專利名稱：枯草芽孢桿菌及固體堿性果膠酶生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種芽孢桿菌(Bacillus)，特別是枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)菌株的培養及用該菌生產固體堿性果膠酶生產工藝。通過分離、誘變、篩選出此菌株，然后在高濃度和適當C.N比的條件下，培養和發酵，再經高溫噴霧干燥，生產出一種不含纖維素酶，而含果膠酶(為主)，同時含蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶的復合固體酶制劑。
果膠酶作為脫膠劑廣泛應用於紡織工業的苧麻脫膠，造紙工業及其它輕工業。用于苧麻脫膠方面主要有丹麥NOVO公司出品的苧麻酶(《苧麻紡織科技》第十二卷總五十三期)是一種棕色液體酶，由曲霉(屬真菌)菌株產出的，一般含有果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等的混合酶，偏酸性。國內也有廠家生產真菌酸性果膠酶制劑。但上述酶因含有纖維素酶;在酸性下易分解纖維，致使纖維強度和制成率降低，麻廠避而用之。中國湖南師范大學申請了中國專利CN85104284和CN85104285提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)A2-5，經工業發酵生產出果膠混合酶，這兩項專利雖提到生產固體酶，但說明書中沒有提供固體酶的生產工藝，也未談到固體酶的應用，只談到液體酶生產工藝和濃縮酶在呈強堿性時，再加入千分之一的苯甲酸鹽可防腐保酶，最好保存半年，否則液體酶很快失去活性，少者幾天，多者幾個月就失活，一般液體酶較難保存。
本發明目的在于克服上述發明諸多不足，提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)CGMCC NO.0213及用該菌株生產固體堿性果膠酶工藝方法，這種酶是一種不含纖維素酶，而含果膠酶(為主)，同時含蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶的固體復合酶制劑。本發明工藝簡單，周期短，原料廉價，酶活性高，菌和酶無毒性，耐熱、耐堿、不加任何防腐劑也能貯存達一年，且活性穩定，固體酶運輸和使用方便，酶作用條件溫和，麻纖維強度和制成率高，又能重復利用，從而降低成本，與傳統方法相比，可節省4-5道工序，耗能低，廢水無污染，并可綜合利用，麻廠在現有條件下便可用此酶進行麻脫膠，不必增加新投資。
本

發明內容
是用不產纖維素酶，營養條件要求不高，耐熱、耐堿的枯草芽孢桿菌突變株、保藏號為CGMCC NO.0213，將其菌株接種到適當C.N比的玉米粉-豆餅粉培養基中(內含少量無機鹽)，經培養發酵，然后高溫噴霧干燥制成固體堿性果膠酶，此酶活性高，耐熱，耐堿，適于麻類脫膠生產、造紙及其它輕工業生產應用。其菌種枯草芽孢桿菌，是從麻土壤中分中離的，再經紫外線(UV)和亞硝基胍(NG)誘變、篩選出帶有遺傳記號鏈霉素抗性(Smr)的突變體，它主要產生堿性果膠酶，同時產生蛋白酶，淀粉酶和木聚糖酶。在肉湯平板上，菌落由灰白、薄、逐漸邊變白，增厚，然后全白變厚，無同心園。最適生長條件PH7-7.2，37℃;在有機或合成的無機培養基上均很好生長，營養要求不高;液體靜止培養時，表面形成菌膜，下邊培養基清亮;肉湯瓊脂穿刺培養，只表面有菌苔，證明生長產生芽孢，耐熱帶有Smr遺傳記號，有利菌純化、防雜保存。此菌在玉米-豆餅粉培養基中通氧會生長更旺盛，本身不產氣。
本發明所涉及的枯草芽孢桿菌菌株已於1994年5月6日送至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(地址中國北京中關村)，其分類命名及其保藏號為枯草芽孢桿菌Bacillus Subtilis CGMCC NO.0213.
