-NEN(Boston，MA)BSA牛血清清蛋白Sigma A-3311伊文斯藍(Evan’sBlue)Sigma E-2129甲酰胺Sigma F-7503乙酸乙酯Fluka Chem AG(CH)
PTFE 0.45μm過濾器Costar 130662P物質，SPClinalfa(IT)SP羰基末端肽SP6-11 Sigma S-0772蛋白激酶C，PKC磷脂酶A2，PLA2磷脂酶C，PLC促分裂原活化的PK，MAPK在各種細胞系中評價編碼為實施例3、實施例4和實施例4a的L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇自體有效物質對cPLA2誘導的花生四烯酸釋放的作用。實驗模型細胞培養FRTL5，來自大鼠甲狀腺的上皮細胞的細胞系在培養基中生長。簡要地說，在37℃、每3-4天更換一次的含5％CO2、95％空氣介質的濕氣氛下將細胞培養在根據Ham改進的Coon’s F12介質中，該介質補加了5％牛血清、20mM谷氨酰胺和六種激素(6H-促甲狀腺激素、胰島素、鐵傳遞蛋白、皮質甾醇、生長激素釋放抑制因子、甘氨酰-L-組氨酰-L-賴氨酸乙酸鹽)的混合物。
瑞士(Swiss) 3T3纖維原細胞使用各種刺激物刺激培養基，以釋放花生四烯酸依賴cPLA2的機理，例如ATP、肥大脫粒肽(肥大脫粒肽)、蛙皮索；不依賴cPLA2的機理，例如Ca2+離子載體、離子霉素(離子霉素)。試驗花生四烯酸的釋放首先將細胞用各種濃度的待檢化合物溫育60分鐘，或用預定的100μM濃度溫育各種時段(15-180分鐘)，用加有10mM Hepes和0.2％BSA(不存在游離脂肪酸)、pH7.4的HBSS(Hank’s平衡鹽溶液，存在Ca2+和Mg2+離子)洗兩次，并在37℃下在所述的緩沖液中用100μM ATP刺激10分鐘。收集上清液放入測定用閃爍池(scintillationcuvettes)中。結果表達為[3H]-花生四烯酸的總釋放量的百分比。結果編碼為實施例4a進行評價的化合物顯示，在進行試驗的所有細胞系中以依時和依濃度方式減少花生四烯酸的釋放，所述的花生四烯酸的釋放由cPLA2的活化誘導(表1、2、3、4、5)。
編碼為實施例3和實施例4的化合物顯示更為強烈的效果(表6)。
相反，實施例4a的化合物不能減少由與cPLA2無關的刺激物(如鈣離子載體)誘導的花生四烯酸的釋放(表7)。
總之，報告的數據顯示，實施例4a及實施例3和實施例4的化合物能夠限制花生四烯酸的釋放，依據的機理是由胞液型cPLA2的活化途徑(換句話說，是花生四烯酸代謝中的主要途徑)的負調制所特異介導。
表1在用ATP刺激的FRTL5細胞中，在實施例4a化合物的存在下，花生四烯酸釋放抑制的時程
用100μM實施例4a的化合物溫育預加載的細胞不同的時段，然后用ATP(100μM)刺激10分鐘。結果表達為3個獨立實驗的兩點的平均值±SE(標準偏差)。在對應的時段中，對照細胞的刺激一般為基本值的4-5倍。
表2實施例4a的化合物誘導對從用ATP刺激的FRTL5細胞釋放花生四烯酸的抑制
用各種濃度的實施例4a化合物預溫育預加載的細胞60分鐘，然后用100μM ATP刺激10分鐘。結果表達為3個獨立實驗的兩點的平均值±SE。
表3實施例4a化合物抑制從用ATP刺激的Swiss 3T3纖維原細胞釋放[3H]-花生四烯酸
用各種濃度的實施例4a化合物預溫育預加載的細胞60分鐘，然后用100μM ATP刺激10分鐘。結果表達為3個獨立實驗的兩點的平均值±SE。
表4實施例4a化合物減少Swiss 3T3纖維原細胞中[3H]-花生四烯酸的肥大脫粒肽-依賴性釋放
用各種濃度的實施例4a化合物預溫育有放射標記的預加載細胞60分鐘，然后用100μM肥大脫粒肽刺激10分鐘。結果表達為3個獨立實驗的兩點的平均值±SE。
表5實施例4a化合物減少Swiss 3T3纖維原細胞中[3H]-花生四烯酸的蛙皮素-依賴性釋放
用各種濃度的實施例4a化合物預溫育預加載細胞60分鐘，然后用蛙皮素刺激10分鐘。結果表達為3個獨立實驗的兩點的平均值±SE。
