利用復合菌種發酵制備γ-氨基丁酸的方法
【專利摘要】本發明屬于利用微生物發酵制備天然產物的【技術領域】，具體涉及利用復合菌種發酵制備γ-氨基丁酸的方法。本發明的發酵菌株包括植物乳桿菌ZSM-002、卡斯特酒香酵母ZSM-001和保藏號為CCTCC NO：M 2014376的根霉(Rhizopus oryzae)zsm-005，其特征在于，以谷物種子或含胚副產物為原料，經清洗消毒、γ-氨基丁酸富集、分離提取、精制與純化等過程制備高濃度液態γ-氨基丁酸產品，液態γ-氨基丁酸經干燥過程制備高濃度固態γ-氨基丁酸產品。與現有技術相比，本發明采用多菌種協同發酵，可以提高谷物或含胚副產物富集γ-氨基丁酸的能力。CCTCC NO：M 2008
【專利說明】利用復合菌種發酵制備Y-氨基丁酸的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于利用微生物發酵制備天然產物的【技術領域】，具體涉及利用復合菌種發 酵制備Y-氨基丁酸的方法。本發明的發酵菌株涉及乳酸菌、酵母菌和根霉菌。

【背景技術】
[0002] γ -氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid,簡稱GABA)是一種由四碳非蛋白質組 成的天然氨基酸，是哺乳動物中樞神經系統重要的抑制性神經遞質，具有增強腦細胞代謝、 降血壓、活化腎功能、改善肝功能、防止肥胖、促進乙醇代謝等生理功能。隨著對其生理功能 研究的深入，Y-氨基丁酸已發展成為一種新型的活性功能因子，被廣泛應用于食品工業、 醫藥、食品保健、化工及農業等領域。
[0003] GABA由L-谷氨酸經谷氨酸脫竣酶催化發生脫羧反應制得，主要有生物合成法和 微生物發酵法，相比而言，利用微生物發酵法較為安全，成本較低。現有技術公開的菌株大 多都是以大腸桿菌為發酵GABA的菌株，但其存在安全方面的隱患。最近發現乳酸菌、酵母 菌和根霉中同樣擁有谷氨酸脫羧酶活性，可以催化底物L-谷氨酸合成GABA，可被應用于 GABA的合成領域。另外，酵母菌、乳酸菌和根霉三者可以共生，具有相近的生長條件，都可 以利用果糖、葡萄糖、麥芽糖等進行發酵。乳酸菌和根霉在發酵過程中水解淀粉、蛋白質及 脂肪等，產生易于吸收的單糖、游離氨基酸和揮發性脂肪酸以及多種維生素 （VBp VB2、葉酸 等），這些小分子物質為酵母菌的生長提供了豐富的營養來源。酵母大分子物質能誘導乳酸 菌中氨基肽酶的合成，使氨基酸含量增加，從而促進乳酸菌的生長。因此，酵母菌、乳酸菌和 根霉能相互依存，共生發酵，其代謝產物也對人體有益。所以采用乳酸菌、酵母菌和根霉復 合菌種發酵制備GABA可提高GABA的生成率。
[0004] 米類、豆類、麥類等谷物種子胚乳中都含有豐富的蛋白質，谷氨酸含量高，可以作 為生產GABA的良好底物。谷物種子中含有谷氨酸脫羧酶等內源酶，可以通過控制環境條 件，激活谷氨酸脫羧酶，轉化L-谷氨酸，富集GABA。另外，米糠、麩皮等是谷物加工的副產 物，是谷物表皮及胚等的混合物，富含多種營養物質和生理活性物質，蛋白質及氨基酸種類 較齊全，被譽為"天賜營養源"。用谷物副產物作為發酵合成GABA的培養基，具有配方簡單、 原料價格低廉、純天然、無污染等優點。
[0005] 目前，利用發酵方法制備Y-氨基丁酸的工藝已有一些進展：
