一種檢測小鼠內耳干細胞的標記分子及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測小鼠內耳干細胞的標記分子及應用，所述的標記分子為Opcml、Phex和Gdf10；本發明篩選出小鼠內耳干細胞特異性的細胞標記分子可以區分小鼠內耳干細胞與其他組織來源的細胞，也可為其他物種內耳干細胞特異性標記分子研究提供參考。
【專利說明】-種檢測小鼠內耳干細胞的標記分子及應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種小鼠內耳干細胞鑒定，特別涉及一種組合式細胞標記分子鑒定小 鼠內耳干細胞的新型方法，這種方法能特異性地鑒定分離和培養的小鼠內耳干細胞。 (二）

【背景技術】
[0002] 2003年首次從成年小鼠橢圓囊感覺上皮中發現了一類細胞：這些細胞在體外與 肌源性細胞聯合培養可沿著中胚層方向分化；體內實驗證明可在雞胚原腸胚形成過程中向 3個胚層方向分化。這類細胞命名為內耳干細胞。體外誘導證明內耳干細胞可以分化為毛 細胞樣細胞，提示內耳中存在干細胞或者毛細胞祖細胞。內耳干細胞具有自我更新和多分 化潛能，這種多潛能干細胞一個重要的特性就是在懸浮培養條件下可以形成球體。此后，研 究人員逐漸從耳蝸Corti器、大上皮脊、小上皮脊、前庭球囊和橢圓囊感覺上皮、三個半規 管的壺腹脊等不同組織中分離得到內耳干細胞。
[0003] 近年來的研究發現內耳干細胞具有多分化潛能，在特定的分化條件下可以發育成 內耳毛細胞。將內耳干細胞接種在多聚賴氨酸預先處理好的培養皿中，貼壁無血清培養。14 天之后，基因檢測表明分化之后的細胞表達毛細胞特異性蛋白，說明有部分細胞分化為內 耳毛細胞。對這些分化后的毛細胞進行電生理檢測，產生電壓依賴性電流。內耳干細胞在 體外除了可以分化為毛細胞之外，還可以分化為內耳支持細胞、神經元和星形膠質細胞等， 說明內耳干細胞具有多分化潛能，在將來遺傳性耳聾聽力功能重塑再生醫學方面具有重要 的應用價值。
[0004] 但是到目前為止，對內耳干細胞的研究不多。這主要是由于內耳干細胞的分離、 培養以及純化存在一定的困難。雖然目前有研究發現了一些不同物種內耳干細胞表達的 基因，但這些基因尚缺乏較強的組織特異性，例如成鼠分離的內耳干細胞表達的Nestin， Pax-2, BMP-4以及BMP-7,在其他的組織中也有不同程度的表達。因此，到目前為止尚缺乏 針對內耳干細胞特異性的細胞標記分子，這對內耳干細胞的分離和純化以及鑒定造成了一 定的困難，也是內耳干細胞應用研究方面存在的一個技術瓶頸。 (三）


【發明內容】

[0005] 本發明目的是提供一種鑒定小鼠內耳干細胞的標記分子，并采用這種標記分子特 異性地鑒定小鼠內耳干細胞的方法；本發明是通過對分離的小鼠內耳干細胞進行細胞球培 養方法獲得克隆的小鼠內耳干細胞，并提取小鼠內耳干細胞核糖核酸（RNA)進行小鼠基因 表達譜芯片檢測小鼠內耳干細胞基因表達譜，然后篩選特異性候選基因。最后從新生小鼠 中提取出如大腦、肝臟、皮膚等10個不同組織的RNA，對候選的目的基因進行特異性檢測， 確定小鼠內耳干細胞的特異性組合式細胞標記分子。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一種檢測小鼠內耳干細胞的標記分子，所述的標記分子為Opcml (核 苷酸序列為序列7所示）、Phex (核苷酸序列為序列8所示）和GdflO (核苷酸序列為序列 9所示）。
[0008] 本發明還提供一種所述的標記分子在檢測小鼠內耳干細胞中的應用，所述的應用 為：從小鼠耳蝸基底膜分離單細胞，提取單細胞總RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，分別 以Opcml正向引物和Opcml反向引物，Phex正向引物和Phex反向引物，GdflO正向引物和 GdflO反向引物作為三對引物進行PCR擴增，若Opcml正向引物和Opcml反向引物擴增產物 920bp，Phex正向引物和Phex反向引物擴增產物258bp，且Gdf 10正向引物和Gdf 10反向引 物擴增產物381bp，則單細胞為小鼠內耳干細胞；
[0009] Opcml 正向引物：5' -ATGTACCATCCCGCCTACTG-3' ；
