專利名稱：高效表達乙肝表面抗原的轉基因細胞系的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可用于擴增的谷氨酰胺合成酶基因，是一種高效表達乙肝表面抗原的轉基因細胞系，屬于生物技術基因表達或遺傳工程領域。
乙型肝炎病毒(HBV)是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常見病因。我國是乙型肝炎的高發區，有50-70％的人群感染過乙肝，8-10％的人群(約一億人)為帶毒者。目前還沒有治療乙肝的有效方法，接種乙肝疫苗是預防肝炎的有效措施。
血源疫苗已投入生產使用，但不能滿足普遍的預防接種的需要。由于血源疫苗存在一些問題，如血源有限、帶有肯定的潛在性危險(包括丙肝、艾滋病等)，因此需要急切研究基因工程疫苗。美國Merck公司研制的酵母基因工程乙肝疫苗早在1986年就獲得FDA的批準而投入生產。我國利用哺乳動物細胞表達的乙肝基因工程疫苗也獲準生產，但用于生產的細胞株的表達水平與酵母系統的表達水平相比，仍相對較低。哺乳動物細胞分泌的HBsAg顆粒具有免疫原性強、抗原提純簡單和適于連續性大規模的培養的優點。為此有必要發展新的高表達細胞系，以進一步提高乙肝病毒表面抗原在哺乳動物細胞中表達水平。近年來，乙肝基因工程疫苗特別是乙肝表面抗原蛋白在哺乳動物細胞中表達的研究主要獲得以下進展自1980年，Debois(1)等首先報道使用雙拷貝HBV初級克隆質粒轉化小鼠LTK-細胞成功表達HBsAg以來，由于哺乳動物細胞具有分泌、糖化、可連續培養的優點，國內外學者應用基因工程技術在哺乳動物細胞中表達HBsAg方面作了大量的工作。為了提高HBsAg在哺乳動物細胞中的表達水平，早期表達HBsAg時，主要應用HBV自身的啟動子，進而使用SV40早期啟動子、攝金蛋白(metallothionein)啟動子等功能更強的啟動子(2-6)。在轉化選擇標記方面，先后使用過HSV-tk、m-dhfr、Neo、Eco-gpt、mMT(1-3、5-8)等。在擴增基因方面，主要使用了m-dhfr(2-4)和BPV(5，6，9)，都獲得了較好的擴增效果。在表達的宿主方面，小鼠LTK-細胞(1)、小鼠乳頭瘤C-127細胞(5，6)、小鼠NIH3T3細胞(9)，綠猴Vero細胞(10-12)，CV-1細胞(8)，COS細胞[13，14]和中華地鼠卵巢細胞二氫葉酸還原酶缺失型(CHOdhfr-[2，15]等傳代細胞都獲得不同程度表達HBsAg的細胞系。
在國內，1983年阮力等首先報道(16)分別用ayw和adw亞型的乙肝病毒HBV全基因組表達質粒，與HSV-tk基因一起導入LTK-細胞。
基重組質粒的特點是乙肝表面抗原基因由本身啟動子的調控，而選擇基因HSV-tk基因存在于另一質粒中。兩種質粒必須共轉化才能選出陽性克隆。
表達系統采用缺失胸苷激酶基因的營養缺陷型小鼠傳代細胞(LTK-)作為其表達系統。
用AUSRIA試劑盒檢測細胞培養液中的HBSAg表達量為2.5ug/106細胞/瓶。
免疫電鏡可見到22nm的HBsAg。
1985年，任貴方等報道(3)，分別用HBVayw亞型和adr亞型基因組DNA BglII片段構建成四種表達乙肝表面抗原的重組質粒。
此四種重組質粒的特點是乙肝病毒表面抗原受其本身的啟動子的調控，而二氫葉酸還原酶(dhfr)基因受SV40早期啟動子的調控。
表達系統采用缺失胸苷激酶基因的營養缺陷型小鼠傳代細胞(LTK-)作為宿主細胞，用AUSRIA試劑盒檢測細胞培養液中的HBsAg分泌量為12.5ug/107細胞/天。