[0006] 申請號為CN201210302371. 6的專利申請公開了一種微生物發酵合成Y-氨基丁 酸的方法，將短乳桿菌L2菌株經MRS培養平盤活化后，轉接到GYP種子培養基中用作發酵 種子，再以1?5%體積比的接種量接種于培養基（小米糠10?100g/L、L-谷氨酸鈉30? 8(^/1，培養基初始？!1為3.00?5.00)中，20?451：靜止培養50?8011，即得到高含￥-氨 基丁酸的乳酸菌發酵液，濃度可達到12?32g/L。與本發明比較接近的專利文獻是申請號 為CN02113140. 6的專利，該專利以乳酸菌或乳酸菌和酵母菌混用作為菌種，以0. 5%的接 種量接入PY培養基，添加〇. 5%?3%的碳源，0. 5%?5%的氮源，于25°C?40°C靜置培養 14?16h，所得發酵液中γ -氨基丁酸含量可達300?500mg/100mL。發酵液經中和、脫臭 后可直接干燥成粉劑，粉劑中Y-氨基丁酸含量在5%以上。但是該專利制備的γ-氨基丁 酸產品中GABA含量較低。
[0007] 盡管有上述文獻報道了一些利用微生物發酵制備Y-氨基丁酸方法，但目前尚未 見到利用乳酸菌、酵母菌和根霉復合菌種發酵制備Y -氨基丁酸的方法的報道。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于克服現有技術存在的缺陷，提供一種利用復合菌種發酵制備 Y -氨基丁酸的方法，本發明的復合菌種為自主篩選的乳酸菌（植物乳桿菌）、酵母菌和根 霉，具有酶系豐富，協同發酵能力強。本發明制備、富集Y-氨基丁酸的工藝方法操作簡便、 產量高、所得產物易于分離純化，生產過程無污染。
[0009] 本發明的技術方案如下所述：
[0010] 一種利用復合菌種發酵制備Y-氨基丁酸（簡稱GABA)的方法，包括如下步驟：
[0011] (1)原料的清洗消毒：將新鮮的谷物種子或含胚副產物清理后用1 %次氯酸鈉溶 液消毒，并用蒸餾水清洗；
[0012] ⑵ GABA 富集
[0013] 1)利用內源酶富集GABA
[0014] 將清洗消毒后的原料用1 %氯化鈣溶液于25?38°C下浸泡1?6h，用水清洗后于 25?38°C下培養4?24h，使其發芽，得到內源酶富集的高GABA谷物；
[0015] 2)利用復合菌種發酵富集GABA
[0016] 將上步得到的高GABA谷物加水，使谷物與水的體積比為1 :1，然后磨漿，在漿液中 加入L-谷氨酸鈉30?80g/L、葡萄糖10?50g/L、米糠10?100g/L，按體積比為0· 2? 5 %的接種量接種復合菌株，所述的復合菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) ZSM-002、卡斯特酒香酵母（Brettanomyces custersii)ZSM-001 和保藏號為 CCTCC NO: M 2014376 的根霉（Rhizopus sp.)zsm-005,三菌株的體積比為 0.001 ?3 :0.001 ?3: 0. 001?3,攪拌混勻后于20?45°C下密封發酵50?80h，得含γ -氨基丁酸的發酵液；
[0017] (3) GABA的分離提取
[0018] 1)離心：將所得的發酵液引入高速離心機中，于4?10°C、6000?12000r/min條 件下離心IOmin,收集上清液；
[0019] 2)絮凝：向上步所得的上清液加入0. 15?0. 5g/L的殼聚糖，于20?50°C下攪拌 絮凝，得絮凝液；
[0020] 3)過濾：將上步所得的絮凝液過濾，得濾液；
[0021] (4) GABA的精制與純化
[0022] 1)脫色：向所得的濾液中加入重量比為0. 5?2%的活性炭，混合均勻后于50? 80°C下攪拌10?50min，過濾得未純化的GABA溶液；
[0023] 2)濃縮：將上步未純化的GABA溶液于50?90°C溫度，5?30kPa壓力下濃縮20? lOOmin，使濃縮液體積為濃縮前的1/3?1/2,灌裝，得到濃縮的GABA溶液；
[0024] 3)滅菌：將上步所得的濃縮GABA溶液于80?120°C下滅菌20?40min，得到高 濃度液態GABA產品；
