一種液態復合生物保鮮劑及其制備方法與應用
【專利摘要】本發明涉及一種液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成：殼聚糖5～25份、ε?聚賴氨酸5～25份、溶菌酶5～25份、吸水鏈霉菌的菌液5～20份、細黃鏈霉菌的菌液5～20份、金產色鏈霉菌的菌液5～20份、乳酸鏈球菌的菌液5～20份、枯草芽孢桿菌的菌液5～20份、地衣芽孢桿菌的菌液5～20份、啤酒酵母菌的菌液5～20份、淡紫擬青霉菌的菌液5～20份、哈茨木霉菌的菌液5～20份。本發明的液態復合生物保鮮劑是一種高效、無毒、健康營養、對食品安全的果品保鮮劑,尤其對南果梨、軟棗獼猴桃或草莓保鮮效果顯著。
【專利說明】
一種液態復合生物保鮮劑及其制備方法與應用
技術領域
[0001]本發明涉及食品生物技術領域，特別是用于南果梨、野生軟棗獼猴桃、草莓的果品保鮮的液態復合生物保鮮劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]食物是人類生存和發展的物質基礎，是維持人體生命活動不可或缺的原料，經過采收、處理、儲存、包裝、運輸等一系列過程才被人們食用。由于呼吸生理代謝、病原微生物侵染、儲藏方法不當等問題引起腐敗變質，不僅使國民經濟產生巨大損失，還對人類健康造成重大威脅。因此，對健康、高效、低污染、低能耗、低成本的食品保鮮技術的研究已刻不容緩。
[0003]當前，冷藏結合化學防腐劑處理是控制食物腐敗的最有效技術措施，但由于使用化學防腐劑能夠對人體健康造成危害，并且使植物致病微生物對其產生抗藥性，所以迫切需要研究高效、無害、防腐的生物保鮮劑，以取代化學防腐劑的使用。
[0004]生物保鮮劑是指從生物機體中分離或利用細胞工程、基因工程、發酵工程和酶工程等技術獲得的，對人體安全健康，并且擁有食品保鮮功能的物質。在食品保鮮應用中生物保鮮劑有很好的效果，其保鮮作用機理有以下幾個方面:①含有抗菌活性物質，能夠抑制或殺死食物中的腐敗微生物，保持食物的新鮮度;②抗氧化作用，通過防止食品中不飽和脂肪酸等的氧化起到保質保鮮的作用;③抑制酶的活性，防止食物顏色發生變化，使其擁有良好的感官特性;④構成一層防護膜，能避免病原菌的污染，降低水分流失，保持食物品質。
[0005]生物保鮮劑的使用是一種新興的食品保鮮方法，它是一種利用某些天然物質配制成適當濃度的溶液，通過涂膜、浸泡或噴淋等方法處理生鮮食品來抑制或殺死其中的微生物，進而達到防腐保鮮效果的保鮮技術。生物保鮮劑可以抑制或殺滅食物中的腐敗菌，降低空氣與食品的接觸程度，減緩氧化作用，調節保存環境的氣體組成和相對濕度，因其具有綠色、高效、健康等好處，擴大了生物保鮮劑的應用范圍，引導著未來食品保鮮技術發展和應用。
[0006]生物保鮮劑大多是從生物體中提取得到的，與化學保鮮劑相比，擁有綠色、安全、健康營養的特點。使用生物保鮮劑不僅不會對食品的食用特性和營養價值產生影響，而且也不會引起二次污染。目前，按其來源不同，把生物保鮮劑分為天然保鮮劑與化學保鮮劑，憑借價格低廉這一特點，在食物保鮮中化學保鮮劑占據著主要地位。生物保鮮劑的特性是安全無毒，效率高，應用范圍廣，在未來的食品保鮮中必成為主流方向。
[0007]南果梨主產于遼寧省鞍山市，所以又稱為“鞍果”，是遼寧省極具特色的特產梨，其在遼寧鞍山已經有近百年的種植歷史，被稱為“梨中之王”，是可以和眾多地區的特色梨相媲美的珍貴梨種。南果梨中含有非常豐富的營養成分，經過農業部檢測，南果梨含有的微量元素達到了38種，這其中有許多微量元素的含量都大于其它水果。其中含可溶性固形物14.4%?15.5%，含酸量0.41%，并且有延年益壽、美容之功效，因此鞍山的父老鄉親把它親切比作梨中營養王后。
[0008]軟棗獼猴桃別名軟棗子、獼猴梨，為獼猴桃科落葉藤本植物。產于吉林省長白山區各縣，是長白山區著名的經濟野果之一，是珍貴的野生果中之王，被譽為“世界之珍果”。根據國內外學者對軟棗獼猴桃的大量實驗與深入研究表明，軟棗獼猴桃富含各種營養成分，具有抗癌、降血壓、抗衰老等各種醫療保健功效和極高的食用、營養、保健、藥用價值。
[0009]草莓，薔薇科、草莓屬多年生草本植物，一種紅色的花果，又名紅莓、洋莓、地莓等，外觀呈心形，鮮美紅嫩，果肉多汁，含有特殊的濃郁水果芳香。草莓富含氨基酸、果糖、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、蘋果酸、果膠、胡蘿卜素、維生素B1、B2、煙酸及礦物質鈣、鎂、磷、鉀、鐵等，這些營養素對生長發育有很好的促進作用，對老人、兒童大有裨益。國外學者研究發現，草莓中的有效成分，可抑制癌腫的生長。每百克草莓含維生素C50-100毫克，比蘋果、葡萄高10倍以上。科學研究業已證實，維生素C能消除細胞間的松弛與緊張狀態，使腦細胞結構堅固，皮膚細膩有彈性，對腦和智力發育有重要影響。飯后吃一些草莓，可分解食物脂肪，有利消化。
[0010]不論南果梨、軟棗獼猴桃或是草莓，極不易貯存，采摘后15天左右就將腐爛。所以，研制一種新型的生物保鮮劑對南果梨、軟棗獼猴桃或是草莓的保鮮具有重大意義。
【發明內容】
[0011 ]本發明的目的是提供一種液態復合生物保鮮劑。
[0012]本發明的另一個目的是提供一種液態復合生物保鮮劑的制備方法。
[0013]本發明的再一個目的是提供一種液態復合生物保鮮劑在南果梨、野生軟棗獼猴桃或草莓上的應用。
[0014]本發明使用的微生物菌是中國普通微生物菌種保藏管理中心1997、2003和2012年版的菌種目錄中公開的菌種，編號和菌株名是:
菌種編號為CGMCC4.1114的吸水鏈霉菌(sire1/ffjces hygroscop1us)，菌種編號為CGMCC4.891 的細黃鏈霉菌1.Streptomyces microflavus)，菌種編號為CGMCC4.909的金產色鏈霉菌(Streptomyces aureochro mo genes)，菌種編號為CGMCCl.18的乳酸鏈球菌CLactococcus Iactis)，菌種編號為CGMCCl.884 的枯草芽抱桿菌subtil is)，菌種編號為CGMCCl.1216的地衣芽孢桿菌{Bacillus Iicheniformis')，菌種編號為CGMCC2.1528的啤酒酵母菌(SaccAaroffijces cerevisiae)，菌種編號為CGMCC3.4035的淡紫擬青霉菌(Iilacinus Samson)，菌種編號為CGMCC 3.6635的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum Rifai)。
[0015]按照本發明所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖5?25份、ε-聚賴氨酸5?25份、溶菌酶5?25份、吸水鏈霉菌的菌液5?20份、細黃鏈霉菌的菌液5?20份、金產色鏈霉菌的菌液5?20份、乳酸鏈球菌的菌液5?20份、枯草芽孢桿菌的菌液5?20份、地衣芽孢桿菌的菌液5?20份、啤酒酵母菌的菌液5?20份、淡紫擬青霉菌的菌液5?20份、哈茨木霉菌的菌液5?20份。
[0016]按照本發明所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖7?20份、ε-聚賴氨酸7?20份、溶菌酶7?20份、吸水鏈霉菌的菌液5?15份、細黃鏈霉菌的菌液5?15份、金產色鏈霉菌的菌液5?15份、乳酸鏈球菌的菌液5?15份、枯草芽孢桿菌的菌液5?15份、地衣芽孢桿菌的菌液5?15份、啤酒酵母菌的菌液5?15份、淡紫擬青霉菌的菌液5?15份、哈茨木霉菌的菌液5?15份。
[0017]按照本發明所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖10份、ε -聚賴氨酸10份、溶菌酶10份、吸水鏈霉菌的菌液7.5份、細黃鏈霉菌的菌液7.5份、金產色鏈霉菌的菌液15份、乳酸鏈球菌的菌液15份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
[0018]按照本發明所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖20份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液10份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液1份、啤酒酵母菌的菌液6份、淡紫擬青霉菌的菌液6份、哈茨木霉菌的菌液6份。
[0019]按照本發明所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖7.5份、ε-聚賴氨酸20份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液10份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液1份、啤酒酵母菌的菌液5份、淡紫擬青霉菌的菌液5份、哈茨木霉菌的菌液5份。
[0020]按照本發明所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖7.5份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶20份、吸水鏈霉菌的菌液10份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
[0021]按照本發明所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖7.5份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液15份、細黃鏈霉菌的菌液15份、金產色鏈霉菌的菌液15份、乳酸鏈球菌的菌液15份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
[0022]按照本發明所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖7.5份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液10份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液15份、地衣芽孢桿菌的菌液15份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
[0023]—種制備如上所述的液態復合生物保鮮劑的方法，其特征在于如下步驟: A、殼聚糖、ε -聚賴氨酸、溶菌酶的制備方法:
a、殼聚糖的制備方法:
稱取蝦殼25克，加I摩爾/升的鹽酸溶液250毫升，攪拌，靜置12小時，過濾，棄去濾液;加5%氫氧化鈉溶液，至固液比1:8，攪拌，隔水煮I小時，過濾，得甲殼質，烘干，粉碎，備用；
取5克甲殼質粉于三口瓶中，加45%氫氧化鈉溶液100毫升，于110?120 °C攪拌反應I小時，冷卻，離心，移去上清液，水洗沉淀，再離心，再移去上清液，水洗沉淀，再移去上清液，以95%乙醇洗滌沉淀，倒入抽濾瓶中，抽濾，留濾餅，制得殼聚糖，晾干，備用重；
b、ε-聚賴氨酸的制備方法:
將菌種編號為4.121的白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)接種于含有5%甘油、1%硫酸銨、0.5%酵母浸膏、0.05%七水硫酸鎂、0.003%七水硫酸亞鐵、0.004%七水硫酸鋅，pH為6.8的液體培養基中，30°C溫度下，連續培養48小時，得到含量為0.38克/升的ε-聚賴氨酸，備用；
C、溶菌酶的制備方法:
蛋清的制備:將4?5個新鮮的雞蛋兩端各敲一個小洞，使蛋清流出，調雞蛋清pH值為8，輕輕攪拌5分鐘，使其稠度均勻，用兩層紗布過濾，備用；
雞蛋清粗品分離:將上述過濾的蛋清量取100毫升邊緩慢攪拌邊加入等體積的去離子水，均勻后在不斷攪拌下用I摩爾/升的鹽酸溶液調PH值至7，用脫脂棉過濾，收取濾液，制得蛋清溶液，備用；
D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂層析:
1)D152樹脂處理:將D152樹脂先用蒸餾水洗去雜物，濾出，用I摩爾/升氫氧化鈉溶液浸泡，并攪拌4?8小時，抽濾，用蒸餾水洗至PH7.5，抽濾，再用I摩爾/升的鹽酸溶液按上述I摩爾/升氫氧化鈉溶液處理樹脂的方法，直到全部轉變成氫型，抽濾，用蒸餾水洗至PH5.5，保持過夜，抽濾，用2摩爾/升氫氧化鈉溶液按上述處理樹脂的方法，使之轉變為鈉型，pH值至6.5，吸干溶液，加pH6.5的0.02摩爾/升的磷酸鹽緩沖液平衡樹脂，制得樹脂懸浮液；
2)裝柱:取直徑1.6厘米，長度為30厘米的層析柱，自頂部注入經處理的樹脂懸浮液，關閉層析柱出口，待樹脂沉降后，放出過量的溶液，再加入樹脂懸浮液，至樹脂沉積至15?20厘米高度，于層析柱頂部繼續加入pH6.5的0.02摩爾/升磷酸鹽緩沖液平衡樹脂，使流出液pH為6.5為止，關閉層析柱出口，保持液面高出樹脂表面I厘米；
3)上柱吸附:將上述蛋清溶液加到樹脂頂部，打開出口使其緩慢流入柱內，流速為I毫升/分鐘；
4)洗脫:用pH6.5的0.02摩爾/升的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，在收集洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計檢驗雜蛋白的洗脫情況，當基線開始走平后，改用含有1.0摩爾/升氯化鈉的PH值6.5的濃度為0.02摩爾/升磷酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液；
5)聚乙二醇濃縮:將上述洗脫液合并裝入透析袋內，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加蓋，酶液中的水被透析膜外的聚乙二醇所吸收，當濃縮到5毫升時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出濃縮液；
6)透析除鹽:蒸餾水透析除鹽24小時，制得雞蛋清粗品；
Sephadex G50分子篩柱層析: 1)裝柱:先將用20%乙醇保存的SephadexG50層析柱抽濾除去乙醇，用6克/升氯化鈉溶液攪拌Sephadex G50數分鐘，再抽濾，反復多次直至無醇味為止，加入膠體積1/4的6克/升氯化鈉溶液，充分攪拌，超聲除去氣泡，裝入I.6 X 50厘米的玻璃層析柱，柱床45厘米；
2)上樣:將上述制備的雞蛋清粗品加入層析柱；
3)洗脫:樣品流完后，先分次加入6克/升的氯化鈉溶液50毫升，洗脫柱壁上的樣品，連接恒流栗，使流速為0.5毫升/分鐘，用部分收集器收集，每10分鐘一管；
4)聚乙二醇濃縮:合并活性峰溶液，用聚乙二醇濃縮至5毫升時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出濃縮液；
5)透析除鹽:蒸餾水透析除鹽24小時，收集透析液，量取體積，制得溶菌酶，備用；
B、復合菌劑的制備:
制備所述吸水鏈霉菌的菌液、細黃鏈霉菌的菌液、金產色鏈霉菌的菌液的發酵方法:
a、斜面菌種活化培養:取高氏一號合成液體培養基，接入一種上述微生物的斜面培養物，27?28°C條件下在搖床上振蕩培養96?120小時，攪拌轉速為60?120轉/分，然后轉接到相同的培養基中培養，照此方法連續轉接3?5次，將獲得的培養液稀釋后涂布到平板固體培養基上，27?28°C條件下培養4?5天，待長出菌落后，挑取大菌落在同樣的固體平板培養基上劃線，挑選單菌落轉接到固體斜面培養基，培養得到馴化菌株，保存備用;b、二級搖瓶菌種培養:取高氏一號合成液體培養基，接入一級斜面菌種，于27?28 °C下培養96?120小時，攪拌轉速為60?120轉/分，得二級搖瓶種子液;根據生產規模，進一步采用種子罐進行種子的放大培養；
c、微生物菌液的發酵生產:取高氏一號合成液體培養基，接入上述制備的發酵種子液，于?!17.2?7.4、溫度27?28°C，發酵4?5天，即得，可作為生產菌液備用；
制備所述啤酒酵母菌的菌液、淡紫擬青霉菌的菌液、哈茨木霉菌的菌液的發酵方法:
a、斜面菌種活化培養:取I3DA液體培養基，接入一種上述微生物的斜面培養物，25?28°C條件下在搖床上振蕩培養48?72小時，攪拌轉速為60?120轉/分，然后轉接到相同的培養基中培養，照此方法連續轉接3?5次，將獲得的培養液稀釋后涂布到平板固體培養基上，25?28 °C條件下培養3?5天，轉速為60?120轉/分，待長出粗壯菌絲后，挑取粗壯菌絲在同樣的固體平板培養基上劃線，挑選粗壯菌絲轉接到固體斜面培養基，培養得到馴化菌株，保存備用；
b、二級搖瓶菌種培養:取PDA液體培養基，接入一級斜面菌種，于25?28°C下培養48?72小時，攪拌轉速為60?120轉/分，得二級搖瓶種子液;根據生產規模，進一步采用種子罐進行種子的放大培養；
c、微生物菌液的發酵生產:取PDA液體培養基，接入上述制備的發酵種子液，于pH7.0?