用上述枯草芽孢桿菌菌株CGMCC NO.0213，生產固體堿性果膠酶工藝過程為菌種→試管肉湯斜面→扁平大斜面→種子罐→發酵罐→高溫快速噴霧干燥制成固體酶制劑→包裝1.將上述枯草芽孢桿菌菌株CGMCC NO.0213接入試管肉湯斜面上，肉湯培養基成份有牛肉膏、豬血蛋白胨、NaCl、瓊脂，PH值為7.0-7.2，在高壓滅菌鍋(15磅)中滅菌30分鐘，37℃條件下培養16-24小時;
2.轉接到扁瓶斜面上，37℃下培養16-24小時，培養基成份同上述步驟1.，之后加入一定量的肉湯，作成菌懸浮液;
3.轉入種子罐中擴大培養，罐中培養基成份有一定碳、氮配比的玉米粉，豆餅粉和MgSO4·7H2O，KH2PO4，Na2CO3，K2HPO4，(NH4)2SO4及適量豆油，121-123℃下滅菌40分鐘，滅菌前PH為8-9，滅菌后PH降為6.5左右，37℃-40℃和不斷攪拌通氧條件下，培養10-12小時;
4.再轉接到發酵罐中，培養基成份和培養條件基本同上步驟3.，但培養基濃度增大，培養時間24小時-28小時;
5.將發酵罐中酶液置入高溫噴霧塔，快速噴霧干燥，進口160℃左右，出口80℃左右，制成固體酶制劑。
用下列方法測定酶制劑中各種酶的活性1.果膠酶活性的測定，測定方法為常規的DNS法，即3.5-二硝荃水楊酸定糖法，結果液體酶果膠酶活性達到水解果膠，產生半乳糖醛酸幾千/μg/ml·min或固體酶，達到幾萬/μg/g。
2.木聚糖酶活性的測定，用肉湯-木聚糖平板法將菌接種在此平板上，37℃培養24小時左右，觀察結果透圈明顯，證明產生木聚糖酶。
3.淀粉酶活性的測定，用上述第2方法進行測定，所不同的是底物改用可溶性淀粉，結果有明顯透明圈，說明可產生淀粉酶。
4.蛋白酶活性的測定，用Tolin-酚法測定，結果蛋白酶活性達到水解酪素產芳香族氨基酸幾佰μg/ml·min。另用上述第2方法測定，底物換為酪蛋白，結果有明顯透明圈，證明產生蛋白酶。
5.纖維素酶測定用濾紙崩潰法，結果濾紙未消失或變形，證明不產纖維素酶。
總之測定結果證明枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)CGMCC NO.0213除不產纖維素酶外，可產生果膠酶(為主)，并產生蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶。
果膠酶活性具體測法0.4%進口柑桔果膠-Tris-HCl(PH7.0)0.1ml+酶液(或稀釋過的酶液)0.1ml→50℃10分鐘→加DNS0.2ml→50℃10分鐘→加酒石酸鉀鈉3.6ml→用721分光光度計于575nm波長處比色測定OD值，對照用煮沸15分鐘的死酶，其它條件相同。在標曲線上查出相應的半乳糖醛酸含量，或按下公式計算出果膠酶活性單位。
果膠酶活性X(μg/ml·min)＝[804.16065Y+23.495915]×Z其中Y為OD值，Z為酶稀釋倍數可將菌種予先加熱處理(80℃10分鐘或65℃30分鐘)或利用抗Smr特性，可純化菌種，防止污染，在生產酶的過程中，未見污染現象，鏡檢或平板單菌落檢查，都證明菌很純、未污染雜菌。
本發明所選出的CGMCC NO.0213菌株，營養要求不高，在廉價的玉米粉-豆餅粉培養基上(內含少量無機鹽)生長良好，產酶多，耐熱，耐堿，產生芽孢并帶有Smr遺傳標記，適合高溫噴霧干燥，工業化生產和有利于防治雜菌污染純化菌種和長期保存。用它生產固體堿性果膠復合酶的工藝簡單，周期短(3天)，故生產率高，此復合酶耐熱、耐堿、活性高，含果膠酶(為主)，及蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶，但絕不含纖維素酶，適合麻類脫膠應用;上述固體果膠酶制劑，本身可防腐，不加任何防腐劑，也能耐貯藏，室溫貯存一年，活性很穩定;而且運輸和使用都方便，麻廠在現有件下便可使用，不必再投資，麻廠易接受;經幾次生產規模試驗，已證明殘膠率、纖維強度等均可達國標，酶可重復利用，降低成本;酶作用條件溫和，又偏堿和不含纖維素酶，對纖維損傷，故纖維強度和回收率高;與傳統法比較，可省4-5道工序，耗能低，廢水無污染，還可綜合利用，再創效益。由于采用高濃度培養基進行發酵，菌生長好，酶產量高，回收率也高，還有利以后酶的重復使用和廢水的再利用，降低成本。由于采用適當的C、N配比，PH不致于降低太多而影響菌的生長和酶的產量，也有利于酶的重復利用和廢水的再利用。酶偏堿性對苧麻脫膠有好處。由于采用高溫噴霧干燥法制成固體酶制劑，因干燥不加防腐劑仍能貯藏一年，且活性仍穩定，運輸和使用均方便。由于選用產芽孢帶有Smr遺傳記號，菌株生產酶制劑，有利于菌種純化，長期保存和防止雜菌污染。