1991年，任貴方等報道(17)，用adr亞型的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)主蛋白基因構建重組質粒(pSV2DHBR1-327.2Kb)。
此重組質粒的特點是含有兩個SV40啟動子，乙肝表面抗原受SV40早期啟動子的控制，而dbhfr基因受另一個SV40啟動子的調控，且乙肝表面抗原基因在前，dhfr基因在后。
表達系統任貴方等采用二氫葉酸還原酶(dhfr)基因缺陷型的中國地鼠卵巢細胞(CHOdhfr-)作為其表達系統的宿主細胞。
表達產物的檢測1)電鏡下觀察，可見22nm大小的HBsAg顆粒。
2)SDS-PAGE電泳顯示可見到23KD，27KD，30KD三條蛋白帶。
3)用AUSIA試劑盒檢測細胞培養液中HBsAg的表達產量，其中一株細胞B43細胞系的表達產量為3.75ug/105細胞/2天。此細胞株即我國已批準用于生產的表達HBsAg的高效表達細胞系。
以上所介紹的乙肝病毒表面抗原主蛋白基因在哺乳動物細胞中的表達雖然取得較大的進展，特別是任貴方等所作的工作得到了可用于生產的細胞株，表達產量也是在現有報導中最高的。但在表達乙肝表面抗原重組質粒的構建及其表達系統的選擇方面存在以下不足(一)、研究表明，質粒結構中調控表達外源基因啟動子的強弱直接影響到基因表達的水平，早期表達HBsAg時，主要應用HBV自身的啟動子，進而使用SV40早期啟動子、攝金蛋白(Metallothionein)啟動子等功能理更強的啟動子，分子生物學的發展，發現了越來越多的功能更強的啟動子，經我們比較研究后得出結論巨細胞病毒立即早期啟動子(CMV-IE)的強度遠較SV40早期啟動子、攝金蛋白(Metallothionein)啟動子等強，因此采用CMV-IE啟動子構建表達乙肝表面抗原主蛋白的表達質粒就成為本發明的目的之一。
(二)、表達系統的選擇即選擇何種基因作擴增選擇基因是影響基因表達水平的重要因素之一。在現有報導的表達HBsAg的文獻中，主要使用m-dhfr(2-4)和BPV[5，6，9]作擴增選擇基因，但都存在這樣或那樣的不足，故得到的細胞株的表達水平不很高。谷氨酰胺合成酶(GS)基因是最近幾年來發展起來的可作為擴增選擇標記基因之一，具有較高的表達效率(18)。選擇此基因作重組質粒的擴增選擇標記基因表達HBsAg就成為本發明的目的之一。
(三)、現能夠用于生產的表達HBsAg的宿主細胞主要是CHOdhfr-細胞株，是CHO-K1細胞株經基因誘變后得到二氫葉酸還原酶基因缺失型細胞株。CHO-K1細胞是二氫葉酸還原酶(dhfr)基因非缺失型細胞，生長狀態較CHOdhfr-細胞更好，因此，選用生長狀態更好的CHO-K1細胞作為此表達HBsAg的宿主細胞是本發明的目的之一。
1、本發明的實施方案中，首先從CHOdhfr-細胞中克隆了此細胞的谷氨酰胺合成酶(GS)基因，此基因與公開發表的CHO-K1細胞來源的GS基因(19)相比較，其895位的堿基由鳥嘌呤G變為胞嘧啶C，相應的299位氨基酸由甘氨酸變為精氨酸，此基因較CHO-K1細胞來源的GS基因具有更高的擴增效率。利用此基因作為重組質粒的擴增基因和選擇標記基因。組建表達乙肝病毒表面抗原S基因的重組質粒PMSG，在此質粒結構中采用的調控乙肝病毒表面抗原表達的啟動子是0.75kb大小的CMV-IE立即早斯啟動子，此啟動子調控HBsAg的表達能力較SV40早期啟動子，LTR啟動子強，而用SV40早期啟動子調控谷氨酰胺合成酶基因(GS)，且CMV立即早期啟動子調控乙肝病毒表面抗原S基因在前，SV40早期啟動子調控GS基因在后。在質粒結構中，采用HBVadr亞型基因組xhoI-BgII亞片段，此片段含有乙肝病毒基因組表面抗原S蛋白基因編碼區，乙肝病毒基因組增強子，(Eh1)和增強子(Eh2)，X基因，乙肝病毒S蛋白具有豐富的抗原決定簇，免疫原性好，是既能與人多聚白蛋白結合又能分泌的區域。Eh1和Eh2及X蛋白均有提高啟動子轉錄活性的作用。而HBVadr亞型是中國流行的主要亞型。