7.2、溫度25?28°C發酵3?5天，即得，作為生產菌液備用；
制備所述乳酸鏈球菌的菌液、枯草芽孢桿菌的菌液、地衣芽孢桿菌的菌液的發酵方法:
a、斜面菌種活化培養:取牛肉膏蛋白胨液體培養基，接入一種上述微生物的斜面培養物，30?40°C條件下在搖床上振蕩培養20?48小時，轉速為60?120轉/分，然后轉接到相同的培養基中培養，照此方法連續轉接3?5次，將獲得的培養液稀釋后涂布到平板固體培養基上，30?40°C條件下培養I?2天，轉速為60?120轉/分，待長出菌落后，挑取大菌落在同樣的固體平板培養基上劃線，挑選單菌落轉接到固體斜面培養基，培養得到馴化菌株，保存備用；
b、二級搖瓶菌種培養:取牛肉膏蛋白胨液體培養基，接入一級斜面菌種，于30?40°C下培養20?48小時，轉速為60?120轉/分，得二級搖瓶種子液;根據生產規模，進一步采用種子罐進行種子的放大培養；
C、微生物菌液的發酵生產:取牛肉膏蛋白胨液體培養基，接入上述制備的發酵種子液，于?!17.2?8.5、溫度30?40°C，發酵I?2天，即得，作為生產菌液備用；
C、液態復合生物保鮮劑的制備:
按照上述復合菌劑的原料重量份配比，將上述B步驟制備的各種菌液混合，制成復合菌劑，經檢驗，使含總有效活菌數達2億個/毫升，每一種有效菌的數量不得少于2000萬個/毫升以上，符合國家標準GB-20287-2006，再按照如上所述的原料組分的重量份配比，將上述步驟制備的殼聚糖、ε -聚賴氨酸、溶菌酶與復合菌劑混合均勻，即得。
[0024]—種如上所述的液態復合生物保鮮劑的用途，其特征在于，它作為果品保鮮劑應用于南果梨、野生軟棗獼猴桃或草莓。
[0025]本發明使用的原料組分特點如下:
枯草芽孢桿菌可提高作物對病菌和逆境危害引發體內產生氧的清除能力，調節細胞微生物環境，維持細胞正常的生理代謝和生化反應，提高作物的抗逆性，增加作物的保健作用，能促進作物生長，提高產量。
[0026]地衣芽孢桿菌細胞形態和排列呈桿狀、單生，可促使機體產生抗菌活性物質、殺滅致病菌。它能產生抗活性物質，并具有獨特的生物奪氧作用機制，能抑制致病菌的生長繁殖。
[0027]乳酸鏈霉菌能產生乳鏈菌肽，一般不會被食物中的微生物水解，但是會被胃蛋白酶水解，所以人食用后會很快的被分解成小分子的氨基酸，對人體無害，與此同時不會改變人體內的正常菌落數，也不會和經常使用的其它的抗生素發生交叉的抗性，因此，它是一種對人體無毒的天然保鮮劑。它對李斯特菌、葡萄球菌、片球菌、腸球菌等革蘭氏陽性菌，以及芽胞桿菌、梭狀芽胞桿菌等產芽胞的細菌均有較好的抑制效果，是一種高效綠色的食品保鮮劑，延長水果貯存期4?6倍。
[0028]細黃鏈霉菌產生紡錘菌素、螺旋霉素，對革蘭氏陽性及陰性細菌、酵母菌、絲狀真菌都有抑制作用。常用于農業上防病保苗，同時可作菌肥，能轉化土壤中氮磷元素提高土壤肥力，并有刺激作物生長的作用。
[0029]吸水鏈霉菌產生抑制革蘭氏陽性細菌、分枝桿菌、原蟲的潮霉素(hygromycin)，抑制分枝桿菌、病毒、腫瘤、絲狀真菌、酵母的吸水菌素(hygroscopin)，抑制革蘭氏陽性細菌、絲狀真菌、酵母的吸水制菌素(hygrostatin)等多種抗生素。
[0030]金產色鏈霉菌抑制革蘭氏陽性細菌、產金青霉。產生抗真菌抗生素;對絲孢酵母也有作用，拮抗性好，抑制革蘭氏陽性細菌、根瘤菌;弱抑制革蘭氏陰性細菌，強抑制多種絲狀真菌和一些酵母以及一些鏈霉菌。
[0031 ]哈茨木霉菌產生的次生代謝產物對多種農業致病菌有抑菌效果。
[0032]啤酒酵母菌對Pb2+的吸附量隨pH值的增加而增大，當pH=6時達到吸附最大值。
[0033]淡紫擬青霉菌屬于內寄生性真菌，是一些植物寄生線蟲的重要天敵，能夠寄生于蟲卵中，也能侵染幼蟲和雌蟲，可明顯減輕多種作物根結線蟲、胞囊線蟲、莖線蟲等植物線蟲病的危害。
[0034]殼聚糖在細胞壁含有豐富的磷壁酸的情況下是不能被吸附到細菌表面的，因此，對于此類細菌，殼聚糖在細胞內可以與細胞質中的陰離子發生絮凝作用，擾亂其新陳代謝過程，使細胞內的蛋白質和葡萄糖等大分子組分發生泄漏，從而達到殺菌的目的。殼聚糖通過在生鮮食物表層形成一層薄膜，能夠減緩食品水分和營養成分的損失，與空氣中的氧氣和致腐微生物隔離，從而食品不易腐敗變質。
[0035]ε-聚賴氨酸在pH<7時，能抑制大部分細菌和真菌的正常生長，對其抗性較強的如大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌抑制能力也相當不錯，而且能夠殺死耐熱性芽孢桿菌和一些病毒。
[0036]溶菌酶(Lys ο z yme)為堿性球蛋白，在酸性溶液中比較穩定。它能作用于細胞的細胞膜，能夠水解膜上的糖蛋白，從而導致細胞不能正常生長。對革蘭氏陽性菌，溶菌酶都能有非常好的抑制效果。
[0037]本發明的液態復合生物保鮮劑是將各種菌液按所述原料比例混配制備，能很好地保持復合菌劑中的各菌群數量比例相對穩定。復合菌劑與依靠自然環境進行分解的微生物菌群及與未經單獨培養而混配的菌群相比，采用單獨培養后，再混配在一起的菌群，由于可以根據實際需要選擇合理的配比，能充分地發揮菌劑中各菌群自身的生物特性與相互協同作用，所以，用其進行生物處理的適用范圍非常廣泛。
[0038]本發明的液態復合生物保鮮劑是一種高效、無毒、健康營養、對食品安全的果品保鮮劑，尤其對南果梨、軟棗獼猴桃或草莓保鮮效果顯著。
【具體實施方式】
[0039]以下各實施例僅用于對本發明進行解釋說明，并不構成對權利要求范圍的限定，本領域技術人員根據說明書內容可以想到的其它替代手段，均應在本發明權利要求的保護范圍之內。
[0040]本發明實施例采用的微生物菌種，選擇中國普通微生物菌種保藏管理中心1997、2003、2012年版的菌種目錄中公開的菌種，編號和菌株名是:
菌種編號為CGMCC4.1114的吸水鏈霉菌(sire1/ffjces hygros cop1us)，菌種編號為CGMCC4.891 的細黃鏈霉菌1.Streptomyces microfla vus)，菌種編號為CGMCC4.909的金產色鏈霉菌(Streptomyces aureochro mo genes)，菌種編號為CGMCCl.18的乳酸鏈球菌CLactococcus Iactis)，菌種編號為CGMCCl.884 的枯草芽抱桿菌subtil is)，菌種編號為CGMCCl.1216的地衣芽孢桿菌{Bacillus I icheniformis')，菌種編號為CGMCC2.1528的啤酒酵母菌(SaccAaroffijces cerevisiae)，菌種編號為CGMCC3.4035的淡紫擬青霉菌(Iilacinus Samson)，菌種編號為CGMCC 3.6635的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum Rifai)。