[0025] (5)將濃縮后的GABA溶液用噴霧干燥法干燥，得到固態GABA產品（粉劑）。
[0026] 作為本發明的優選方案，上述步驟（2)中2)的植物乳桿菌ZSM-002、卡斯特酒香酵 母ZSM-001和根霉zsm-005的體積比為2 :2 :1。
[0027] 本發明的特點或優勢在于：
[0028] (1)本發明采用復合菌種發酵，有利于發酵產物GABA濃度的提高：本發明采用植 物乳桿菌ZSM-002、卡斯特酒香酵母ZSM-OO1和根霉zsn-005復合菌種發酵就是為了建立一 種制備GABA的微生物復合體系，該復合體系能有效與本發明的工藝相結合，所述的植物乳 桿菌、卡斯特酒香酵母和根霉三者能相互依存、共生發酵，其代謝產物也對人體有益，采用 復合菌種發酵制備GABA可提高GABA的生成率。
[0029] (2)本發明在發酵底物上具有特色，采用內源酶富集GABA后的發芽谷物（或含胚 副產物）為發酵底物：谷物（或含胚副產物）發芽時，谷氨酸脫羧酶活性增加，將L-谷氨酸 轉化為GABA，以發芽谷物（或含胚副產物）為發酵底物，可提高產品GABA的濃度。
[0030] (3)本發明的發酵培養基采用谷物加工后的副產物米糠作為天然培養基，具有配 方簡單、原料價格低廉，易于分離純化等優點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 序列表SEQ ID NO :1是本發明的根霉（Rhizopus sp.) zsm-005的18SrDNA核苷酸 序列。
[0032] 圖1 :是本發明GABA總體生產工藝流程圖。
[0033] 圖2 :是發酵溫度對GABA生成的影響。
[0034] 圖3 :是發酵時間對GABA生成的影響。
[0035] 圖4 :是復合菌種接種量對GABA生成的影響。
[0036] 圖5 :是根霉（Rhizopus sp. ) zsm-005的微觀形態圖。
[0037] 圖中標記說明：圖5中的a圖是zsm-005的假根；圖5中的b圖是zsm-005的孢子 囊；圖5中的c圖是zsm-005的孢囊孢子；圖5中的d圖是zsm-005的厚垣孢子。
[0038] 圖6 :是本發明的根霉（Rhizopus sp. ) zsm-005的進化樹圖。

【具體實施方式】
[0039] 實施例1 :根霉（Rhizopus sp. ) zsm-005的分離、鑒定、菌學特征及其他微生物相 關信息
[0040] 1、根霉（Rhizopus sp. ) zsm-005 的分離、鑒定、保藏
[0041] 申請人:從湖北省孝感地區的民間傳統甜米酒的酒曲中分離得到一株根霉 (Rhizopus sp.)zsm_0〇5 菌株，將其命名為 Rhizopus sp.zsm_0〇5。
[0042] 具體步驟如下：
[0043] (1)分離方法（稀釋平板法）
[0044] 在無菌操作條件下，取10. Og來自湖北省孝感市的民間傳統甜米酒曲，加入到 90ml無菌水的三角瓶中（瓶中預先放一定數量的小玻璃珠），振動搖晃30min，然后進行梯 度稀釋，選擇稀釋度為10-3、10-4、10-5的稀釋液。無菌條件下取Iml稀釋樣液，轉移至培養 皿中，然后倒入PDA培養基，混勻后于30°C下培養。12h后開始挑取平面優勢霉菌菌絲體， 分別點種于查氏培養基中（李健容，蔡愛群.民間傳統酒曲卡要微牛物的分離及鑒定[J]. 釀酒科技，2007, I :111-121. )，30°C培養48h。平板純化四代后，轉PDA斜面（為常用培養 基）貯藏。
[0045] (2)鑒定方法