表6實施例4a化合物不能抑制FRTL5細胞中由離子霉素誘導的[3H]-花生四烯酸的釋放
用各種濃度的實施例4a化合物預溫育預加載細胞60分鐘，然后用10μM離子霉素刺激30分鐘。結果表達為3個獨立實驗的兩點的平均值±SE。
對由P物質的肽P6-11及P物質誘導的局部炎癥的保護活性的評價。實驗模型通過將保持在正常狀態的光/暗循環中并“隨意”進食的約20-22克的雌性balb/c小鼠暴露在乙醚飽和的氣氛中將其麻醉。然后將動物分成4組，每組10只。
通過在左耳廓中皮下注射P物質(1pmol/3μl)或其肽片段P6-11(1pmol/3μl)誘導毛細管滲透性；對照是注射了鹽溶液(Mazzari等，Eur.J.Pharm.1996)。
小鼠耳廓中的血漿外滲。
P物質或P6-11肽后立即對小鼠靜脈內注射Evan’s Blue(100mg/kg)，2小時后將其殺死。然后通過將注射的耳廓在2ml甲酰胺中均質化(Polytron均化器)提取染料。然后將均質化的組織在50℃溫育2小時。根據Saria和Lunberg方法(1983)，以Evan’s Blue在620nm(A620)的光密度測定血漿外滲。化合物的溶解和給用在毛細管滲透前30分鐘，將實施例中所述的化合物溶解在0.9％鹽溶液中，并以0.5-5mg/kg的劑量靜脈內注射進行給藥。結果P物質誘導的外滲是由于肥大細胞和血管內皮細胞的雙重活化機理，而P物質片段-肽P6-11僅僅是由于通過與NKI受體的相互作用對內皮的作用引起外滲(“Role of the N-terminal arginine in thehistamine releasing activity of substance P，bradikinin and relatedpeptides”；Deviller P.，Drapeau G.，Renoux M.，Regoli D.，Europ.J.Pharmacol.168(1989)53-60)。
所有試驗化合物均顯著減少由肽P6-11誘導的毛細管滲透性，而對于SP誘導的滲透性效果不明顯(表9)。
特別地，實施例5a中GPI的鉀鹽限制由P物質的片段P6-11誘導的外滲。
表7編碼為實施例4a和6的化合物限制由P6-11誘導的外滲
Student-Newman-Keuls檢驗*p＜0.05對第1組；·p＜0.05對第2組；p＜0.05對第6組。
表8編碼實施例4a的化合物對由P6-11誘導的外滲的依劑量效果
Student-Newman-Keuls檢驗*p＜0.05。
表9L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鉀鹽(實施例4a)和L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇鈣鹽(實施例2)對P物質誘導的外滲的效果
報告的事實顯示，本發明的化合物限制由P物質的末端肽P6-11誘導的血漿蛋白外滲。肽P6-11誘導通過上皮細胞外滲蛋白質，所按照的機理是稱為NKI的neurokin受體介導的特異機理。必須記住NK1、NK2和NK3受體分別介導內生腺體SP、NKA和NKB的信號，所有的這些腺體識別SP的末端部分與肽P6-11的比例。
總之，本發明的試驗化合物能夠負調制cPLA2，從而限制了與花生四烯酸代謝有關的活動的級聯反應。另外，本發明的化合物能夠限制由各種刺激物(如ATP)誘導的cPLA2的活化及在屏障滲透性(barrierpermeability)變化的部位存在的花生四烯酸的濃度的增加，所述的部位如外圍神經系統的血管-神經束膜，及中樞神經系統的血腦屏障。
本發明的化合物還調制通過蛙皮素受體介導的cPLA2活化，這與食物攝取失調有關，由此可以有助于處置由這樣的疾病機理介導的疾病，例如食欲過剩、食欲減退、肥胖癥和惡病質。
另外，本發明的化合物能夠進一步調制體內模型的NK-1受體的刺激。
因此，本發明的化合物可以作為處置由cPLA2的活化或過度刺激介導的疾病(如前述列舉的那些)的有效治療工具。