[0041 ]實施例的液態復合生物保鮮劑制備方法為如下步驟:
A、殼聚糖、ε -聚賴氨酸、溶菌酶的制備方法:
a、殼聚糖的制備方法:
稱取蝦殼25克，加I摩爾/升的鹽酸溶液250毫升，攪拌，靜置12小時，過濾，棄去濾液;加入5%氫氧化鈉溶液，至固液比1:8，攪拌，隔水煮I小時，過濾，得甲殼質，烘干，粉碎，待用； 取5克甲殼質粉于三口瓶中，加45%氫氧化鈉溶液100毫升，于115°C攪拌反應I小時，冷卻，離心，移去上清液，水洗沉淀，再離心，再移去上清液，水洗沉淀，再移去上清液，以95%乙醇洗滌沉淀，倒入抽濾瓶中，抽濾，留濾餅，制得殼聚糖，晾干，備用；
b、ε -聚賴氨酸的制備方法:
將菌種編號為4.121的白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)接種于含有5%甘油、1%硫酸銨、0.5%酵母浸膏、0.05%七水硫酸鎂、0.003%七水硫酸亞鐵、0.004%七水硫酸鋅，pH為6.8的液體培養基中，30°C溫度下，連續培養48小時，制得含量為0.38克/升的ε-聚賴氨酸，備用；
C、溶菌酶的制備方法:
蛋清的制備:將4?5個新鮮的雞蛋兩端各敲一個小洞，使蛋清流出，調雞蛋清pH值為8，輕輕攪拌5分鐘，使其稠度均勻，用兩層紗布過濾，備用；
雞蛋清粗品分離:將上述過濾的蛋清量取100毫升邊緩慢攪拌邊加入等體積的去離子水，均勻后在不斷攪拌下用I摩爾/升的鹽酸溶液調PH值至7，用脫脂棉過濾，收取濾液，制得蛋清溶液，備用；
D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂層析:
1)D152樹脂處理:將D152樹脂先用蒸餾水洗去雜物，濾出，用I摩爾/升氫氧化鈉溶液浸泡，并攪拌6小時，抽濾，用蒸餾水洗至PH7.5，抽濾，再用I摩爾/升的鹽酸溶液，按上述I摩爾/升氫氧化鈉溶液處理樹脂的方法，直到全部轉變成氫型，抽濾，用蒸餾水洗至PH5.5，保持過夜，抽濾，再用2摩爾/升氫氧化鈉溶液按上述處理樹脂的方法，使之轉變為鈉型，pH值至6.5，吸干溶液，加pH6.5的0.02摩爾/升的磷酸鹽緩沖液平衡樹脂，制得樹脂懸浮液；
2)裝柱:取直徑1.6厘米，長度為30厘米的層析柱，自頂部注入經處理的樹脂懸浮液，關閉層析柱出口，待樹脂沉降后，放出過量的溶液，再加入樹脂懸浮液，至樹脂沉積至20厘米高度，于層析柱頂部繼續加入PH6.5的0.02摩爾/升磷酸鹽緩沖液平衡樹脂，使流出液pH為
6.5為止，關閉層析柱出口，保持液面高出樹脂表面I厘米；
3)上柱吸附:將上述蛋清溶液加到樹脂頂部，打開出口使其緩慢流入柱內，流速為I毫升/分鐘；
4)洗脫:用pH6.5的0.02摩爾/升的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，在收集洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計檢驗雜蛋白的洗脫情況，當基線開始走平后，改用含有1.0摩爾/升氯化鈉的PH值6.5的濃度為0.02摩爾/升磷酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液；
5)聚乙二醇濃縮:將上述洗脫液合并裝入透析袋內，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加蓋，酶液中的水被透析膜外的聚乙二醇所吸收，當濃縮到5毫升時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出濃縮液；
6)透析除鹽:蒸餾水透析除鹽24小時，制得雞蛋清粗品；
Sephadex G50分子篩柱層析:
1)裝柱:先將用20%乙醇保存的SephadexG50層析柱抽濾除去乙醇，用6克/升氯化鈉溶液攪拌Sephadex G50數分鐘，再抽濾，反復多次直至無醇味為止，加入膠體積1/4的6克/升氯化鈉溶液，充分攪拌，超聲除去氣泡，裝入I.6 X 50厘米的玻璃層析柱，柱床45厘米；
2)上樣:將上述制備的雞蛋清粗品加入層析柱； 3)洗脫:樣品流完后，先分次加入6克/升的氯化鈉溶液50毫升，洗脫柱壁上的樣品，連接恒流栗，使流速為0.5毫升/分鐘，用部分收集器收集，每10分鐘一管；
4)聚乙二醇濃縮:合并活性峰溶液，用聚乙二醇濃縮至5毫升時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出濃縮液；
5)透析除鹽:蒸餾水透析除鹽24小時，收集透析液，量取體積，制得溶菌酶，備用；
B、復合菌劑的制備:
制備所述吸水鏈霉菌的菌液、細黃鏈霉菌的菌液、金產色鏈霉菌的菌液的發酵方法:
a、斜面菌種活化培養:取高氏一號合成液體培養基，接入一種上述微生物的斜面培養物，27?28°C條件下在搖床上振蕩培養100小時，攪拌轉速為100轉/分，然后轉接到相同的培養基中培養，照此方法連續轉接3?5次，將獲得的培養液稀釋后涂布到平板固體培養基上，27?28°C條件下培養4?5天，待長出菌落后，挑取大菌落在同樣的固體平板培養基上劃線，挑選單菌落轉接到固體斜面培養基，培養得到馴化菌株，保存備用;b、二級搖瓶菌種培養:取高氏一號合成液體培養基，接入一級斜面菌種，于27?28 °C下培養100小時，攪拌轉速為100轉/分，得二級搖瓶種子液;根據生產規模，進一步采用種子罐進行種子的放大培養；
C、微生物菌液的發酵生產:取高氏一號合成液體培養基，接入上述制備的發酵種子液，于?!17.2?7.4、溫度27?28°C，發酵4?5天，即得，可作為生產菌液備用；
制備所述啤酒酵母菌的菌液、淡紫擬青霉菌的菌液、哈茨木霉菌的菌液的發酵方法:
a、斜面菌種活化培養:取I3DA液體培養基，接入一種上述微生物的斜面培養物，26?27°C條件下在搖床上振蕩培養60小時，攪拌轉速為100轉/分，然后轉接到相同的培養基中培養，照此方法連續轉接3?5次，將獲得的培養液稀釋后涂布到平板固體培養基上，26?27°C條件下培養3?5天，轉速為100轉/分，待長出粗壯菌絲后，挑取粗壯菌絲在同樣的固體平板培養基上劃線，挑選粗壯菌絲轉接到固體斜面培養基，培養得到馴化菌株，保存備用；
b、二級搖瓶菌種培養:取PDA液體培養基，接入一級斜面菌種，于26?27°C下培養60小時，攪拌轉速為100轉/分，得二級搖瓶種子液;根據生產規模，進一步采用種子罐進行種子的放大培養；
c、微生物菌液的發酵生產:取PDA液體培養基，接入上述制備的發酵種子液，于pH7.0?