[0046] 1)本發明的根霉Rhizopus sp. zsm-005的分離、篩選和鑒定，普通微生物學鑒定 方法參照周德慶主編，《微生物學實驗手冊》，上海科學技術出版社，1986年；以及胡瑞卿譯， 《常見與常用真菌》，科學出版社，1973年報道的方法進行。
[0047] 2)利用插片法觀察霉菌微觀形態：將無菌蓋玻片以45°左右的角度并排插入PDA 平板培養基中，插入深度為蓋玻片的1/3左右。用無菌接種環挑取霉菌菌絲點種于蓋玻片 與培養基的交界線處，在30°C培養24h。用鑷子將蓋玻片小心取出，擦凈蓋玻片背面的培養 基和菌絲，放在載片上（有菌絲的一面朝下），置于顯微鏡下直接觀察。
[0048] (3)根霉zsm-005菌株的菌落形態特征：
[0049] 根霉zsm-005菌株在馬鈴薯培養基培養12h后，菌落直徑約為1?I. 5cm，菌絲較 致密，氣生菌絲生長較慢。24h后鋪滿平板，出現白色和黑色孢子。其微觀形態特征為：有 假根，孢囊梗直立生長，孢子囊近球形，灰褐色，直徑50?200um，孢囊孢子球形或橢圓形， 有厚垣孢子，經鑒定為根霉Rhizopus sp·。
[0050] 本發明的根霉zsm-005菌株的微觀形態特征見圖5所示。
[0051] (4)根霉（Rhizopus sp) zsm-005 的分子鑒定
[0052] 對上述分離篩選的根霉（Rhizopus sp) zsm-005菌株的18SrDNA序列進行了鑒定， 具體鑒定步驟如下：
[0053] 1)根霉基因組的提取：將供試菌株活化后轉接于50mL的PDA液體培養基中，30°C 搖床（200r/min)培養過夜。離心收集菌絲體，采用CTAB法（許璐.分子標記技術在紅曲 菌菌種鑒別中的應用.2007.)提取基因組DNA，經0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA提 取質量。若質量合格，_20°C保存備用。
[0054] 2) PCR 擴增：采用真菌 I 8SrDNA 通用引物：Pl (5, -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）、 P2(5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3'）以根霉的 DNA 基因組為模板，PCR 擴增根霉 18S rDNA 的部分基因序列。PCR擴增條件：94°C預變性5min ;94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸 2min，30次循環；72°C延伸7min。取2uL的PCR物于0. 8%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。
[0055] 3)將經0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗后的PCR擴增產物進行18SrDNA序列分析序列 測定（由南京金斯瑞生物技術有限公司完成）。將測序結果在NCBI數據庫中采用Blast軟 件進行在線比對分析，檢索結果為Rhizopus sp. zsm-005的序列與根霉Rhizopus sp.的序 列高度相似，同源性高達99%，并通過MEGA4軟件構建進化樹（見圖6)。確定本發明的菌 株為根霉（Rhizopus sp.)。
[0056] 4)菌株的保藏： 申請人:將以上所得到的根霉（Rhizopus sp) zsm-005菌株命名為 Rhizopus sp. zsm-005,于2014年8月8日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養物保 藏中心保藏，其保藏號為CCTCC NO :M2014376.
