專利名稱：抑制內皮素生成的寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是能夠抑制包括人在內的動物體細胞分泌內皮素的寡核苷酸以及該寡核苷酸的應用。具體地，本發明涉及針對動物的內皮素前體基因而設計的反義硫代寡核苷酸片段，它們能夠有效地抑制內皮素的生成。該寡核苷酸可用于制備基因治療藥物，用于對內皮素相關疾病進行預防和治療。
血管內皮細胞分泌的內皮素(endothelin，ET)是迄今已發現的最強的內源性縮血管肽(Yanagisawa，M，et al A novel potent vasocongtrictor peptide produced by vascular endothelial cells。Nature 1988，332411-415)。ET由內皮素前體基因編碼的內皮素前體經內皮素轉換酶催化生成，然后分泌出細胞。ET通過與靶細胞膜內皮素受體結合啟動生物效應。ET家族由ET1，2，3三種異形肽組成，其中以ET1縮血管活性最強〔Simonson，M.S.Endothelingmultifunctional renal。peptides physiol Rev 1993，73(2)375-411〕ET除了主要存在于心血管系統外，還分布于全身多種組織，作用十分廣泛。大量研究表明，ET參與高血壓、心肌缺血、動脈粥樣硬化、腎衰、慢性肺動脈高壓、肺心病等許多疾病的發病過程。針對這一共同致病因子，人們以往只能常規性地尋找內皮素和內皮素受體拮抗劑。
近年，反義寡核苷酸技術的出現和發展為消除ET的致病作用提供了基因治療的可能。理論研究充分證實針對某個基因設計的反義寡核苷酸片段，經過適當的化學修飾(如硫代)，在被細胞攝取后，能從基因轉錄和/或mRNA剪切、拼接及翻譯等多個環節特異性阻斷該基因的表達，參見Cazenave，C.，and Helene，C.(1991)Antisense oligonucleotides.in Antisense nucleic acids and proteinsfundamentals and applications(Mol，J.N.M.，and van der Krol，A.R.，eds)pp.47-93，Marcel Dekker，inc.，New York和Crooke，S.T.Progress towards oligonucleotide pharmacodynamic properties.FASEB J.1993 7533-539。人工設計的反義寡核苷酸片段是否具有上述特異性功效則需要經過細胞篩選。截止1993年，硫代反義寡核苷酸作為基因治療藥物，至少有一種進入了二期臨床研究。
目前多種動物種屬和人的內皮素前體基因已經克隆成功。其表達調控的研究也已獲得重要進展。其中豬和人的內皮素前體基因具有高度同源性，豬和人的內皮素則完全相同，詳見Itoh，Y.，et al Cloning and sequence analysis of cDNA encoding the precusor of a human endothelium-derived vasoconstrictor peptide，endothelinidentity of human and porcine endothelin，FEBS letter 1988，231(2)440-444。
目前，應用反義寡核苷酸技術研究心血管疾病的基團治療尚處于萌芽階段。針對動物的內皮素基因而人工設計的寡核苷酸尚未見報道。
本發明的目的是要提供一種可用于基因治療的寡核苷酸，該寡核苷酸特異性地抑制動物內皮細胞生成內皮素，因此，利用該寡核苷酸即可達到預防和治療與內皮素相關疾病的目的。從而為內皮素相關疾病的預防和治療開辟了新的途徑。
本發明依據豬和人的內皮素-1前體基團(PPET-1基團)(其序列詳見附

圖1)，設計了多個寡核苷酸鏈。然后按已知方法合成并修飾所設計的寡核苷酸。經與內皮細胞一起培養并測出細胞培養液中內皮素-1的含量即可篩選出能有效抑制內皮素生成的反義寡苷酸片段。
圖1顯示了人和豬內皮素前體基因cDNA序列;
圖2顯示針對內皮素前體的基因，設計的反義硫代寡核苷酸片段Ⅰ，與空白對照相比，其較低劑量即顯著抑制內皮素生成，這種作用呈劑量依賴性加強。而相應的正鏈則無明顯作用。
圖3顯示針對內皮素前體的基因，設計的反義硫代寡核苷酸片段Ⅱ，與空白對照相比，對內皮素的生成具有一定的抑制作用，并且這種抑制作用隨劑量的增加而逐漸增強;
圖4和圖5顯示以空白對照為標準，反義硫代寡核苷酸Ⅰ和Ⅱ對內皮細胞生成內皮素的抑制率。
豬肺動脈內皮細胞培養豬肺動脈內皮細胞分離、培養、鑒定采用下述方法。成年豬放血處死，半小時內取出完整心肺，75%酒精表面消毒后行肺動脈圓錐穿刺，D-hanks液(NaCl8.0，KCl0.4，Na2HPO4·12H2O0.134，KH2PO40.06，NaHCO30.35g/L)洗凈肺動脈腔;注入0.25%胰蛋白酶于37℃溫孵消化12分鐘，即以胎牛血清終止消化;上述消化液離心(200g×10，室溫)、棄上清，沉淀用含10%胎牛血清(天津血研所)、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和20m mol/L HEPES的M199(GIBCO公司)培養基接種、培養;傳至第3代時用于本實驗。所培養細胞倒置相差顯微鏡觀察呈鵝卵石樣、單層生長融合。應用Ⅷ因子相關抗原單克隆抗體，間接免疫熒光法顯示胞漿中含有大量Ⅷ因子相關抗原，證明所培養細胞為內皮細胞。