給藥劑量、時間和方式將根據疾病或變種的類型、階段、嚴重性和表現區域或在人或獸保健中的最終應用來選擇，對于3-90天的每一療程在0.1-100mg/kg之間。對于提到的所有疾病，在所有情況下不僅有全身、腸胃外、口和直腸給藥，而且也可局部、經皮給藥，以便獲得有效物質的最高利用率。對于口服制劑，主要是以片劑、糖衣片劑和膠囊給藥，但也可以粉劑和含有噴霧劑的溶液/懸浮液給藥。
對于局部處置，優選與皮膚和粘膜(包括齒齦粘膜)使用適合的凝膠、霜劑和溶液，以及用于在結膜囊給藥的滴眼藥。
注射型是用適合藥用的溶劑調制的，適于靜脈內、肌肉和皮下給藥。
相同的有效化合物可以適當濃度調制為口服補劑，用在人和獸藥中，用于預防或輔助處置與活性缺乏狀況有關的異常。
下面是藥物制劑和美容制劑的一些例子，它們僅是說明性的，不是限制。
實施例A-片劑有效成分實施例6 100mg賦形劑微晶纖維素 160mg淀粉 28mg乳糖 100mg硬脂酸 6.0mg實施例B-注射劑小瓶1有效成分實施例4，凍干品50mg小瓶2賦形劑 二水合磷酸氫二鈉 12mg二水合磷酸二氫鈉 1mg氯化鈉32mg注射用水 加至4ml實施例C-油包水型局部用霜劑％mg有效成分實施例7 2賦形劑 Twin60 0.5Polwax 2.5鯨蠟基硬脂醇(Cetylstearylalcohol) 2卡波姆凝膠(Carbomer) 0.5TEA(三乙醇胺) 0.5甘油 3防腐劑1水加至100mg
權利要求
1.通式(I)的化合物 它們的對映異構體、非對映異構體、外消旋體，它們的混合物、它們的水合物和溶劑化物，其中I)R1’、R2’、R2、R3、R4、R5、R6相互之間可相同或不同，為a)H或基團C(O)A、一元羧酸的非環殘基或二元羧酸的emiacylic殘基，其中A可以為直鏈或支鏈的飽和或含1-4個雙鍵的不飽和烷基，或單環或多環烷基或烯基、或芳基、芳烷基或含一個或多個雜原子的雜環基；這些基團可以任意被一個或多個基團置換，這些基團選自氧代、羥基、酰胺基、鹵素、巰基、烷硫基或烷基二硫基、-COOH，并且這些-COOH可任意被中和形成COOM鹽，其中M具有與第(II)點中的相同含義；或-基團B，其中B為直鏈或支鏈的飽和烷基或含1-6個雙鍵的不飽和烷基；或單環或多環烷基或烯基、或芳基、芳烷基或含一個或多個雜原子的雜環基；這些基團可以任意被一個或多個基團置換，這些基團選自氧代、羥基、酰胺基、鹵素、巰基、烷硫基或烷基二硫基、-COOH，并且這些-COOH可被任意中和形成-COOM鹽，其中M具有與第(II)點中的相同含義(II)M為具有n+價的藥理學容許的無機元素的陽離子、或藥理學容許的有機堿的陽離子，其中n具有與下面的第(III)點中相同的含義；(III)n為1或2或3；(IV)X與Y相互相同或不同，為O或S；以及其中，當Y為S時，式(I)的化合物也包括各自的未中和化合物。
2.權利要求1所述的化合物，其中M為具有n+價的a)生物學容許的無機陽離子或b)生物學容許的有機陽離子，其中n為1或2或3。
3.權利要求1所述的化合物，其中a)當A為烷基時，優選為飽和或一元不飽和，含1-8個碳原子，優選2-6個碳原子；b)當A為單環或多環烷基或烯基時，含5-30個碳原子，優選6-24個碳原子；c)當A為芳基、芳烷基或含一個或多個雜原子的雜環基時，其含4-15個碳原子，優選4-8個，含雜原子1-5個，優選1-3個，雜原子選自N、O或S，優選N；d)當B為烷基時，為飽和或一元不飽和，含1-8個碳原子，優選2-6個碳原子；e)當B為單環或多環烷基或烯基時，含5-30個碳原子，優選6-24個碳原子；f)當B為芳基、芳烷基或含一個或多個雜原子的雜環基時，含5-15個碳原子，優選5-8個，含雜原子1-5個，優選為1-3個，雜原子選自N、O或S，優選N。
4.權利要求2所述的化合物，其中M為a)生物學容許的無機陽離子，選自鉻、硒、銅、堿金屬元素、堿土金屬元素、Zn和Fe；b)藥理學容許的有機堿的陽離子，優選選自單烷基-、二烷基-、三烷基-或四烷基銨，優選N-(2-羥基)二甲基銨，膽堿的陽離子，或氨基酸的陽離子，其中氨基酸優選賴氨酸或精氨酸，或一肽、二肽、三肽和四肽的陽離子，或黃嘌呤堿的陽離子，其中黃嘌呤堿優選咖啡因。
