小鼠脂肪干細胞自發轉化的鑒定方法
【專利摘要】本發明公開了小鼠脂肪干細胞自發轉化的鑒定方法，將小鼠脂肪干細胞在體外連續傳代，然后包括形態學的變化、增殖速度的激增、異常染色體的出現和比例的增加、DNA含量的降低以及表面分子的變化五個步驟。其中形態學和增殖速度的觀察與檢測可用于初步的判斷小鼠脂肪干細胞是否發生了轉化；染色體的核型分析從局部水平上來分析小鼠脂肪干細胞染色體是否異常，而DNA含量的分析則從整體水平上來檢測核物質的量變，此二法最能說明小鼠脂肪干細胞的轉化與否；小鼠脂肪轉化后，同時也引起小鼠脂肪干細胞典型分子的表達異常，包括CD44，CD105和Sca-1的變化，反而言之，后期研究中，也可以通過監測這些表面分子的變化來判斷小鼠脂肪干細胞的轉化，此法則更為簡單、直接與有效。
【專利說明】小鼠脂肪干細胞自發轉化的鑒定方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種小鼠脂肪干細胞自發轉化的鑒定方法。

【背景技術】
[0002]脂肪干細胞具有多向分化的潛能，在體外可定向分化為脂肪、成骨、軟骨、肝臟、心肌細胞等，相比于骨髓干細胞，其具有取材容易、獲取量大等優點，而且還具有免疫抑制的效應，因此具有重要的意義。
[0003]小鼠作為一個重要的模式動物，在基礎研究方面有著廣泛的應用，但是脂肪干細胞在體外培養時，其生物學特性很容易發生改變，對于如何有效的鑒定小鼠脂肪干細胞是否發生了自發轉化，目前還缺乏全面且典型的檢測指標。


【發明內容】

[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種小鼠脂肪干細胞自發轉化的鑒定方法，為小鼠脂肪干細胞轉化的鑒定提供全面，簡單，有效的檢測指標。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:小鼠脂肪干細胞自發轉化的鑒定方法，對小鼠脂肪干細胞分離與培養，將小鼠脂肪干細胞在體外連續傳代，同時進行包括以下步驟的操作:
[0006](I)形態學觀察:分別觀察低代次正常細胞，初見衰老時的細胞和越過衰老后細胞的形態，從形態學上觀察越過衰老后細胞是否出現異常；
[0007](2)增殖速度檢測:分別繪制低代次正常細胞，初見衰老時的細胞和越過衰老后細胞的生長曲線，計算各自的細胞倍增時間，從增殖速度的角度觀察越過衰老后細胞是否出現異常；
[0008](3)染色體形態與數量分析:分別對低代次的正常細胞和越過衰老后的細胞進行低滲，固定和破核處理，釋放出染色體后，用Giemsa染色法，分別對這兩種細胞的染色體進行染色，微鏡下統計每個細胞染色體的數量以及染色體的形態特征；
[0009](4)DNA的含量分析:分別消化低代次的正常細胞和越過衰老后的細胞，PI染色后，用流式細胞儀分別檢測這兩種細胞內DNA的含量，觀察越過衰老后的細胞的DNA含量是否有明顯的變化；
[0010](5)表面分子的表達:分別消化低代次的正常細胞和越過衰老后的細胞，分別用針對CD44，CD105和Sca-1的熒光抗體與細胞結合，再用流式細胞儀檢測這兩種細胞中⑶44，⑶105和Sca-1的陽性率和表達強度，通過其變化來檢測小鼠脂肪干細胞是否發生了轉化。
[0011]作為優選，上述小鼠脂肪干細胞的分離與培養過程包括以下步驟:
[0012](6)取4周齡的ICR雄鼠，處死，對其全身消毒；
[0013](7)無菌條件下切取腹股溝處的脂肪組織，放入DMEM/F12中洗凈血污；
[0014](8)充分剪碎，加入消化液，37°C消化lh，消化液的組成成分為10%胎牛血清(FBS)，0.09%膠原酶 I，余量為 DMEM/F12 ；
[0015](9)消化完后，離心，棄掉上層成熟脂肪細胞和中層的消化液，再用DMEM/F12重懸底層的細胞；
[0016](10)將細胞懸液依次用孔徑為250 μ m和80 μ m的尼龍濾網過濾細胞懸液，收集濾液；
[0017](11)將最后得到的濾液離心，吸棄漂浮的脂肪細胞，用基礎培養基反復洗滌3遍，再用含20%胎牛血清，4ng/ml堿性成纖維生長因子，50 μ g/ml維生素C的DMEM/F12中連續傳代。
[0018]本發明的有益效果是:
[0019]提供了更全面的檢測小鼠脂肪干細胞自發轉化的指標，研究人員可以根據實際條件選擇合適的指標來鑒定細胞，以確保細胞的生物安全性和有效性。

【具體實施方式】
[0020]為了使本發明要解決的技術問題及有益效果更加清楚明白，以下結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0021]一、首先對小鼠脂肪干細胞的分離與培養，包括以下步驟:
[0022](I)取4周齡的ICR雄鼠，處死，對其全身消毒；
[0023](2)無菌條件下切取腹股溝處的脂肪組織，放入DMEM/F12中洗凈血污；
[0024](3)充分剪碎，加入消化液，37°C消化lh，消化液的組成成分為10%胎牛血清(FBS)，0.09%膠原酶 I，余量為 DMEM/F12 ；
[0025](4)消化完后，離心，棄掉上層成熟脂肪細胞和中層的消化液，再用DMEM/F12重懸底層的細胞；
[0026](5)將細胞懸液依次用孔徑為250 μ m和80 μ m的尼龍濾網過濾細胞懸液，收集濾液；
[0027](6)將最后得到的濾液離心，吸棄漂浮的脂肪細胞，用基礎培養基反復洗滌3遍，再用含20%胎牛血清，4ng/ml堿性成纖維生長因子，50 μ g/ml維生素C的DMEM/F12中連續傳代。
[0028]二、在上述小鼠脂肪干細胞的分離與培養的基礎上，將小鼠脂肪干細胞在體外連續傳代，同時進行包括以下步驟的操作:
[0029](7)形態學觀察:
[0030]方法:將小鼠脂肪干細胞在體外連續傳代，分別觀察對比第3代(即低代次狀態良好時的小鼠脂肪干細胞)，第23代(即高代次衰老的小鼠脂肪干細胞)，第30代(即高代次越過衰老的小鼠脂肪干細胞)的形態特征。
[0031]結果:發現細胞在第3代的時立體感很強，細胞很細小飽滿，典型的成纖維狀，說明其狀態良好；待其生長至23代時，細胞逐漸拉長，細胞質部分顯得寬大，立體感變弱，細胞界限不清晰，說明細胞狀態變差；再待其傳至第30代，細胞密度較稀時，細胞形態已明顯發生了改變，呈現出細長的神經細胞樣，待其長滿后，則成鋪路石狀，細胞立體感非常強，細胞間的界限非常明顯，說明其狀態非常好。
[0032] 細胞在體外隨著細胞的傳代培養，細胞會逐漸衰老直至死亡，此為正常現象，但是小鼠脂肪干細胞在傳代過程中呈現的則是先衰老，狀態變差，隨著進一步的傳代，其又逆轉到良好的狀態，通過此非正常的變化，可以初步判斷小鼠脂肪干細胞已經發生了自發轉化。
[0033](8)增殖速度檢測:
[0034]方法:將第3代(即低代次狀態良好的小鼠脂肪干細胞)和第30代(即越過衰老后的的小鼠脂肪干細胞)分別接種到24孔板中，每孔I萬細胞。24h后對每組細胞進行細胞計數，每天3孔，連計數8天，繪制生長曲線，并計算三組細胞的倍增時，以確定其增長速度。
[0035]結果:第3代的細胞生長迅速，細胞倍增的時間為24.2±0.91h ;當細胞傳至第16代時，倍增時間延長為36.1±1.81h，說明其增殖速度變慢；待其再傳至30代時，細胞的倍增時間為16.2±0.46h，且比第三代的還要短，說明其增殖速度比第3代的還要快。
[0036]細胞隨著代次的增加會逐漸衰老，表現在增殖速率上則是生長速度的降低。但是小鼠脂肪干細胞隨著代次的進一步增加，反而增殖速度會進一步的提高，預示著細胞可能出現了異常，亦可作為一個初步判斷細胞自發轉化的指標。
[0037](9)染色體核型分析
[0038]方法:分別將第3代(即低代次狀態良好的小鼠脂肪干細胞)和第30代(即越過衰老后的的小鼠脂肪干細胞)用0.1 μ g/ml秋水仙素37度處理2小時，再用胰酶消化細胞，然后用0.075M KCL37度低滲處理細胞30min。低滲結束后，1200rpm離心1min細胞，再棄去上清液，加入4ml的固定液固定30min，重復2次。最后一次離心后棄上清，滴片，最后Giemsa染色,顯微鏡下觀察。
[0039]結果:發現細胞傳至30代，小鼠脂肪干細胞的染色體出現了單倍體，三倍體，斷裂和融合這些異常的核型，且這些異常染色體的比例將近95%。而第三代的脂肪干細胞核型基本正常，且異常染色體的比例僅為8%，由此可以從局部水平上說明細胞發生了自發轉化。
[0040](10) DNA 含量分析