7.2、溫度26?27°C發酵3?5天，即得，作為生產菌液備用；
制備所述乳酸鏈球菌的菌液、枯草芽孢桿菌的菌液、地衣芽孢桿菌的菌液的發酵方法:
a、斜面菌種活化培養:取牛肉膏蛋白胨液體培養基，接入一種上述微生物的斜面培養物，35 0C條件下在搖床上振蕩培養35小時，轉速為100轉/分，然后轉接到相同的培養基中培養，照此方法連續轉接3?5次，將獲得的培養液稀釋后涂布到平板固體培養基上，35°C條件下培養2天，轉速為100轉/分，待長出菌落后，挑取大菌落在同樣的固體平板培養基上劃線，挑選單菌落轉接到固體斜面培養基，培養得到馴化菌株，保存備用；
b、二級搖瓶菌種培養:取牛肉膏蛋白胨液體培養基，接入一級斜面菌種，于35°C下培養35小時，轉速為100轉/分，得二級搖瓶種子液;根據生產規模，進一步采用種子罐進行種子的放大培養；
C、微生物菌液的發酵生產:取牛肉膏蛋白胨液體培養基，接入上述制備的發酵種子液，于pH7.2?8.5、溫度35°C，發酵2天，即得，作為生產菌液備用； C、液態復合生物保鮮劑的制備:
按照如下的實施例所述復合菌劑的原料重量份配比，將上述B步驟制備的各種菌液混合，制成復合菌劑，經檢驗，使含總有效活菌數達2億個/毫升，每一種有效菌的數量不得少于2000萬個/毫升以上，符合國家標準GB-20287-2006，再按照如下的實施例所述的原料組分的重量份配比，將上述步驟制備的殼聚糖、ε_聚賴氨酸、溶菌酶與復合菌劑混合均勻，即得。
[0042]實施例1:由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖10份、ε -聚賴氨酸10份、溶菌酶10份、吸水鏈霉菌的菌液7.5份、細黃鏈霉菌的菌液7.5份、金產色鏈霉菌的菌液15份、乳酸鏈球菌的菌液15份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
[0043]實施例2:由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖20份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液10份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液1份、啤酒酵母菌的菌液6份、淡紫擬青霉菌的菌液6份、哈茨木霉菌的菌液6份。
[0044]實施例3:由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖7.5份、ε-聚賴氨酸20份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液10份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液1份、啤酒酵母菌的菌液5份、淡紫擬青霉菌的菌液5份、哈茨木霉菌的菌液5份。
[0045]實施例4:由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖7.5份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶20份、吸水鏈霉菌的菌液10份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
[0046]實施例5:由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖7.5份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液15份、細黃鏈霉菌的菌液15份、金產色鏈霉菌的菌液15份、乳酸鏈球菌的菌液15份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
[0047]實施例6:由如下重量份配比的原料組成:
殼聚糖7.5份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液10份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液15份、地衣芽孢桿菌的菌液15份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。
[0048]本發明實施例的液態復合生物保鮮劑的使用方法及對比試驗結果:
采用本發明實施例液態復合生物保鮮劑用于南果梨、軟棗獼猴桃或是草莓的水果保鮮，其使用方法是:將生物保鮮劑12?15倍稀釋后，浸涂水果5分鐘，在20?25°C溫度下自然瀝干，常溫貯存，經對比試驗結果如下:
南果梨、軟棗獼猴桃或草莓的失重率未使用組是生物保鮮劑使用組的3?4倍，使用組可以提高南果梨、軟棗獼猴桃或草莓近15?18天的貨架期，說明處理組保鮮效果非常明顯。
[0049]采用本發明實施例液態復合生物保鮮劑12?15倍稀釋在不同濃度下，將樣品整個浸入，10秒后取出，在20?25°C溫度下自然瀝干，對比試驗結果如下:
本發明實施例的液態復合生物保鮮劑對黑曲霉抑菌效果明顯，抑菌圈直徑在22mm以上;對腐敗細菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有明顯的抑制作用，抑菌圈均達到了 25mm以上。經過實施例的保鮮劑處理的多酚氧化酶活性高峰值比沒經處理的分別低20.6%?23.8%，從而阻止果實IC藏后期果實褐變的程度。
[0050]貯存到25天時，經實施例的液態復合生物保鮮劑處理的果實丙二醛含量為1.05μmol/g，而未經處理的丙二醛含量為1.44ymol/g，對比具有顯著的差別，說明保鮮劑處理有利于保持膜的完整性，進而維持果實的新鮮程度。
[0051]經實施例的液態復合生物保鮮劑處理的果實過氧化物酶為0.6U/mg，而未經處理的過氧化物酶為0.5U/mg，保鮮劑提高了酶的催化能力，阻止果實后熟和衰老。
[0052]經實施例的液態復合生物保鮮劑處理的果實過氧化氫酶為16.5U/mg，而未經處理的過氧化物酶為10.5U/mg，保鮮劑提高了過氧化物酶的催化能力，阻止果實的衰老。