[0010] Opcml 反向引物：5, -CCAGGCCCATACAGGGTGAT-3,；
[0011] GdflO 正向引物：5' -CAGTTTGACTGGCTGGGCTA-3' ；
[0012] GdflO 反向引物：5' -GGTCCCCTGGATTACCCTTG-3' ；
[0013] Phex 正向引物：5 ' -AGGTGTCAAAACCCCTGCAA-3 ' ；
[0014] Phex 反向引物：5 ' -GGACAATCTTGGGCATGGGG-3 '。
[0015] 本發明所述檢測小鼠內耳干細胞的標記分子按如下步驟篩選：
[0016] (1)內耳干細胞分離和成球培養
[0017] 解剖小鼠獲得小鼠耳蝸基底膜后，將基底膜胰酶消化，用移液槍吹打散后，獲得單 細胞，然后將單細胞懸浮在內耳干細胞培養基中，在37°C、5% CO2孵育箱中懸浮培養5-6 天，形成內耳干細胞球。本發明分離培養的小鼠內耳干細胞陽性表達Nestin、AbCg2、PaX-2、 BMP-4及BMP-7等基因。
[0018] (2)基因表達譜芯片檢測基因表達譜與特異性候選基因篩選
[0019] 將分離的內耳干細胞總RNA進行Phalanx小鼠基因表達譜檢測（檢測單位：上海 儀方生物科技有限公司）。經對比內耳毛細胞以及內耳祖細胞后，對內耳干細胞差異表達性 基因進行進一步分析，從內耳干細胞中篩選出30個特異表達的基因。
[0020] (3)特異性組合式細胞標記分子驗證
[0021] 根據內耳干細胞篩選的30種特異表達的基因，結合比較內耳祖細胞及毛細胞中 特異表達的基因，候選Opcml、Phex和Gdf 10共3種基因，對小鼠大腦、肝臟、皮膚、肺、腸、 胃、腎臟、肌肉、心臟及眼睛10個不同的組織及器官進行RNA提取后，聚合酶鏈反應（PCR) 檢測這3種基因在不同組織細胞內的表達水平，驗證出Opcml、Phex和GdflO三種分子組 合為小鼠內耳干細胞最佳組合式細胞標記分子。通過小鼠不同組織3種候選基因的分子檢 測，只有在小鼠內耳干細胞中〇pcml、Phex和GdflO這三種基因都是陽性表達的。因此這三 種基因的組合陽性表達可作為小鼠內耳干細胞的分子標記。
[0022] 本發明提供的標記分子在小鼠內耳干細胞中是特異性表達的，通過Phalanx小鼠 基因表達譜的檢測，表明Opcml、Phex和GdflO三種基因具有顯著的高水平表達，可應用于 小鼠內耳干細胞的鑒定，用于小鼠內耳干細胞的分選和純化依據，亦可應用于小鼠分離或 體外培養擴增的內耳干細胞分選以及純化研究。
[0023] 本發明的有益效果是：
[0024] (1)本發明篩選出小鼠內耳干細胞特異性的細胞標記分子OpcmUPhex和GdflO。
[0025] (2)以本發明提供的細胞標記分子可以區分小鼠內耳干細胞與其他組織來源的細 胞。
[0026] (3)使用本發明提供的細胞標記分子的陽性表達可鑒定小鼠內耳干細胞，為發展 新的分離純化技術提供依據。
[0027] (4)本發明提供的細胞標記分子也可為其他物種內耳干細胞特異性標記分子研究 提供參考。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1小鼠內耳干細胞球顯微圖，A行為100X放大倍數下，內耳干細胞在培養1、3、 5天的形態，B行為250X放大倍數下，內耳干細胞在培養1、3、5天的形態；C行為用DAPI 對培養1、3、5天的內耳干細胞球染色后，250X放大倍數下顯微圖。
[0029] 圖2小鼠內耳干細胞基因表達電泳圖，泳道1為Marker，泳道2為GAPDH，泳道3 為Nestin，泳道4為Abcg2,泳道5為Pax-2,泳道6為BMP-4,泳道7為BMP-7。
[0030] 圖3小鼠內耳干細胞球5-Brdu染色激光共聚焦顯微圖，a為使用DAPI觀察內耳 干細胞球中的細胞核，b為Brdu抗體標志顯微圖，c為a與b合并圖。
[0031] 圖4小鼠內耳干細胞Nestin表達激光共聚焦顯微圖，a為使用DAPI觀察內耳干 細胞球中的細胞核，b是Nestin抗體標志顯微圖，c為DAPI與Nestin共同標志顯微圖。
[0032] 圖5候選基因在不同組織中的表達電泳圖，泳道1為大腦，泳道2為肝臟，泳道3為 皮膚，泳道4為肺，泳道5為腸，泳道6為胃，泳道7為腎臟，泳道8為肌肉，泳道9為心臟， 泳道10為眼睛，泳道11為內耳干細胞。
