專利名稱：微生物異步發酵生產長鏈α，ω-二元酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用微生物發酵正構烷烴生產長鏈α·ω-二元酸的方法。
長鏈α·ω-二元酸是一類重要的化工原料。可用來合成高級香料、工程塑料、熱熔膠、樹脂、高級潤滑油添加劑、食品防腐劑等。特別是α·ω-十三碳二元酸和十六碳二元酸，它們分別是合成十三烷二酸乙撐酯和環十五烷酮的重要原料。
七十年代以來，各國相繼開展了以正構烷烴為基質利用微生物發酵制取長鏈二元酸的研究。1982年日本礦業株式會社率先工業放大，于1984年建成年產200噸十三碳二元酸的裝置，并已投入生產。中國專利87105445.0提出了生產長鏈α·ω-二羧酸的方法，特別是生產α·ω-十六碳二羧酸的方法。在16升發酵罐中，正構十六烷烴投入量為20%，發酵液PH控制在6.8～7.3，發酵70小時，產酸量達到77.5克/升，延長發酵時間到117小時，產酸量達到123克/升，轉化率為79%。美國專利US4，339，536也提出了生產長鏈二元酸的方法，它是將菌種濃度為10-15克/升的種子液120升加入含有正構十三烷烴240升和培養基1200升的發酵槽中，無菌空氣通入量為400升/分，在溫度32℃、PH為5的條件下培養12小時后，調節PH至7.0，并再培養72小時，最后得到含有十三碳二元酸40克/升、正構十三烷烴8克/升以及菌體20克/升的1200升發酵液。
本發明的目的是提出一種利用微生物異步發酵含碳原子數為11-18的正構烷烴生產長鏈α·ω-二元酸的方法，特別是高產12-16個碳原子的α·ω-二元酸的方法。
本發明所用的微生物為熱帶假絲酵母(Candldatroplcalls)不完全阻斷型多倍體變異菌株。它是經紫外線多次誘變選育和定期復壯篩選而得的高產二元酸生產菌株，特別是對α·ω-十三碳二元酸、十二碳二元酸的生產能力極強。它具有對兩末端ω-氧化正構烷烴能力強，同化正構烷烴和β-氧化能力弱的特點。
本發明利用上述菌種，以菌種濃度作為發酵控制指標、采用烷烴和糖質為主要底物，并配以其它營養組份發酵，通過補加正構烷烴和烷基磷酸酯，控制培養階段和發酵階段的操作條件，使菌種生長和發酵分兩步進行，以獲得高產的長鏈α·ω-二元酸。
將由固體斜面培養的菌種接人種子培養基內培養，培養后作為發酵種子液。按照一定的投入量將發酵種子液接入含有正構烷烴和發酵培養基的混合液中，開始攪拌，控制溫度、PH，同時用酸液調節培養液PH值呈酸性，進行菌種的培養和繁殖，在菌種培養階段，α·ω-二元酸生成極少，而菌種生長和繁殖迅速，待菌種達到一定濃度后，開始補加適量的正構烷烴和烷基磷酸酯，用堿液調節培養液PH呈堿性，開始轉入發酵階段，進行二元酸的積累。生成的二元酸則以金屬鹽的形式溶解于發酵液中。發酵結束后，經酸化和分離處理，制得精制的長鏈α·ω-二元酸。
本發明的菌種培養基有(1)6波美度的麥芽汁加2%瓊脂制成的固體斜面。(2)烷烴液體培養基。
烷烴液體培養基組成為Na2HPO4·12H2O 4-6克/升，KH2PO42-4克/升，MgSO4·7H2O0.5-3克/升，NaCl 1-3克/升，蔗糖 15-30克/升，酵母膏 0.5-2克/升，玉米漿0.5-2克/升，尿素0.5-3克/升，維生素B1 0.1-0.3克/升，正構烷烴50-80毫升/升和來自水配制。烷烴液體培養基配制后，需將其PH調至4.5左右。
培養菌種過程是(1)取一滿接種環熱帶假絲酵母不完全阻斷型多倍體變異菌株，涂布在麥芽汁固體斜面上。麥芽汁固體斜面具體做法是將6波美度的麥芽汁和2%的瓊脂加熱溶解，然后裝入φ25×210mm的玻璃試管內，每支試管裝液量為8-10毫升，放成斜面，凝成固體斜面后即可使用。將涂布在麥芽汁固體斜面上的菌種在30～32℃下培養48小時。(2)取一支上述斜面上的菌種接入到經滅菌的600毫升/3000毫升底部帶有六個擋板三角瓶的烷烴培養基內，于30-32℃下在180轉/分的旋轉搖床上培養48小時，作為發酵菌種。