【主權項】
1.一種液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成: 殼聚糖5?25份、ε-聚賴氨酸5?25份、溶菌酶5?25份、吸水鏈霉菌的菌液5?20份、細黃鏈霉菌的菌液5?20份、金產色鏈霉菌的菌液5?20份、乳酸鏈球菌的菌液5?20份、枯草芽孢桿菌的菌液5?20份、地衣芽孢桿菌的菌液5?20份、啤酒酵母菌的菌液5?20份、淡紫擬青霉菌的菌液5?20份、哈茨木霉菌的菌液5?20份。2.根據權利要求1所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成: 殼聚糖7?20份、ε-聚賴氨酸7?20份、溶菌酶7?20份、吸水鏈霉菌的菌液5?15份、細黃鏈霉菌的菌液5?15份、金產色鏈霉菌的菌液5?15份、乳酸鏈球菌的菌液5?15份、枯草芽孢桿菌的菌液5?15份、地衣芽孢桿菌的菌液5?15份、啤酒酵母菌的菌液5?15份、淡紫擬青霉菌的菌液5?15份、哈茨木霉菌的菌液5?15份。3.根據權利要求1或2所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成: 殼聚糖1份、ε -聚賴氨酸1份、溶菌酶1份、吸水鏈霉菌的菌液7.5份、細黃鏈霉菌的菌液7.5份、金產色鏈霉菌的菌液15份、乳酸鏈球菌的菌液15份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。4.根據權利要求1或2所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成: 殼聚糖20份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液10份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液1份、啤酒酵母菌的菌液6份、淡紫擬青霉菌的菌液6份、哈茨木霉菌的菌液6份。5.根據權利要求1或2所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成: 殼聚糖7.5份、ε -聚賴氨酸20份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液1份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液1份、啤酒酵母菌的菌液5份、淡紫擬青霉菌的菌液5份、哈茨木霉菌的菌液5份。6.根據權利要求1或2所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成: 殼聚糖7.5份、ε -聚賴氨酸7.5份、溶菌酶20份、吸水鏈霉菌的菌液1份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。7.根據權利要求1或2所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成: 殼聚糖7.5份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液15份、細黃鏈霉菌的菌液15份、金產色鏈霉菌的菌液15份、乳酸鏈球菌的菌液15份、枯草芽孢桿菌的菌液1份、地衣芽孢桿菌的菌液10份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。8.根據權利要求1或2所述的液態復合生物保鮮劑，其特征在于，它是由如下重量份配比的原料組成: 殼聚糖7.5份、ε-聚賴氨酸7.5份、溶菌酶7.5份、吸水鏈霉菌的菌液10份、細黃鏈霉菌的菌液1份、金產色鏈霉菌的菌液1份、乳酸鏈球菌的菌液1份、枯草芽孢桿菌的菌液15份、地衣芽孢桿菌的菌液15份、啤酒酵母菌的菌液7.5份、淡紫擬青霉菌的菌液7.5份、哈茨木霉菌的菌液7.5份。9.一種權利要求1?8所述的液態復合生物保鮮劑的制備方法，其特征在于如下步驟: A、殼聚糖、ε_聚賴氨酸、溶菌酶的制備方法: a、殼聚糖的制備方法: 稱取蝦殼25克，加I摩爾/升的鹽酸溶液250毫升，攪拌，靜置12小時，過濾，棄去濾液;加5%氫氧化鈉溶液，至固液比1:8，攪拌，隔水煮I小時，過濾，得甲殼質，烘干，粉碎，備用； 取5克甲殼質粉于三口瓶中，加45%氫氧化鈉溶液100毫升，于110?120°C攪拌反應I小時，冷卻，離心，移去上清液，水洗沉淀，再離心，再移去上清液，水洗沉淀，再移去上清液，以95%乙醇洗滌沉淀，倒入抽濾瓶中，抽濾，留濾餅，制得殼聚糖，晾干，備用重； b、ε-聚賴氨酸的制備方法: 將菌種編號為4.121的白色鏈霉菌(Streptomyces &113111118)接種于含有5%甘油、1%硫酸銨、0.5%酵母浸膏、0.05%七水硫酸鎂、0.003%七水硫酸亞鐵、0.004%七水硫酸鋅，pH為6.8的液體培養基中，30°C溫度下，連續培養48小時，得到含量為0.38克/升的ε-聚賴氨酸，備用； C、溶菌酶的制備方法: 蛋清的制備:將4?5個新鮮的雞蛋兩端各敲一個小洞，使蛋清流出，調雞蛋清pH值為8，輕輕攪拌5分鐘，使其稠度均勻，用兩層紗布過濾，備用； 雞蛋清粗品分離:將上述過濾的蛋清量取100毫升邊緩慢攪拌邊加入等體積的去離子水，均勻后在不斷攪拌下用I摩爾/升的鹽酸溶液調PH值至7，用脫脂棉過濾，收取濾液，制得蛋清溶液，備用； D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂層析: 1)D152樹脂處理:將D152樹脂先用蒸餾水洗去雜物，濾出，用I摩爾/升氫氧化鈉溶液浸泡，并攪拌4?8小時，抽濾，用蒸餾水洗至PH7.5，抽濾，再用I摩爾/升的鹽酸溶液按上述I摩爾/升氫氧化鈉溶液處理樹脂的方法，直到全部轉變成氫型，抽濾，用蒸餾水洗至PH5.5，保持過夜，抽濾，用2摩爾/升氫氧化鈉溶液按上述處理樹脂的方法，使之轉變為鈉型，pH值至6.5，吸干溶液，加pH6.5的0.02摩爾/升的磷酸鹽緩沖液平衡樹脂，制得樹脂懸浮液； 