內皮素測定肺動脈內皮細胞培養液中內皮素的含量，應用解放軍總醫院提供的放免藥盒，按下述方法測定(一)藥盒組成及貯存1.125I-ET 1瓶(冷凍保存) 2.ET-Ab 1瓶(冷凍保存)3.ET標準1瓶(冷凍保存)4.PR試劑1瓶(4℃保存)5抑肽酶1瓶(4℃保存)6.EDTA二鈉1瓶(4℃保存)7緩沖液1瓶(4℃保存)8.三氟乙酸(強酸·室溫保存)(二)、試劑配制1.緩沖液用蒸餾水將濃縮液稀釋至50ml。
2.ET-Ab每瓶用緩沖液稀釋至11ml。
3.125I-ET用緩沖液將標記品稀釋成1.3-1.4萬cpm/100ul。
4.ET標準將ET標準用1000ul緩沖液溶解，即成為5120pg/ml(S6)。而后作4倍稀釋得到1280(S5)、320(S4)、80(S3)、20(S2)、5(S1)pg/ml。具體步驟為200ul S6+600ul PBS→S5200ul S5+600ul PBS→S4200ul S4+600ul PBS→S3200ul S3+600ul PBS→S2200ul S2+600ul PBS→S1(三)、操作步驟本實驗采用非平衡法，實驗在1.1cm×7.8cm園底塑料管內進行。
(四)、結果計算以Bi/Bo(%)為縱坐標作圖(Bi÷Bo)×%＝(Bi-BNCB)÷(Bo-BNSB)×100%以ET標準濃度為橫坐標，Bi/Bo為縱坐標，在半對數坐標紙上畫出標準曲線，根據待測標本的Bi/Bo%，在曲線上查得標本ET含量。注意BNCB為樣品非特異，即U0值，BNSB為曲線非特異。
實施例1反義硫代寡核苷酸Ⅰ的設計與合成豬和人PPET-1基因第一6至第9位的核苷酸序列為5′-TTCAGAATGGATTAT-3′，針對其設計的反義核苷酸鏈即為5′-ATAATCCATTCTG AA-3′。
在ABI公司DNA自動合成儀上，用硫化試劑TETD(四甲基硫代脲)代替氧化試劑Ⅰ2(碘)，其余用普通DNA合成試劑，以亞磷酰胺法自動合成上面所設計的反義寡核苷酸，從而得到反義硫代的寡核苷酸Ⅰ。
將肺動脈內皮細胞接種于培養板，待生長融合，沖洗后換以無血清M199培養基，并分別加入不同濃度的反義寡核苷酸Ⅰ，置37℃5%CO2培養24小時，收集培養液，按前述方法檢測其中內皮素含量，經與空白對照比較后測得其抑制內皮素生成的抑制率為60%。
實施例2反義硫代寡核苷酸Ⅱ的設計與合成豬和人PPET-1基因第4至第18位的核苷酸序列為5′-GATTATTTCCCCATG-3′，針對其設計的反義核苷酸鏈即為5′-CATGGGGAAATAATC-3′。
在ABI公司DNA自動合成儀上，用硫化試劑TETD(四甲基硫代脲)代替氧化試劑Ⅰ2(碘)，其余用普通DNA合成試劑，以亞磷酰胺法自動合成上面所設計的反義寡核苷酸，從而得到反義硫代的寡核苷酸Ⅱ。
將肺動脈內皮細胞接種于培養板，待生長融合，沖洗后換以無血清M199培養基，并分別加入不同濃度的反義寡核苷酸Ⅱ，置37℃5% CO2培養24小時，收集培養液，按前述方法檢測其中內皮素含量，經與空白對照比較后測得其抑制內皮素生成的抑制率為40%。
實施例3(對比實施例)
非特異性寡核苷酸Ⅲ的設計與合成本發有的設計的第三個寡核苷酸是與豬和人PPET-1基因序列不互補的非特異性鏈，其序列為5′-AATGCGATGCGATAC-3′。在ABI公司DNA自動合成儀上，用硫化試劑TETD(四甲基硫代尿)代替氧化試劑Ⅰ2(碘)，其余用普通DNA合成試劑，以亞磷酰胺法自動合成所設計的反義寡核苷酸，從而得到前述序列的反義硫代的寡核苷酸Ⅲ。
將肺動脈內皮細胞接種于培養板，待生長融合，沖洗后換以無血清M199培養基，并分別加入不同濃度的反義寡核苷酸Ⅰ，置37℃5% CO2培養24小時，收集培養液，按前述方法檢測其中內皮素含量，經與空白對照比較后測得其抑制內皮素生成的抑制率為2%。
權利要求
1.針對內皮素-1前體基因翻譯起始位點，設計的一種寡核苷酸，其特征在于它能夠抑制內皮細胞生成內皮素。
2.根據權利要求1的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸被修飾。
3.根據權利要求2的寡核苷酸，其中所說的修飾指硫代。
4.根據權利要求3的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸的序列為5′-ATAATCCATTCTGAA-3′。
5.根據權利要求3的寡核苷酸，其特征在于該寡核苷酸的序列為5′CATGGGGAAATAATC-3′。
6.一種制備權利要求1-5中任一項所述的寡核苷酸的方法，該方法包括首先設計所要合成的寡核苷酸，然后利用DNA自動合成儀合成并修飾所設計的寡核苷酸，并從中篩選出能有效抑制內皮細胞生成內皮素的寡核苷酸。
7.將權利要求1-5中任一項的寡核苷酸用于抑制內皮素的生成。
8.將權利要求1-5中任一項的寡核苷酸用于制備可預防或治療內皮素相關疾病的藥物。
全文摘要
本發明公開了能夠有效抑制動物內皮細胞生成內皮素的寡核苷酸，該寡核苷酸可被制成用于基團治療的藥物，從而為內皮素相關疾病的治療開辟了新途徑。
文檔編號C12P19/34GK1110278SQ9410461
公開日1995年10月18日 申請日期1994年4月14日 優先權日1994年4月14日
發明者胡清華, 王迪潯 申請人:同濟醫科大學