[0033] 圖6標志分子Opcml+Phex+GdflO在不同類型細胞中的表達電泳圖，泳道1為內耳 單細胞檢測Opcml，泳道2為內耳單細胞Phex，泳道3為內耳單細胞檢測Gdf 10 ;泳道4為 肺組織細胞檢測Opcml，泳道5為肺組織細胞檢測Phex，泳道6為肺組織細胞檢測Gdf 10 ; 泳道7為腸組織細胞檢測Opcml，泳道8為腸組織細胞檢測Phex，泳道9為肺組織細胞檢測 表達Gdf 10。 (五）

【具體實施方式】
[0034] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0035] 本發明實施例所用PBS的pH值均為7. 4。
[0036] 實施例1小鼠內耳干細胞的分離及培養
[0037] 1)將ICR小鼠（浙江省醫學科學院）在-20°C冰箱中麻醉5分鐘，浸入75%酒精 中殺菌。用手術剪將小鼠直接斷頭，去除皮毛。然后在無菌狀態下中分頭顱，去除大腦及腦 干，充分暴露位于顱底的顳骨。仔細的用剪刀和鑷子分離出顳骨，將其轉移到裝有4°C預冷 PBS (pH值為7. 4)的3. 5cm培養皿中。顯微鏡下用鑷子在耳蝸底部鉆一個小孔，從下至上剖 開螺殼，暴露完整的蝸軸和蝸管。用鑷子夾住耳蝸管的最底部，將耳蝸管與蝸軸分離。由此 得到的耳蝸管包括螺旋韌帶、前庭膜、以及基底膜（包含Corti器）。將分離得到的耳蝸管 轉移到新鮮4°C預冷的PBS中，進一步將包含Corti器的基底膜與前庭膜及螺旋韌帶分離 開。將基底膜轉移到100 μ L 0.05% (w/v)的胰酶（購自Gbico)中，37°C消化7分鐘，力口 入100 μ I lmg/ml的大豆胰酶抑制劑（PBS緩沖液配制，購自Gbico, pH = 7. 4)終止胰酶反 應。
[0038] 2)用量程為200 μ L的移液槍吹打步驟1)反應物30-40次，使單細胞從基底膜中 脫落。細胞脫落后經70 μ m的細胞篩過濾，去除較大的組織殘骸與碎片，得到幾乎沒有大細 胞聚集的單細胞懸液。然后用內耳干細胞培養基稀釋，細胞密度為l〇 5/ml，獲得稀釋后的 單細胞懸液。內耳干細胞培養基組成為：1% (v/v)B27(血清替代物B27)、2% (v/v)N2(血 清替代物N2)、20ng/mL EGF(表皮生長因子）、50ng/mL bFGF (堿性成纖維細胞生長因子）、 10ng/mL IGF-I (類胰島素生長因子1)、50 μ g/ml青霉素，溶劑為DMEM/F12 (購自Gbico)， DMEM/F12 組成為 DMEM 和 Ham's F-12, pH 值為 L 4。
[0039] 3)稀釋后的單細胞懸液經20 μ m的細胞篩過濾，獲得單細胞懸液。
[0040] 4)取步驟3)獲得的200 μ L單細胞懸液，用2mL內耳干細胞培養基稀釋后在37°C、 5% CO2孵育箱中懸浮培養1-5天，其中內耳干細胞會形成內耳干細胞球，其它非干細胞的 細胞由于生長條件的限制而逐漸凋亡。分別取50 μ L培養1、3和5天的內耳干細胞培養基 滴于玻片上，在顯微鏡下分別放大100倍（圖1中的A行）和250倍（圖1中的B行）觀 察內耳干細胞球。同時，分別取50 μ L培養1、3和5天的內耳干細胞培養基，讓其中的內耳 干細胞球在玻片上貼壁后，用200 μ L DAPI試劑（Roche公司）孵育細胞球1-3分鐘，進行 DAPI染色，并放大250倍觀察內耳干細胞球，如圖1中C行所示，每一個細胞球里有幾十至 數百個細胞。
[0041] 實施例2內耳干細胞基因表達檢測
[0042] 1)內耳干細胞總RNA提取：將實施例1中培養5天的含內耳干細胞球的培養基收 集在15ml離心管中，IOOOrpm離心5分鐘棄上清；加入ImL TRIzol (TakaRa公司），置漩潤 振蕩器上震蕩至內耳干細胞完全溶解后，轉移至1.5ml EP管（Axgen公司）中；加入200 μ L 氯仿（國藥集團化學試劑有限公司），劇烈振蕩混勻，室溫放置5min ;4°C下12, OOOrpm離心 15min，吸取上層水相約300 μ L入新的I. 5ml EP管中；加入等體積的異丙醇（國藥集團化 學試劑有限公司），顛倒混勻，室溫靜置IOmin ;4°C下12, OOOrpm離心IOmin,棄上清；用體 積濃度75%的乙醇水溶液洗漆沉淀，4?下12, OOOrpm離心5min，棄上清；室溫干燥2-5min 后，加入適量DEPC水（Sigma公司）溶解，即為內耳干細胞總RNA樣品，用于下一步實驗或 保存于_80°C冰箱。