在烷烴發酵過程中，當菌種繁殖到一定濃度時，就要提高發酵液的PH值，使之有利于發酵產酸。過早地調節PH，菌種濃度太低，影響產酸量，過晚地調節PH值，又會相對縮短產酸時間。轉發酵時，只有菌種達到一定濃度，才能獲得較高的產酸量。轉發酵時菌種的適宜濃度為2.0-6.0×108個菌種/毫升或是7-12%(濕菌重)，最好是8-10%。在短時間內獲得轉發酵所需的上述菌種濃度，最好是在培養階段將培養液PH值調呈酸性，適宜的PH值為4.0-6.0，最好是控制在4.5±0.1，此時二元酸生成極少，而菌種消耗糖質得以快速生長和繁殖，在12-36小時內，就能達到轉發酵所需的菌種濃度。
加入乳化劑對菌種與烷烴的充分接觸是十分重要的。加入適量的乳化劑可以提高烷烴的微粒化程度。烷基磷酸酯是較為理想的乳化劑。加入適量的烷基磷酸酯可促進產酸量的增加，特別是對十二碳二元酸和十三碳二元酸的產酸量增加較為明顯。它在發酵液中的適宜含量為1-5克/升，最好是1-3克/升。加入烷基磷酸酯最好是在轉入發酵時進行，它可以單獨加入，也可與烷烴一起補加到發酵液中。
在培養階段，正構烷烴適宜的投入量為2-15%(v/v，占總發酵液體積)，最好是5-10%(v/v)。正構烷烴的碳原子數為11-18，而含有12-16個碳原子比較好，但最好是含有13個碳原子，其次是含有12個碳原子。發酵階段，正構烷烴適宜的補加量為15-30%(v/v，占總發酵液體積)，其補加正構烷烴的碳原子數情況同培養階段，最好的補加量為20-25%。
菌種在酸性條件下經培養階段的培養，其濃度達到7-12%時，開始補加15-30%(v/v)的正構烷烴和適量的烷基磷酸酯，然后，逐漸地調節發酵液PH值，調節時間為0.5-4.5小時，最好是3.5-4.5小時。最后將PH值調至7.0-8.0，最好是控制在7.8±0.1。
菌種液接入后的培養階段，用酸液，如6N硫酸，調節培養液PH為4.0-6.0。菌種在生長和繁殖過程中，仍然要代謝生成少量的α·ω-二元酸，PH值下降，用堿液，如12N氫氧化鈉或氫氧化鉀，進行調節，使PH維持在4-6。在發酵過程中，由于有大量α·ω-二元酸積累，PH下降，用上述堿液調節PH并維持在7.0-8.0，直至發酵結束。
在多元底物中，正構烷烴和蔗糖是主要碳源，蔗糖作為碳源用來維持菌種的生長和繁殖，正構烷烴是目的代謝產物的相應基質。發酵培養基中蔗糖的適宜含量為20-30克/升。鎂離子是多種酶的激活劑，適量的鎂離子濃度對生產二元酸極為有利，特別是對生產碳數12到15的α·ω-二元酸，添加鎂離子尤為重要。適宜的MgSO4·7H2O含量為0.5-2.5克/升，最好是1.0-2.0克/升。加入適量的維生素B1對菌種的生長和發酵有利，最適宜的含量為0.1-0.2克/升。適當的尿素含量可以提高菌種的增殖速度，提前進入菌種生長穩定期，延長有效產酸期。尿素的含量最好是1-2克/升。
所有補加液或流加液和菌種培養基、發酵培養基是在0.1MPa、121℃下滅菌20-30分鐘后使用。含11-18個碳原子的正構烷烴純度大于97%，含有11-18個碳原子的長鏈α·ω-二元酸用氣相色譜法作定性和定量分析。
通過下述步驟可完成本發明(1)取一接種環菌種做斜面培養，培養時間為48小時，溫度32℃。
(2)將斜面培養的菌種接入烷烴培養基中，培養48小時，溫度32℃，作為種子液。
(3)將種子液接入發酵罐內，或再經1-3級種子培養后接入發酵罐內進行發酵。
將發酵菌種按5-30%(v/v)的投入量接入含有2-15%(v/v)的11-18碳原子的正構烷烴和發酵培養基混合液中，將混合液PH調至4.0-6.0，在適宜條件下培養，待菌種濃度達到7-12%(濕菌重)時，補加15-30%(v/v)的上述烷烴和烷基磷酸酯，烷基磷酸酯的含量為1-5克/升，用堿液逐漸調節發酵液PH值至7.0-8.0，并維持7.0-8.0到發酵結束，經加熱、破乳、分油、結晶、重結晶即得α·ω-二元酸產品。