2)裝柱:取直徑1.6厘米，長度為30厘米的層析柱，自頂部注入經處理的樹脂懸浮液，關閉層析柱出口，待樹脂沉降后，放出過量的溶液，再加入樹脂懸浮液，至樹脂沉積至15?20厘米高度，于層析柱頂部繼續加入pH6.5的0.02摩爾/升磷酸鹽緩沖液平衡樹脂，使流出液pH為6.5為止，關閉層析柱出口，保持液面高出樹脂表面I厘米； 3)上柱吸附:將上述蛋清溶液加到樹脂頂部，打開出口使其緩慢流入柱內，流速為I毫升/分鐘； 4)洗脫:用pH6.5的0.02摩爾/升的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，在收集洗脫液的過程中，逐管用紫外分光光度計檢驗雜蛋白的洗脫情況，當基線開始走平后，改用含有1.0摩爾/升氯化鈉的PH值6.5的濃度為0.02摩爾/升磷酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液； 5)聚乙二醇濃縮:將上述洗脫液合并裝入透析袋內，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加蓋，酶液中的水被透析膜外的聚乙二醇所吸收，當濃縮到5毫升時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出濃縮液； 6)透析除鹽:蒸餾水透析除鹽24小時，制得雞蛋清粗品； Sephadex G50分子篩柱層析: 1)裝柱:先將用20%乙醇保存的SephadexG50層析柱抽濾除去乙醇，用6克/升氯化鈉溶液攪拌Sephadex G50數分鐘，再抽濾，反復多次直至無醇味為止，加入膠體積1/4的6克/升氯化鈉溶液，充分攪拌，超聲除去氣泡，裝入I.6 X 50厘米的玻璃層析柱，柱床45厘米； 2)上樣:將上述制備的雞蛋清粗品加入層析柱； 3)洗脫:樣品流完后，先分次加入6克/升的氯化鈉溶液50毫升，洗脫柱壁上的樣品，連接恒流栗，使流速為0.5毫升/分鐘，用部分收集器收集，每10分鐘一管； 4)聚乙二醇濃縮:合并活性峰溶液，用聚乙二醇濃縮至5毫升時，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，取出濃縮液； 5)透析除鹽:蒸餾水透析除鹽24小時，收集透析液，量取體積，制得溶菌酶，備用； B、復合菌劑的制備: 制備所述吸水鏈霉菌的菌液、細黃鏈霉菌的菌液、金產色鏈霉菌的菌液的發酵方法:a、斜面菌種活化培養:取高氏一號合成液體培養基，接入一種上述微生物的斜面培養物，27?28°C條件下在搖床上振蕩培養96?120小時，攪拌轉速為60?120轉/分，然后轉接到相同的培養基中培養，照此方法連續轉接3?5次，將獲得的培養液稀釋后涂布到平板固體培養基上，27?28°C條件下培養4?5天，待長出菌落后，挑取大菌落在同樣的固體平板培養基上劃線，挑選單菌落轉接到固體斜面培養基，培養得到馴化菌株，保存備用;b、二級搖瓶菌種培養:取高氏一號合成液體培養基，接入一級斜面菌種，于27?28 °C下培養96?120小時，攪拌轉速為60?120轉/分，得二級搖瓶種子液;根據生產規模，進一步采用種子罐進行種子的放大培養； c、微生物菌液的發酵生產:取高氏一號合成液體培養基，接入上述制備的發酵種子液，于?!17.2?7.4、溫度27?28°C，發酵4?5天，即得，可作為生產菌液備用； 制備所述啤酒酵母菌的菌液、淡紫擬青霉菌的菌液、哈茨木霉菌的菌液的發酵方法: a、斜面菌種活化培養:取PDA液體培養基，接入一種上述微生物的斜面培養物，25?28°C條件下在搖床上振蕩培養48?72小時，攪拌轉速為60?120轉/分，然后轉接到相同的培養基中培養，照此方法連續轉接3?5次，將獲得的培養液稀釋后涂布到平板固體培養基上，25?28 °C條件下培養3?5天，轉速為60?120轉/分，待長出粗壯菌絲后，挑取粗壯菌絲在同樣的固體平板培養基上劃線，挑選粗壯菌絲轉接到固體斜面培養基，培養得到馴化菌株，保存備用； b、二級搖瓶菌種培養:取PDA液體培養基，接入一級斜面菌種，于25?28°C下培養48?72小時，攪拌轉速為60?120轉/分，得二級搖瓶種子液;根據生產規模，進一步采用種子罐進行種子的放大培養； C、微生物菌液的發酵生產:取I3DA液體培養基，接入上述制備的發酵種子液，于PH7.0?7.2、溫度25?28°C發酵3?5天，即得，作為生產菌液備用； 制備所述乳酸鏈球菌的菌液、枯草芽孢桿菌的菌液、地衣芽孢桿菌的菌液的發酵方法: a、斜面菌種活化培養:取牛肉膏蛋白胨液體培養基，接入一種上述微生物的斜面培養物，30?40°C條件下在搖床上振蕩培養20?48小時，轉速為60?120轉/分，然后轉接到相同的培養基中培養，照此方法連續轉接3?5次，將獲得的培養液稀釋后涂布到平板固體培養基上，30?40°C條件下培養I?2天，轉速為60?120轉/分，待長出菌落后，挑取大菌落在同樣的固體平板培養基上劃線，挑選單菌落轉接到固體斜面培養基，培養得到馴化菌株，保存備用； b、二級搖瓶菌種培養:取牛肉膏蛋白胨液體培養基，接入一級斜面菌種，于30?40°C下培養20?48小時，轉速為60?120轉/分，得二級搖瓶種子液;根據生產規模，進一步采用種子罐進行種子的放大培養； C、微生物菌液的發酵生產:取牛肉膏蛋白胨液體培養基，接入上述制備的發酵種子液，于?!17.2?8.5、溫度30?40°C，發酵I?2天，即得，作為生產菌液備用； C、液態復合生物保鮮劑的制備: 按照權利要求1?8所述復合菌劑的原料重量份配比，將上述B步驟制備的各種菌液混合，制成復合菌劑，經檢驗，使含總有效活菌數達2億個/毫升，每一種有效菌的數量不得少于2000萬個/毫升以上，符合國家標準GB-20287-2006，再按照權利要求1?8所述的原料組分的重量份配比，將上述步驟制備的殼聚糖、ε_聚賴氨酸、溶菌酶與復合菌劑混合均勻，即得。10.—種權利要求1?8所述的液態復合生物保鮮劑的用途，其特征在于，它作為果品保鮮劑應用于南果梨、野生軟棗獼猴桃或草莓。
【文檔編號】A23B7/155GK105875820SQ201610222937
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月12日
【發明人】王禹博
【申請人】鞍山禾瑞生物科技有限公司