專利名稱：：一種改進的固定化青霉素g酰基轉移酶的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種改進的固定化青霉素G酰基轉移酶。此外，本發明涉及運用所說的固定化酶通過母體氨基β-內酰胺核和相應的酰化劑的酶促酰化作用制備β-內酰胺抗生素的方法。
背景技術：
：和領域從下列文獻已知通過用活化的側鏈酸衍生物(例如酰胺或酯)酰化母體氨基β-內酰胺部分酶促制備半合成β-內酰胺抗生素的方法荷蘭專利158847、歐洲專利申請339751和473008、國際專利申請WO92/01061和WO93/12250、美國專利3816253和西德專利文獻2163792和2621618。本領域使用的酶在大多數情況下是來源于大腸桿菌的青霉素酰基轉移酶，并且固定化在各種類型的水-不溶性材料上。用于產生阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢羥氨芐、頭孢氨芐和頭孢拉定的已知酶促方法的弊端是由于固定化酶的選擇性引起的高成本。所說的固定化酶能夠縮合活化的側鏈衍生物和氨基β-內酰胺，側鏈衍生物例如D(-)-苯基甘氨酸酰胺(PGA)、D(-)-苯基甘氨酸甲酯(PGM)、D(-)-4-羥苯基甘氨酸酰胺(HPGA)、D(-)-4-羥苯基甘氨酸甲酯(HPGM)、D(-)-2，5-二氫-苯基甘氨酸酰胺(DPGA)和D(-)-2，5-二氫-苯基甘氨酸甲酯(DPGM)；氨基β-內酰胺例如6-氨基-青霉烷酸、(6-APA)、7-氨基頭孢菌酸(7-ACA)、7-氨基-3-氯-3-頭孢烯-4-羧酸(7-ACCA)、7-氨基脫乙酰氧基頭孢菌酸(7-ADCA)和7-氨基-3-[(Z)-1-丙烯基]-3-頭孢烯-4-羧酸。另一方面，所說的固定化酶也將活化的側鏈衍生物水解成無價值的側鏈酸，也將所需產物水解形成側鏈酸和母體氨基β-內酰胺，合成和水解之間的高比率會降低活化的側鏈衍生物的成本。從國際專利申請WO93/12250已知，經固定化在EupergitPCA上的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶的頭孢羥氨芐和頭孢氨芐合成的合成/水解比率強烈地依賴于反應條件，如pH、反應物濃度和溫度。然而沒有指出載體材料的性質對合成/水解比率的影響。從歐洲專利222462已知，通過將氨基聚合物(例如藻酸胺、脫乙酰殼多糖果膠或聚乙烯亞胺)添加到載體的基質膠凝成分上，可以把氨基引入到載體材料上。令人驚奇地是，現已發現就活化的側鏈衍生物與氨基β-內酰胺的縮合反應中的合成/水解比率而言，在由膠凝劑和包含游離氨基基團的聚合物組成的載體上固定化大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶使得酶促催化劑與固定在其它載體上的青霉素G酰基轉移酶比較具有良好的特性。發明概要本發明提供了在由膠凝劑和包含游離氨基基團的聚合物組成的載體上固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶。優選地，聚合物選自藻酸胺、脫乙酰殼多糖、果膠或聚乙烯亞胺；更優選地，膠凝劑是明膠。此外，本發明提供了通過使用這樣的固定化酶經母體氨基β-內酰胺和相應的酰化劑的酶促反應制備β-內酰胺衍生物的改進的方法。特定實施方案可以由本發明的方法產生的β-內酰胺衍生物的例子是阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢羅齊、頭孢氨芐和頭孢拉定。酰基轉移酶活性不依賴于頭孢烯化合物3-位上的取代基，例如氫、鹵素、(低級)烷氧基、甲基或由例如以下基團取代的甲基(低級)烷氧基、(低級)烷酰氧基、鹵素、S-R5(其中R5是(低級)烷基、(低級)烷酰基或者取代或未取代的雜環)，N+-R6(其中R6是(低級)烷基或者取代的或未取代的雜環)。低級意指1-6個碳原子。雜環定義為包含至少一個氮、硫或氧原子的不飽和環狀結構。酰化劑可以是D(-)-苯基-甘氨酸衍生物、D-(-)-4-羥苯基甘氨酸衍生物或D-2，5-二氫-苯基甘氨酸衍生物，如低級烷基(甲基、乙基、正丙基或異丙基)酯或在-CONH2基團上取代的酰胺。相應的氨基β-內酰胺含有與所制備的β-內酰胺衍生物相同的β-內酰胺核。一般地，本發明的方法的反應溫度可以在0℃到35℃之間變化。最佳溫度取決于在歐洲專利申請473008中提到的底物，在給出的比較實施例中沒有最佳化。合適的pH值取決于底物的性質和濃度，典型地在5到9的范圍內。為了方便操作，使用pH對照。合適的反應時間從若干分鐘到若干小時，特別是從30分鐘到3小時。在涉及使用催化劑(例如酶)的商業方法中，在方法的總的經濟學上催化劑的價格常常是一個重要的參數。在這樣的情況下，催化劑能夠再使用而不喪失催化活性是有利的。總之，具有以可再用形式的酶(例如，固定化的或截留形式的)是有利的。研究了以下固定化的大腸桿菌青霉素酰基轉移酶A型如國際專利申請WO92/12782中所描述的方法分離大腸桿菌青霉素酰基轉移酶。如歐洲專利申請222462中所描述的方法進行固定化。