[0057] 本發明根霉zsm-005具有以下優點：
[0058] (1)該菌株生長速度較快，在發酵過程產生黑色孢子較少。
[0059] (2)該菌株可以作為優質專用發酵劑應用：例如該發酵劑應用在釀制的甜米酒汁 中游離氨基酸含量較高，含有麥芽糖等功能性低聚糖等，糖類組成豐富，營養價值更高，且 產品質量穩定，風味良好（在同日申請中，本發明應用舉例略）；該菌株應用在米面包專用 粉的生產上亦能夠顯著改善米面包專用粉的品質（在同日申請中，本發明應用舉例略）。
[0060] (3)該菌株可以與其他發酵菌株混合使用制成復合發酵劑，克服了傳統的單一菌 種發酵的缺陷，實現了多菌種協同發酵的優化模式，能夠顯著改善食品或提取的天然產物 的品質或得率。
[0061] 2、本發明中其他菌株的相關信息：
[0062] (1)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)ZSM-002，從米楽的發酵液 分離得到，保藏號為CCTCC NO :M209127,華中農業大學授權專利，參照文獻：專利 號：ZL2009100638581。
[0063] (2)卡斯特酒香酵母（Brettanomyces custersii)ZSM_001，從米楽的發酵液分 離得到，其保藏號為CCTCC NO :M207150,華中農業大學授權專利，參照文獻：專利號： ZL2007100536112。
[0064] (3)相關培養基及制備
[0065] 1)菌株的保藏培養基（即：瓊脂試管斜面培養基，以g/L計）：葡萄糖15g/L，酵母 膏 l〇g/L，蛋白胨 5g/L，乙酸鈉 2g/L，MgS04 · 7H20 0· 02g/L，MnS04 · 4H20 0· 001g/L，NaCl 0· 001g/L，FeS04 · 7H20 0· 001g/L，瓊脂 15g/L，ρΗ6· 8,用于菌株的保藏。
[0066] 2)菌株的活化培養基（S卩：改良MRS培養基，以g/L計）：蛋白胨10. 0g/L，牛肉 提取物10. 〇g/L，酵母提取物5. 0g/L，葡萄糖5. 0g/L，乙酸鈉2. 0g/L，檸檬酸二胺2g/L， MgS04 · 7H20 0· 2g/L，MnS04 · H20 0· 05g/L，ρΗ6· 5,用于菌株的活化。
[0067] 3)發酵種子培養基（S卩：GYP種子培養基，以g/L計）：胰蛋白胨5g/L，葡萄糖IOg/ L，酵母膏5g/L，丁二酸鈉5g/L，pH6. 5,用于復合菌株發酵種子的制備。
[0068] 4)發酵培養基（以g/L計）：L-谷氨酸鈉30?80g/L，葡萄糖10?50g/L、米糠 10?100g/L，pH3?5,用于發酵合成GABA。
[0069] 3.其他試驗材料
[0070] 實施例中所用的米糠由江蘇省徐州豐禾糧油有限公司提供。其它試劑從中國醫藥 (集團）上海化學試劑公司采購。
[0071] 4.制備工藝
[0072] 將植物乳桿菌ZSM-002菌株、卡斯特酒香酵母ZSM-001菌株和根霉zsm-005三菌 株接入MRS菌株活化培養基的液體培養基中，于30°C下靜止活化培養16h，取一環菌種轉接 到GYP種子培養基中，培養20?35h，用作發酵種子。然后按體積比為0. 2?5%的接種量 接種復合菌株，再與試驗材料一起充分混勻在20?45°C下密封發酵50?80h，得到未提純 的GABA的發酵液；發酵液經分離提取、精制純化等得到液態GABA產品，將液態GABA采用噴 霧干燥法干燥，即可得到固態GABA產品（粉劑）。
[0073] GABA的測定方法：參照文獻中GABA的測定方法（房克敏等.HPLC法測定發芽糙 米中Y-氨基丁酸含量[J]·食品科學，2006, 27 (4): 208-211·)。
[0074] 實施例2利用復合菌種發酵法生產GABA的舉例
[0075] (1)原料的清洗消毒：將新鮮糙米清理，去除碎粒、霉變粒和異色粒，用1 %濃度的 次氯酸鈉溶液消毒，并用自來水清洗，得潔凈糙米；