此質粒的優點是GS基因作為擴增和選擇基因，在其特異性抑制劑MSX的作用下，在細胞內能夠擴增，細胞內基因拷貝數可達幾千拷貝。由于GS基因的擴增能夠帶動其周圍乙肝病毒表面抗原基因的擴增，細胞內乙肝病毒表面抗原基因拷貝數的增加大大提高了HBsAg的表達產量。本發明所克隆的GS基因的擴增效率較dhfr基因的擴增效率高。用CHO-K1細胞作為此重組質粒表達的宿主細胞，CHO-K1細胞是二氫葉酸還原酶(dhfr)基因非缺失型中國地鼠卵巢細胞，生長狀態較(CHOdhfr-細胞更好，更適于在無血清的培養基中增養，便于表達產物的純化。此外，此細胞既可貼壁生長，又可懸浮生長，適于大規模連續培養。
4、用此重組質粒轉化CHO-K1細胞后，在谷氨酰胺合成酶抑制劑(MSX)壓力下，谷氨酰胺合成酶基因擴增，帶動乙肝病毒表面抗原基因擴增，最終篩選到一株能高效分泌乙肝病毒表面抗原S蛋白的細胞系G4，其表達產量較我們利用dhfr基因擴增系統得到的高表達細胞系B43表達水平提高一倍以上。
下面結合說明書實施例附圖和表格對本發明進行詳細說明例一、從CHOdhfr-細胞中克隆谷氨酰胺合成酶(GS)基因圖1說明GS基因的克隆及重組質粒PSV2-GS的構建。
將CHOdhfr-細胞在無谷氨酰胺的DMEM培養液中傳代，并逐步增加培養液中MSX的濃度至10uM，以誘導細胞內源性GS基因的表達，提高細胞內mRNA的產量。參照已發表的CHO-K1細胞的GS基因序列，設計PCR引物，利用逆轉錄-PCR法從CHOdhfr-細胞中克隆GS基因。
GS基因全序列分析結果表明，與已發表的CHO-K1細胞的GS基因全序列相比，行895位核苷酸全部由G變為C，其相應的299位氨基酸由甘氨酸變為精氨酸。將變異后的GS基因插入到pSV2dhfr質粒的HinIII-BgII位點，構建成表達GS基因的重組質粒PSV2-GS，變異后的GS基因具有更高的擴增功能。
例二、利用GS基因作擴增選擇標記基因，構建含乙肝病毒表面抗原S基因的重組質粒PMSG。
PMSG重組質粒構建如圖2所示。
pSVDHBr-1質粒經XhoI及EcoRI酶切后，Klenow酶補平，回收含有HBVS基因的DNA片段，插入到質粒pBluecript-CMV中的Sall位點，構建成0.75Kb的CMV-IE立即早期啟動子調控HBVS基因表達的中間質粒pCMVHBV1。再用Bg1II-Xba1不完全酶切中間質粒pCMVHBVl，分離回收2.5Kb大小的DNA片段。此片段含有CMV-IEO.75Kb啟動子及乙肝基因S片段，Llenow酶補平后，將此DNA片段插入pSVGS質粒的PVuII位點，得到重組質粒pMSG。此質粒的特點是質粒結構中包括CMV-IE0.75kb啟動子及其控制之下的乙肝病毒表面抗原S基因和SV40早期啟動子及其控制之下的谷氨酰胺合成酶(GS)基因，且乙肝病毒表面抗原S基因在前，GS基因在后。
例三、G4細胞系與C43細胞系方瓶內分泌HBsAg動態比較。
采用脂質體轉化技術，用10ugpMSG質粒DNA轉化CHO-K1細胞，4B小時，胰酶消化細胞，以1∶10-20分別稀釋傳代至25uMMSX的無谷氨酰胺DMEM選擇培養液中，37℃5％CO2靜止培養。每3-4天換一次液，約三周左右生長成直徑約1mm大小的細胞克隆。此時，順序將細胞克隆轉至96孔板、24孔板，大方瓶，逐源增加MSX濃度至100uM，200uM，500uM，篩選分泌HBsAg的高表達細胞系。共選擇到五株高表達細胞系，其中G4細胞系表達產量最高，見表1。