本方法用熱帶假絲酵母(Candldatroplcalls)不完全阻斷型多倍體變異菌株發酵含有11-18個碳原子的正構烷烴得到相應碳數的α·ω-二元酸。用3立方米發酵罐發酵正構十三烷烴生產α·ω-十三碳二元酸。培養階段，正構十三烷烴投入量為5%(v/v)，PH為4.5±0.1，培養24小時菌種濃度達到8%(濕菌重)，開始補加20%(v/v)的上述烷烴和適量的烷基磷酸酯，調節PH為7.8±0.1，轉入發酵，發酵48小時，產酸量達100.1克/升，延長到96小時，產酸量達144.4克/升，轉化率為82.9%。在3升發酵罐分別發酵正構十二、十六碳二元酸產量達120克/升，α·ω-十六碳二元酸產量達68.6克/升。
實施例1(1) 取一接種環的熱帶假絲酵母(Candlda troplcalls)不完全阻斷型多倍體變異菌株，涂布在φ25×210mm玻璃試管內的麥芽汁和2%瓊脂制成的固體斜面上，共4支。在32℃下培養48小時。(2)將上述培養的4支斜面菌種，分別接入4瓶裝有經滅菌的600毫升烷烴培養基的3000毫升底部帶有六個擋板的三角搖瓶內，于32℃，180轉/分的旋轉搖床上培養48小時。(3)將(2)培養的菌種液兩瓶一組(約1.2升)，共兩組分別接入裝有正構十三烷烴0.5升和培養基8.3升的兩個裝液量10升的培養罐內，作為一級種子培養。培養基組成為Na2HPO4·12H2O6克/升，KH2PO42克/升，NaCl1克/升，蔗糖30克/升，維生素B1 0.1克/升，酵母膏1克/升，玉米漿1克/升，尿素2克/升，MgSO4·7H2O1克/升，該培養基用水配制。正構十三烷烴、尿素、MgSO4·7H2O分別單獨滅菌，于接種前加入。上述底物滅菌條件為0.1MPa、121℃水蒸汽，滅菌時間30分鐘。(4)接種后，在32.5℃、PH4.5±0.1，攪拌轉速550轉/分、通氣量8升/分、罐壓0.02MPa下培養菌種，培養時間為36小時。(5)將(4)培養的20升菌種液，接入裝有8升正構十三烷烴和132升培養基的200升氣提式內環流培養器內，在32.5℃、PH4.5±0.1、通氣量183升/分、罐壓0.03MPa下培養36小時。作為二級種子培養。(6)將(5)培養的160升菌種液，接入裝有30升正構十三烷烴和410升培養基的800升培養罐內，在攪拌轉速200轉/分，通氣量為550升/分，其它條件同(4)的情況下培養40小時，作為三級種子培養。(7)將(6)培養的600升菌種液接入裝有正構十三烷烴125升和培養基1775升的3立方米發酵罐內，在(6)的操作條件下培養24小時，菌種濃度達到9.8%(濕菌重)，開始補加500升正構十三烷烴和2.5千克烷基磷酸酯，用12N氫氧化鈉溶液逐步調節發酵液PH值至7.8±0.1，時間為4小時，開始轉入發酵。轉入發酵(流加少量甘油聚醚消泡劑)后發酵48小時，α·ω-十三碳二元酸產量達100.1克/升。從48小時繼續發酵至96小時，產酸量達144.4克/升，轉化率為82.9%。
實施例2(1)方法同實施例1(1)，培養一支斜面菌種。(2)方法同實施例1(2)，培養一瓶菌種液(約600毫升)。(3)將(2)培養的菌種液取出300毫升接入裝有150毫升正構十二烷烴和2550毫升發酵培養基的裝液量為3升自動控制的發酵罐內。培養基組成和滅菌方法及培養條件同實施例1(3)。培養時間40小時，菌種濃度達到8%，開始補加600毫升正構十二烷烴和3克烷基磷酸酯，用12N氫氧化鈉溶液逐步調節發酵液PH至7.8±0.1，時間4.5小時，開始轉入發酵。轉入發酵后發酵70小時，α·ω-十二碳二元酸產量達102克/升，轉化率為75%。
實施例3方法同實施例2。發酵正構十六烷烴制取α·ω-十六碳二元酸。轉發酵后發酵70小時，α·ω-十六碳二元酸產量達68.6克/升，轉化率為56%。