[0076] (2) GABA 富集
[0077] 1)利用內源酶富集GABA
[0078] 將潔凈糙米用1%濃度的氯化鈣溶液按體積比I :2(糙米：氯化鈣溶液）的比例 在30°C下浸泡6h，之后用蒸餾水清洗3次，浙去水分后，于35°C下培養16h，使其發芽。培 養過程中用營養液（配方：乳酸鈣ll〇mg/L、谷氨酸鈉2000mg/L)以水霧方式（具體方法參 照：黃漢英.趙思明，尹濤，等.一種適用于芽菜生產的智能化培養方法及智能化培養裝 置[P].專利號：ZL 20)噴灑在糙米表面，保持培養室內相對濕度為92%，并每 隔2h用5mg/L的臭氧氣體噴灑1次；培養完畢后，用蒸餾水清洗糙米3次，得到內源酶富集 的發芽糙米；
[0079] 2)利用復合菌種發酵富集GABA
[0080] 將上步得到的發芽糙米加水（發芽糙米：水=I :l，v/v)磨漿，向漿液中加入L-谷 氨酸鈉50g/L、葡萄糖40g/L、米糠60g/L，按體積比為3%的接種量向漿液中接種復合菌種 (植物乳桿菌ZSM-002 :卡斯特酒香酵母ZSM-OOl和根霉zsm-005,體積比為2 :2 :1)，攪拌 混勻后于30°C下密封發酵70h，得到含GABA的發酵液；
[0081] (3) GABA的分離提取
[0082] 1)離心：將所得的發酵液引入高速離心機中，于4°C、10000r/min條件下離心 lOmin，收集清液；
[0083] 2)絮凝：向上步的清液加入0. 25g/L的殼聚糖，于40°C下攪拌絮凝，得絮凝液；
[0084] 3)過濾：將所得的絮凝液過濾，得過濾液；
[0085] (4) GABA的精制與純化
[0086] 1)脫色：向過濾液中加入1% (重量比）活性炭，混合均勻后于70°C下攪拌30min， 過濾后得未純化的GABA溶液；
[0087] 2)濃縮：將上步未純化的GABA溶液于60°C、25kPa壓力下濃縮60min，使濃縮液體 積約為濃縮前的1/3左右，灌裝得濃縮的GABA溶液；
[0088] 3)滅菌：將上述濃縮的GABA溶液于90°C下滅菌40min，得高濃度液態GABA產品；
[0089] (5)或將濃縮后的GABA溶液用噴霧干燥法（具體方法參照：陳啟聰等，香蕉噴霧 干燥工藝優化[J].農業工程學報，2010, 26 (8) :331-336)干燥，得高濃度固態GABA產品 (粉劑）。
[0090] 本發明制備出的液態GABA產品中GABA含量可達29. 59g/L，固態GABA產品中GABA 含量可達60g/100g。
[0091] 實施例3發酵條件試驗
[0092] (1)適宜發酵溫度的確定
[0093] 將復合菌種（植物乳桿菌ZSM-002 :卡斯特酒香酵母ZSM-OOl :根霉zsm-005菌株 按體積比=2 :2 :1)按復合菌種與發酵培養基體積比為3%的接種量將復合菌株接種到發 酵培養基中（發酵培養基配方：L-谷氨酸鈉50g/L、葡萄糖40g/L、米糠60g/L，補充水分至 1L)中，分別在KTC、20°C、30°C、40°C、50°C、60°C六個溫度下發酵培養70h，用高效液相色 譜測定發酵液中GABA的含量。結果表明利用復合菌種發酵生產GABA的溫度以30°C為宜 (見圖2)。
[0094] (2)適宜發酵時間的確定
[0095] 將復合菌種（ZSM-002 :ZSM-001 :zsm-005菌株按體積比=2 :2 :1)按復合菌種與 發酵培養基體積比為3%的接種量將復合菌株接種到發酵培養基（發酵培養基配方同前） 中，30°C發酵培養120h，每IOh取樣測定發酵液中GABA的含量。結果顯示隨著發酵時間的 延長，GABA的生成量呈先增加后降低的趨勢。在發酵70h時，發酵液GABA含量最高（見圖 3)。
[0096] (3)復合菌種接種量的確定