B型市售的來源于Recordati，意大利的固定化大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶，如歐洲專利申請473008中所描述的。C型市售的來源于BoehringerMannheimGmbH，德國的固定化大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶，稱為Enzygel。合適的酶濃度可以從0.1U·ml-1到100U·ml-1(1U＝一個單位酶活性，參見以下)。使用按照本發明的方法，可以獲得特別高的合成/水解比率。定義和分析方法酶活性就青霉素G酰基轉移酶活性的限定而言，使用了以下定義一個單位(U)相當于在標準條件(100g.1-1青霉素G鉀鹽，0.05M磷酸鉀緩沖液，pH8.0，28℃)下每分鐘水解1μmole青霉素G的酶量。HPLC分析方法A(阿莫西林)樣品用在2mM磷酸鉀緩沖液(pH5)中的25％乙腈1∶10稀釋柱ChromsphereC18，5μm(100×3.0mm)溶劑在包含0.2％十二烷基硫酸鈉的12mM磷酸鉀緩沖液(pH2.6)中的25％乙腈流速1ml·分鐘-1檢測波長214nm保留時間HPG(1.9分鐘)；HPGA(3.1分鐘)；6-APA(3.4分鐘)；阿莫西林(4.8分鐘)；HPGM(7.3分鐘)方法B(頭孢氨芐)樣品用在2mM磷酸鉀緩沖液中的25％乙腈(pH5)1∶10稀釋柱ChromsphereC18，5μm(100×3.0mm)溶劑在包含0.2％十二烷基硫酸鈉的12mM磷酸鉀緩沖液(pH3.1)中的29％乙腈，流速1ml·分鐘1檢測波長214nm保留時間PG(0.8分鐘)；7-ADCA(1.3分鐘)；PGA(3.7分鐘)；頭孢氨芐(6，2分鐘)；PGM(7.8分鐘)方法C(頭孢拉定)樣品用在50mM磷酸緩沖液(pH3.0)中的3％1-丙醇1∶150稀釋，柱Nucleosil1203C18(250×4.0mm)溶劑洗脫液A50mM磷酸緩沖液，pH3.0；洗脫液B50％洗脫液A，50％乙腈梯度0-5分鐘100％A；5-10分鐘從100％A到70％A；10-18分鐘70％A；18-18.1分鐘從70％A到100％A。流速1ml·分鐘1檢測波長220nm保留時間7-ADCA(5.3分鐘)；DPG(6.0分鐘)；DPGA(9.1分鐘)；DPGM(15.9分鐘)；頭孢拉定(18.5分鐘)方法D(頭孢克洛)樣品用在50mM磷酸緩沖液(pH3.0)中的3％1-丙醇1∶150稀釋，柱Nucleosil1203C18(250×4.0mm)溶劑洗脫液A50mM磷酸緩沖液，pH3.0；洗脫液B50％洗脫液A，50％乙腈梯度0-5分鐘100％A；5-10分鐘從100％A到70％A；10-18分鐘70％A；18-18.1分鐘從70％A到100％A。流速1ml·分鐘1檢測波長220nm保留時間7-ACCA(3.2分鐘)；PG(3.8分鐘)；PGA(5.6分鐘)；頭孢克洛(14.9分鐘)方法E(氨芐青霉素)樣品用在3.4mM磷酸鉀緩沖液(pH6.9)中的33％乙腈1∶200稀釋柱ChromsphereC18，5μm(100×3.0mm)溶劑在包含0.1％十二烷基硫酸鈉的5mM磷酸鉀緩沖液(pH3.0)中的30％乙腈，流速1ml·分鐘1檢測波長214nm保留時間PG(1.0分鐘)；6-APA(1.3分鐘)；PGA(2.6分鐘)；氨芐青霉素(4.5分鐘)PGM(5.8分鐘)實施例1采用固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶從6-APA和HPGA合成阿莫西林在21℃下，向含有10mMHPGA和30mM6-APA的水溶液(50ml)中添加50U固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶。將pH調節至6.0，用0.05M硫酸水溶液控制pH值，使反應在氮氣氛圍下進行。在不同的時間間隔(參見下表)按照以上所述的方法A分析各樣品。從由此獲得的結果計算合成/水解(S/H)摩爾比率。表1.1采用A型酶合成阿莫西林表1.2采用B型酶合成阿莫西林</tables>表1.3采用C型酶合成阿莫西林實施例2采用固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶從6-APA和HPMG合成阿莫西林在21℃下，向含有10mMHPGM和30mM6-APA的水溶液(50ml)中添加50U固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶。將pH調節至6.0，用0.05M硫酸水溶液控制pH值，使反應在氮氣氛圍下進行。在不同的時間間隔(參見下表)按照以上所述的方法A分析各樣品。從由此獲得的結果計算合成/水解(S/H)摩爾比率。</tables>表2.1采用A型酶合成阿莫西林實施例3采用固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶從7-ADCA和PGA合成頭孢氨芐在21℃下，向含有10mMPGA和30mM7-ADCA的水溶液(50ml)中添加50U固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶。將pH調節至7.0，用0.05M硫酸水溶液控制pH值，使反應在氮氣氛圍下進行。在不同的時間間隔(參見下表)按照以上所述的方法B分析各樣品。從由此獲得的結果計算合成/水解(S/H)摩爾比率。</tables>表3.1采用A型酶合成頭孢氨芐</tables>表3.2采用B型酶合成頭孢氨芐實施例4采用固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶從7-ADCA和DPGM.HCl合成頭孢拉定向含有300mMDPGM·HCl和300mM7-ADCA的水溶液(120ml)中添加固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶(單位在表中給出)。將pH調節至下表中給出的值，使反應在氮氣氛圍下進行。在不同的時間間隔按照以上所述的方法C分析各樣品。從由此獲得的結果計算合成/水解(S/H)摩爾比率表4.1采用B型酶(33U·ml-1)在pH7.0下合成頭孢拉定實施例5采用固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶從7-ACCA和PGA合成頭孢克洛向含有PGA和7-ACCA的水溶液(120ml)中添加固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶(濃度和酶單位在下表中給出)。將pH調節至7.7，用2.0M硫酸水溶液控制pH值，使反應進行。在不同的時間間隔(參見下表)按照以上所述的方法D分析各樣品。從由此獲得的結果計算合成/水解(S/H)摩爾比率表5.1采用A型酶(9U·ml-1)從PGA(0.5M)和7-ACCA(0.6M)合成頭孢克洛</tables>表5.2采用B型酶(47U·ml-1)從PGA(0.6M)和7-ACCA(0.6M)合成頭孢克洛實施例6采用固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶從6-APA和PGA合成氨芐青霉素向含有500mMPGA和300mM6-APA的水溶液(100ml)中添加100U固定化的大腸桿菌青霉素G酰基轉移酶。將pH調節至7.5，用6.0M鹽酸水溶液控制pH值，使反應進行。在不同的時間間隔(參見下表)按照以上所述的方法E分析各樣品。從由此獲得的結果計算合成/水解(S/H)摩爾比率，在下表中顯示。</tables>表6.1.1采用A型酶合成氨芐青霉素(在使用聚合物藻酸胺時)</tables>表6.1.2采用A型酶合成氨芐青霉素(在使用聚合物脫乙酰殼多糖時)</tables>表6.1.3采用A型酶合成氨芐青霉素(在使用聚合物果膠時)表6.1.4采用A型酶合成氨芐青霉素(在使用聚合物聚乙烯亞胺時)表6.2采用B型酶合成氨芐青霉素表6.3采用C型酶合成氨芐青霉素權利要求1.在載體上固定化的青霉素G酰基轉移酶，所說的載體包含膠凝劑和含有游離氨基基團的聚合物。2.按照權利要求1的青霉素G酰基轉移酶，其中所說的聚合物選自藻酸鹽胺、脫乙酰殼多糖、果膠或聚乙烯酰胺。3.按照權利要求1或2的青霉素G酰基轉移酶，其中所說的膠凝劑是明膠。4.按照以上任一權利要求的青霉素G酰基轉移酶，其中所使用的酶來源于大腸桿菌(Escherichiacoli)、巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianum)、柑橘黃單胞菌(Xanthomonascitrii)、嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌(Kluyveracitrophila)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)或糞產堿菌(Alcaligenesfaecalis)。5.使用固定化酶通過母體氨基β-內酰胺和相應的酰化劑的酶促反應制備β-內酰胺衍生物的方法，其特征在于使用權利要求1-4之任一所限定的酶。6.按照權利要求5的方法，其中所說的酰化劑選自D-苯基甘氨酸衍生物、D-對-羥苯基甘氨酸衍生物和D-2，5-二氫-苯基甘氨酸衍生物。7.按照權利要求5或6的方法，其中形成的β-內酰胺衍生物選自氨芐青霉素、阿莫西林、頭孢克洛、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢拉定和頭孢羅齊。8.按照權利要求5-7之任一的方法，其中所說的反應是在從約0到約35℃的溫度范圍內，優選地是在高于約10℃的溫度下進行的。9.按照權利要求5-8之任一的方法，其中所說的反應是在從約5到約9的pH值范圍內進行的。全文摘要提供了一種具有令人驚奇的良好性能的新固定化青霉素G酰基轉移酶。運用這種固定化酶通過母體氨基β－內酰胺和相應的酰化劑的酶促反應,可以高產率地制備β－內酰胺衍生物。文檔編號C12N11/02GK1190990SQ96195543公開日1998年8月19日申請日期1996年7月16日優先權日1995年7月18日發明者E·德弗魯姆申請人:吉斯特·布羅卡迪斯股份有限公司被以下專利引用(1),