實施例4斜面培養菌種(1)和搖瓶培養菌種(2)同實施例1中的(1)和(2)的方法。(3)將搖瓶培養的種子液接入10升培養罐中培養，MgSO4·7H2O含量為2克/升，其它條件同實施例1中的(3)。(4)接種后，攪拌轉速為600轉/分，通氣量為6.5升/分，其它條件同實施例1中的(4)。(5)將10升培養罐培養的20升種子液，接入200升氣提式內環流培養器內，通氣量為150升/分，培養33小時，其它條件同實例1中(5)。(6)將(5)培養的160升種子液接入800升培養罐內，攪拌速度為160轉/分，通氣量為500升/分，其它條件同實施例1中的(6)。(7)將(6)培養的600升種子液接入3立方米發酵罐內，培養20小時，菌種濃度達8.7%，補加的烷基磷酸酯為3.0千克，用12N氫氧化鈉溶液將發酵液PH值由4.5逐步調至7.8，調節時間為4.5小時。轉入發酵后，發酵48小時，產酸量達到98.2克/升，繼續發酵72小時，產酸量高達166.3克/升，轉化率為84%。
權利要求
1.一種利用微生物異步發酵正構烷烴生產長鏈α·ω-二元酸的方法，將發酵菌種接入含有正構烷烴和發酵培養基的混合液中培養，在培養階段，調節培養液呈酸性，使菌種迅速生長，在較短的生長期內菌種達到一定濃度時，補加正構烷烴和乳化劑，調節培養液呈堿性，轉入發酵階段，直至發酵結束。其特征在于菌種生長和產酸分兩步進行。在培養階段，將含菌種的培養液pH值控制在4.0～6.0之間，培養菌種，α·ω-二元酸積累極少，當菌種濃度達到7-12%(濕菌重)時，補加一定量的正構烷烴和乳化劑，并逐步調節培養液pH值7.0～8.0之間，轉入發酵階段，在適宜條件下開始積累長鏈α·ω-二元酸。
2.按照權利要求1的方法，其特征在于轉發酵時的菌種濃度最好是8～10%。
3.按照權利要求1的方法，其特征在于補加的乳化劑最好是烷基磷酸酯，其適宜含量為1-5克/升，最好是1-3克/升。
4.按照權利要求1的方法，其特征在于培養階段正構烷烴投入量為2-15%(v/v)，最適宜投入量為5～10%。補加正構烷烴量為15-30%(v/v)，最好是20-25%。
5.按照權利要求1的方法，其特征在于培養階段培養液PH值最好是控制在4.5±0.1，發酵階段發酵液PH值最好控制在7.8±0.1。
6.按照權利要求1的方法其特征在于所說的微生物是熱帶假絲酵母屬的二元酸生產菌，最好是熱帶假絲酵母不完全阻斷型多倍體變異菌株。
7.按照權利要求1的方法，其特征在于所說的發酵培養基中蔗糖含量最好是20-30克/升，尿素含量最好是1-2克/升，維生素B1含量最好是0.1-0.2克/升，MgSO4·7H2O含量最好是1-2克/升。
8.按照權利要求1、4的方法，其特征在于所說的正構烷烴含有11-18個碳原子。
9.按照權利要求1的方法，其特征在于所說的正構烷烴含有12-16個碳原子比較好。
10.按照權利要求1、4的方法，其特征在于所說的正構烷烴最好含有13個碳原子。
全文摘要
本發明為微生物異步發酵生產長鏈α。ω-二元酸的方法。采用的微生物為熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)不完全阻斷型多倍體變異菌株。特點是，在微生物菌種接入發酵液后，控制體系pH在4.0～6.0之間，當培養基中菌濃達到7—12％(濕菌重)時，補加一定量的正構烷烴和乳化劑，并調節體系pH至7.0～8.0，開始發酵。當本方法用于正構十三烷烴發酵生產十三碳二元酸時，發酵72小時，產酸量可達100.1克/升，發酵120小時，產酸量可達144.4克/升。
文檔編號C12P7/44GK1071951SQ9110989
公開日1993年5月12日 申請日期1991年10月29日 優先權日1991年10月29日
發明者丁國卿, 佟明友, 李淑蘭, 王戰宇, 李春光, 王桂珠, 陳善剛 申請人:中國石油化工總公司撫順石油化工研究院