實施例11)將枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)CGMCC NO.0213接入試管肉湯斜面上，肉湯培養基成份及含量為牛肉膏1%，豬血蛋白胨1%，NaCl0.5%，瓊脂為1.5-2%，PH7.0-7.2，15磅滅菌30分鐘，37℃培養16-24小時;
2)轉接到二個扁平肉湯斜面上，擴大培養，其培養基成份和含量均同步驟1，之后每瓶加入100ml肉湯作成菌懸液;
3)將菌液轉接到種子罐中，種子罐為1噸罐，內裝500kg培養基，培養基成份及含量為玉米粉2%，豆食餅粉4%，MgSO4·7H2O0.02%，K2HPO40.4%，(NH4)2SO40.4%，Na2CO3200g，KH2PO40.03%，豆油適量，121-123℃滅菌40分鐘，冷到37-40℃再接菌，PH在滅菌前調到9，滅菌后降到6.3，在37-40℃，不斷攪拌和通氧達140(空氣流量計上刻度數)的條件下培養12小時;
4)再轉接到發酵罐中繼續培養，發酵罐10噸罐，內裝500kg培養基，培養基成份和含量為玉米粉3%，豆餅粉4%，余下同步驟3，在37-40℃不斷攪拌和通氧條件下培養28小時;
5)將酶液于高溫噴霧塔，噴霧干燥制成固體酶制劑，酶回收率3-6%。
檢測酶活力(1)液體酶培養28小時達4969μg/ml·min(2)固體酶活力為28000μg/g，為淺黃色實施例2所有工藝步驟同實施1，用1噸罐內裝500Kg培養基成份玉米粉2%，豆餅粉4%，其它無機鹽同上，PH滅菌前為7.4，滅菌后為PH6，其結果37℃-40℃培養28小時，液體酶達4697.948μg/ml·min，經高溫快速噴霧干燥制得固體酶制劑，回收率5%。
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于該菌為枯草芽孢桿菌(B-acillus Subtilis CGMCC NO.0213；
2.一種固體堿性果膠酶生產工藝，其特征在于將權利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)CGMCC NO.0213菌株接種到適當C.N比的玉米粉-豆餅粉培養基(內含少量無機鹽)中，經培養、發酵，然后高溫，快速噴霧干燥，制成固體堿性果膠酶;
3.按權利要求2所述的固體堿性果膠酶生產工藝，其特征在于具體工藝步驟如下1)將權利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株CGMCC NO.0213接入試管肉湯斜面上，肉湯培養基成份有牛肉膏、豬血蛋白胨、NaCl、瓊脂、PH值為7.0-7.2、在高壓滅菌鍋(15磅)中滅菌30分鐘，37℃條件下培養16-24小時;2)轉接到扁瓶斜面上37℃下培養16-24小時，培養基成分同上述步驟1.，之后加入一定量的肉湯，作成菌懸浮液;3)轉入種子罐中擴大培養，罐中培養基成份有一定碳、氮配比的玉米粉，豆餅粉和MgSO4·7H2O，KH2PO4，Na2CO3，K2HPO4，(NH4)2SO4及適量豆油，121-123℃下滅菌40分鐘，滅菌前PH為8-9，滅菌后PH降為6.5左右，37℃-40℃和不斷攪拌通氧條件下，培養10-12小時;4)再轉接到發酵罐中，培養基成份和培養條件基本同上步驟3.但培養基濃度增大，培養時間24小時-28小時;5)將發酵罐中酶液置入高溫噴霧塔，快速噴霧干燥，進口160℃左右，出口80℃左右，制成固體酶制劑。
全文摘要
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)CGMCC No.0213以及用該菌，在高培養基濃度、適當碳、氮比條件下培養、發酵然后高溫快速噴霧干燥，生產一種不含纖維素酶，以果膠酶為主，同時含有蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶的復合固體酶工藝。工藝簡單，周期短，原料廉價、酶活性高，菌和酶無毒性，耐熱、耐堿，不加防腐劑便可貯藏，且活性穩定，運輸，使用皆方便，酶作用條件溫和，可重復使用，廢水無污染，用于苧麻脫膠回收率高，麻纖維結實，可節省4—5道工序，耗能低。
文檔編號C12N1/20GK1113951SQ94105708
公開日1995年12月27日 申請日期1994年5月24日 優先權日1994年5月24日
發明者李明鳳, 湯懋竑, 范樹田, 李心治 申請人:中國科學院遺傳研究所