5.權利要求1-4的任一項所述的化合物，用于處置由cPLA2的活化或過度刺激介導的疾病。
6.權利要求1-4的任一項所述的化合物及它們的非鹽化衍生物的應用，是用于制備處置由cPLA2的活化或過度刺激介導的疾病的藥物組合物。
7.權利要求6所述的應用，是用于處置與生長因子EGF或NGF和/或NK-1受體和/或與活化cPLA2的G蛋白偶聯的受體，如ATP受體和/或蛙皮素受體的過度刺激有關的疾病。
8.權利要求6或7所述的應用，是用于處置心原性和膿毒性休克及病毒或細胞感染。
9.權利要求6或7所述的應用，是用于處置呼吸器官疾病，如包括新生兒疾病的急性肺部損傷、包括哮喘的慢性阻塞性支氣管病。
10.權利要求6或7所述的應用，是用于處置皮膚疾病，如牛皮癬、脂溢性皮炎、特異性皮炎，更一般的是皮膚活性不足，也包括UVB損傷后的氧化應力；以及眼科疾病，如青光眼和結膜炎。
11.權利要求6或7所述的應用，是用于處置腫瘤疾病，如前列腺和腎癌，或總是依賴cPLA2的活化的疾病，以及腎病。
12.權利要求6或7所述的應用，是用于處置由于細菌感染引起的齒齦組織異常，以及腸局部缺血中的粘膜損傷。
13.權利要求6或7所述的應用，是用于處置關節病，如關節炎和關節痛，包括風濕性關節炎。
14.權利要求6或7所述的應用，是用于處置偏頭痛和頭痛、疼痛和痛覺過敏。
15.權利要求6或7所述的應用，是用于處置心臟病癥，以及與血管重構有關的心血管病。
16.權利要求6或7所述的應用，是用于處置與炎癥有關的外圍神經系統疾病，或毒劑-代謝不良神經病，以及用于處置中樞神經系統疾病如阿爾茨海默氏病，行為異常如精神分裂病、抑郁癥，醫原性損傷引起的疾病、或毒劑如可卡因引起的疾病，以及與鞘磷脂循環有關的皮膚機能失調或異常，包括遺傳型，如Hermansky-Pudlak和Nieman-Pick綜合癥。
17.權利要求6或7所述的應用，是用于處置與血管與神經系統間的屏障如神經的束膜的損傷有關的疾病，以及與血腦屏蔽的損傷有關的疾病，如神經水腫、中風、腦水腫和出血，暫時性腦缺血(TIA)。
18.權利要求6或7所述的應用，是用于處置與食物攝物紊亂有關的疾病，如食欲過剩、食欲缺乏、惡病質、肥胖癥。
19.權利要求6或7所述的應用，是用于處置代謝失調疾病，如糖尿病和胰腺炎。
20.組合物，含有權利要求1-4的任一項所述的至少一種衍生物作為有效成分，以及含有藥用容許的賦形劑。
21.權利要求20所述的組合物，適合經口給藥、腸胃外給藥、直腸給藥、舌下給藥、靜脈內給藥、肌肉內給藥、皮下給藥、局部給藥、真皮內給藥、經皮給藥。
22.權利要求21所述的組合物，其中局部途徑為皮膚或眼內。
23.權利要求21所述的組合物，其中經口給藥的劑型為粉劑、片劑、丸劑、膠囊、微粒、懸浮液，或基于冷凍干燥的起始物的制劑，如干糖漿。
24.權利要求21所述的組合物，其中腸胃外給藥的劑型為以冷凍干燥的化合物為起始物的臨時注射劑。
25.權利要求21所述的組合物，其中局部給藥的劑型為霜劑、軟膏、凝膠、冷凍干燥的粉劑、溶液或噴霧劑型。
26.權利要求6-20的任一項所述的應用，其中藥物用于獸用。
27.權利要求6-20的任一項所述的應用，其中，根據疾病或異常的類型、階段、嚴重性和現病間隔并根據人或獸應用，這樣的處置包括用3-90天的每一療程含有0.1-100mg/kg有效成分的處置。
全文摘要
本發明提供O位任意取代的甘油磷酸肌醇衍生物，它們的類似物及它們的鹽，其中取代基R1’、R2’、R3、R4、R5、R6具有所述的含義。并提供它們的合成及它們作為cPLA2的活化或過度刺激的調制劑的藥理學效果。
文檔編號A61P37/00GK1455779SQ00820007
公開日2003年11月12日 申請日期2000年11月7日 優先權日2000年11月7日
發明者達妮埃拉·科爾達, 羅伯托·達爾托索, 焦萬納·邦文托, 加布里埃利·馬爾科隆戈, 倫佐·達爾蒙特 申請人:I·R·B·生物技術研究院有限公司