[0043] 2) cDNA第一鏈合成：內耳干細胞總RNA樣品用DNA酶（Sigma公司）消化處理清 除殘余的基因組DNA污染，用紫外分光光度計測定（波長為260nm) RNA濃度。cDNA第一鏈 合成采用反轉錄試劑盒（Fermentas公司），取2 μ g總RNA(0. 5-1 μ L)用于第一鏈合成，平 行3次。具體步驟如下：2 μ g總RNA (0. 5-1 μ L)、1 μ L oligo (dT) 18引物和1 μ L隨機引物， CldH2O 補至總體積 12μ L，置 65°C反應 5min ;加入 5Xbuffer 4μ L、dNTP2y L、ribolockTM RNase inhibitor 1 μ L 和 RevertAidTM M-MulV 反轉錄酶 1 μ L，反應總體積為 20 μ L，PCR 反應程序為25°C 5min - 42°C 60min - 70°C 5min，RNA反轉錄產物即為cDNA第一鏈，用 于下一步PCR反應。
[0044] 3)PCR反應：將步驟2)制備的cDNA第一鏈作為模板進行RT-PCR擴增，所用引物序 列見表1。PCR反應采用PCR Mix試劑盒（上海翊圣生物技術有限公司），PCR反應體系為： cDNA 2yL、2mM dNTP 1μ?、10μΜ 的上下游引物各 IyUlOXbufTer(含 1.5mM Mg2+)5yL 和TaqDNA聚合酶1 μ L，加 H2O補至總體積50 μ L。PCR程序為：94°C預變性5min，94°C變性 30s，53°C?62°C退火30s，72°C延伸30s，35循環，72°C延伸7min，退火溫度和循環數根據 引物的具體情況進行選擇。反應完成后取5 μ L擴增產物加1 μ L溴酚蘭指示劑（Sigma公 司），用1. 2%的瓊脂糖（Biowest公司）進行凝膠電泳。采用RT-PCR檢測細胞球中干細胞 標志基因 Nestin、Abcg2以及內耳發育標志基因 Pax-2、BMP-4及BMP-7的表達情況，GAPDH 作為參照基因。電泳完畢后，用凝膠成像分析系統觀測，結果如圖2,表明實施例1中培養得 到的細胞球中含有內耳干細胞。
[0045] 表1用于RT-PCR的引物序列
[0046]

【權利要求】
1. 一種檢測小鼠內耳干細胞的標記分子，其特征在于所述的標記分子為Opcml、Phex 和 GdflO。
2. -種權利要求1所述的標記分子在檢測小鼠內耳干細胞中的應用，其特征在于所述 的應用為：從小鼠耳蝸基底膜分離單細胞，提取單細胞總RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模 板，分別以Opcml正向引物和Opcml反向引物，Phex正向引物和Phex反向引物，GdflO正 向引物和Gdf 10反向引物作為三對引物進行PCR擴增，若Opcml正向引物和Opcml反向引 物擴增產物920bp，Phex正向引物和Phex反向引物擴增產物258bp，且GdflO正向引物和 GdflO反向引物擴增產物381bp，則單細胞為小鼠內耳干細胞； Opcml 正向引物：5' -ATGTACCATCCCGCCTACTG-3' ； Opcml 反向引物：5 ' -CCAGGCCCATACAGGGTGAT-3 ' ； GdflO 正向引物：5' -CAGTTTGACTGGCTGGGCTA-3' ； GdflO 反向引物：5' -GGTCCCCTGGATTACCCTTG-3' ； Phex 正向引物：5' -AGGTGTCAAAACCCCTGCAA-3' ； Phex 反向引物：5' -GGACAATCTTGGGCATGGGG-3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK104278029SQ201410495125
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月24日 優先權日:2014年9月24日
【發明者】王金福, 柳全文 申請人:浙江大學