對G4細胞系表達產物的檢測結果如下1、HBsAg的表達產量∶反相血凝滴度為1∶256-512，放射免疫(RIA)為5000-10000ng/ml。
2、初純品經SDS-PAGE電泳顯示23KD、27KD和30KD三條蛋白帶。
3、初純品電鏡觀察到22nm大小的HBsAg顆粒。
4、G4細胞系與B43細胞系分泌HBsAg的動態比較，B43細胞系為本申請人利用dhfr基因擴增系統選擇到HBsAg高表達細胞系，現已用于生產。本發明人在方瓶內對G4細胞系與B43細胞系的分泌HBsAg動態進行比較，結果見圖3。從圖3可見，G4細胞系HBsAg分泌水平較B43細胞系高一倍左右。
5、G4細胞在撤去選擇壓力后能穩定分泌HBsAg60天左右，且凍存復蘇后分泌HBsAg滴度不下降，說明其遺傳性能穩定。
6、經免疫熒光檢查，G4細胞系無PPLO污染。
以上結果表明，利用谷氨酰胺合成酶(GS)基因擴增系統得到的轉基因細胞系G4表達水平高，遺傳性能穩定，無外源因子污染，是一株可用于生產的細胞株。本發明對于發展中國的乙型肝炎疫苗生產，控制中國的乙型肝炎的流行具有重要意義，投入生產后將會產生重大的經濟效益和社會效益。
表1利用GS基因為擴增選擇標記表達HBsAgHBsAg(RPHA)表達量細胞系 增加倍數擴增前擴增后GS B1 1∶64 1∶641F5 1∶32 1∶192 6F71∶8 1∶19224F81∶8 1∶12816G11∶8 1∶12816G41∶321∶2568說明書


圖1GS基因CDNA克隆策略及重組質粒PSV2-GS的構建圖2PMSG重組質粒的組建圖3GS細胞系與B43細胞系方瓶內分泌HBsAg動態比較圖中RPHA為反向被動血凝實驗。
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1.一種可用于擴增的谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于所有的質粒結構中的GS基因來源于CHOdhfr-細胞，且該GS基因的核苷酸序列與來源于CHO-K1細胞的GS基因的序列其895位堿基由烏嘌呤G變為胞嘧淀C，并導致299位氨基酸由苷氨酸變為精氨酸。
2.一種含有表達乙肝病毒表面抗原S基因的重組質粒PMSG，其特征在于質粒結構中包括CMV-IE075Kb啟動子及其控制之下的乙肝病毒表面抗原S基因和SV40早期啟動子及其控制之下的谷氨酰胺合成酶(GS)基因。
3.根據權利要求2的重組質粒，其特征在于所說的乙肝病毒表面抗原S基因在前，GS基因在后。
4.根據權利要求2-3中的任何一個重組質粒，其特征在于所有的質粒結構中的GS基因來源于CHOdhfr-細胞。
5.根據權利要求1-3中的任何一個重組質粒，其特征在于GS蛋白編碼基因在此質粒中作為擴增和選擇標記基因。
6.根據權利要求1-4中的任何一個重組質粒，其特征在于所說的乙肝病毒表面抗原S基因是乙肝病毒基因組的XhoI-BglII片段，此DNA片含有乙肝病毒表面抗原S基因、乙肝病毒基因組增強子1(Eh1)和增強2(Eh2)、X基因。
7.根據權利要求1-5中的任何一個重組質粒，其特征在于所說的乙肝病毒是adr亞型。
8.一種能分泌乙肝病毒面抗原S蛋白的細胞系G4，其特征在于它是利用權利要求1-7中任何一個權利要求的重組質粒轉化的哺乳動物細胞系，此哺乳動物細胞是CHO-K1細胞。
全文摘要
本發明提供一種利用CHO dhfr
文檔編號C12N15/52GK1155582SQ9610070
公開日1997年7月30日 申請日期1996年1月25日 優先權日1996年1月25日
發明者劉文軍, 朱既明, 阮力, 楊芙蓉, 任貴方 申請人:中國預防醫學科學院病毒學研究所