[0097] 將復合菌種（ZSM-002 :ZSM-001 :ZSM-005 = 2 :2 :1，體積比）分別按復合菌種與發 酵培養基體積比為0. 、3%、4%、5%的接種量接種到發酵培養基中（發酵培養 基配方同前），30°C溫度下發酵培養70h，研究接種量對菌株發酵富集GABA的影響。試驗結 果表明接種量的變化影響菌體發酵生產GABA的能力，當接種量為3 %時，發酵液中GABA含 量最高，因此確定最佳接種量為3% (見圖4)。
[0098] 實施例4不同發酵底物生產GABA的應用舉例
[0099] 按照實施例1的工藝步驟，在本實施例中，將利用復合菌種發酵富集GABA中的發 酵底物分別采用糙米、米糠、發芽糙米、發芽米糠、發芽小麥、發芽麩皮、發芽綠豆，以探索利 用內源酶富集GABA過程對GABA生成量的影響，其它實施步驟與實施例1相同，實驗設計和 測試數據如表1-2所示。
[0100] 表1發酵底物配方設計

【權利要求】
1. 一種利用復合菌種發酵制備氨基丁酸（GABA)的方法，其特征包括如下步驟： (1)原料的清洗消毒：將新鮮的谷物種子或含胚副產物清理后用1 %次氯酸鈉溶液消 毒，并用蒸餾水清洗； ⑵GABA富集 1) 利用內源酶富集GABA 將清洗消毒后的原料用1 %氯化鈣溶液于25?38°C下浸泡1?6h，用水清洗后于25? 38°C下培養4?24h，使其發芽，得到內源酶富集的高GABA谷物； 2) 利用復合菌種發酵富集GABA 將上步得到的高GABA谷物加水，使谷物與水的體積比為1 :1，然后磨漿，在漿液中加入 L-谷氨酸鈉30?80g/L、葡萄糖10?50g/L、米糠10?100g/L，按體積比為0? 2?5 %的接 種量接種復合菌種，所述的復合菌種為植物乳桿菌（Lactobaci 1 lus plantarum) ZSM-002、 卡斯特酒香酵母（Brettanomyces custersii)ZSM-001 和保藏號為 CCTCC N0:M 2014376 的 根霉（Rhizopus sp. )zsm-005,三菌株的體積比為0? 001?3 :0? 001?3 :0? 001?3,攪拌 混勻后于20?45°C下密封發酵50?80h，得含Y _氨基丁酸的發酵液； (3) GABA的分離提取 1) 離心：將所得的發酵液引入高速離心機中，于4?10°C、6000?12000r/min條件下 離心10min,收集上清液； 2) 絮凝：向上步所得的上清液中加入0. 15?0. 5g/L的殼聚糖，于20?50°C下攪拌絮 凝，得絮凝液； 3) 過濾：將上步所得的絮凝液過濾，得濾液； (4) GABA的精制與純化 1) 脫色：向所得的濾液中加入重量比為〇. 5?2%的活性炭，混合均勻后于50?80°C 下攪拌10?50min，過濾得未純化的GABA溶液； 2) 濃縮：將上步未純化的GABA溶液于50?90°C溫度，5?30kPa壓力下濃縮20? lOOrnin，使濃縮液體積為濃縮前的1/3?1/2,灌裝，得到濃縮的GABA溶液； 3) 滅菌：將上步所得的濃縮GABA溶液于80?120°C下滅菌20?40min，得到高濃度 液態GABA產品； (5) 將濃縮后的GABA溶液用噴霧干燥法干燥，得到固態GABA產品； 其中： 步驟（1)中所述谷物包括糙米、玉米、黃豆、綠豆、小麥、大麥；所述的含胚副產物包括 米糠、麩皮。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中2)的植物乳桿菌ZSM-002、 卡斯特酒香酵母ZSM-001和根霉zsm-005的體積比為2 :2 :1。
3. 權利要求1或2所述的方法在谷物種子或含胚副產物富集Y -氨基丁酸中的應用。
【文檔編號】C12P39/00GK104388514SQ201410680599
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月23日 優先權日:2014年11月23日
【發明者】趙思明, 許綽微, 黃漢英, 熊善柏, 謝蒙蒙, 蘇鈺亭 申請人:華中農業大學