[0041]方法:分別消化第3代(即低代次狀態良好的小鼠脂肪干細胞)、第16代(初見衰老后的小鼠脂肪干細胞)和第30代(即越過衰老后的的小鼠脂肪干細胞)，用碘化丙啶染色15min，使其與DNA充分結合；之后再用I %的多聚甲醛固定15min以固定細胞的形態，用流式細胞儀檢測兩組細胞的DNA含量。
[0042]結果:相比于第3代的小鼠脂肪干細胞，第30代細胞的DNA指數僅為0.84，顯著的低于第3代的細胞，說明第30代的細胞的DNA含量已經明顯的減少，從而在DNA整體水平上確定小鼠脂肪干細胞確實已經發生了自發轉化。
[0043](11)表面分子的分析
[0044]方法:用tryple分別消化第3代(即低代次狀態良好的小鼠脂肪干細胞)和第30代(即越過衰老后的的小鼠脂肪干細胞)，分別用⑶44，⑶105和Sca-1的熒光直標單抗與之冰上共孵育30min，使抗體與細胞充分結合。孵育結束后，用預冷的杜氏磷酸鹽緩沖液洗漆3遍,充分洗去未結合的抗體。最后一次洗漆離心后,用1%的多聚甲醒固定30min,再用流式細胞儀檢測這兩種代次細胞⑶44，⑶105和Sca-1的表達情況。
[0045] 結果:與第3代的小鼠脂肪干細胞相比，細胞傳至30代。⑶44表達的陽性率不會有明顯的改變，但是Sca-1的表達率會極顯著的升高，而CD105則完全不表達。對于陽性表達的⑶44與Sca-1，與第三代的小鼠脂肪干細胞相比，第30代的細胞⑶44的平均表達水平極顯著的降低，而Sca-1的平均表達水平則極顯著的升高。因此可以Sca-1陽性率及陽性表達水平的顯著升高，⑶44平均表達水平的降低，以及⑶105表達的消失為指標來確定細胞發生了自發轉化。
[0046]本實施例所述的小鼠脂肪干細胞自發轉化的鑒定方法具有以下特點:
[0047]1.從小鼠脂肪干細胞的狀態的由好變差，然后再變好的異常變化來判斷小鼠脂肪干細胞發生了自發轉化。
[0048]2.從小鼠脂肪干細胞的增殖速度由快變慢，再顯著加快的異常變化來判斷小鼠脂肪干細胞發生了自發轉化。
[0049]3.通過染色體的核型分析，觀察染色體的異常變化，從局部水平上來判斷小鼠脂肪干細胞發生了自發轉化。
[0050]4.通過DNA含量的分析，從整體水平上判斷小鼠脂肪干細胞發生了自發轉化。[0051 ] 5.通過⑶44陽性的小鼠脂肪干細胞⑶44平均表達水平的顯著降低來判斷小鼠脂肪干細胞發生了自發轉化。
[0052]6.通過小鼠脂肪干細胞Sca-1的陽性率降低來判斷小鼠脂肪干細胞發生了自發轉化。
[0053]7.通過Sca-1陽性的小鼠脂肪干細胞Sca-1平均表達水平的顯著升高來判斷小鼠脂肪干細胞發生了自發轉化。
[0054]8.通過小鼠脂肪干細胞⑶105表達的消失來判斷小鼠脂肪干細胞發生了自發轉化。
[0055]本實施例建立了一套全面檢測小鼠脂肪干細胞自發轉化的方法，包括形態學的變化，增殖速度的激增，異常染色體的出現和比例的增加，DNA含量的降低以及表面分子的變化。其中形態學和增殖速度的觀察與檢測可用于初步的判斷小鼠脂肪干細胞是否發生了轉化，操作起來簡單易行；染色體的核型分析從局部水平上來分析小鼠脂肪干細胞染色體是否異常，而DNA含量的分析則從整體水平上來檢測核物質的量變，此二法操作起來較復雜，卻最能說明小鼠脂肪干細胞的轉化與否。小鼠脂肪轉化后，同時也引起小鼠脂肪干細胞典型分子的表達異常，包括⑶44，⑶105和Sca-1的變化，反而言之，后期研究中，也可以通過監測這些表面分子的變化來判斷小鼠脂肪干細胞的轉化，此法則更為簡單，直接與有效。
[0056]以上所述的本發明實施方式，并不構成對本發明保護范圍的限定。任何在本發明的精神和原則之內所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的權利要求保護范圍之內。
【權利要求】
1.小鼠脂肪干細胞自發轉化的鑒定方法，其特征在于:對小鼠脂肪干細胞分離與培養，將小鼠脂肪干細胞在體外連續傳代，同時進行包括以下步驟的操作: (1)形態學觀察:分別觀察低代次正常細胞，初見衰老時的細胞和越過衰老后細胞的形態，從形態學上觀察越過衰老后細胞是否出現異常； (2)增殖速度檢測:分別繪制低代次正常細胞，初見衰老時的細胞和越過衰老后細胞的生長曲線，計算各自的細胞倍增時間，從增殖速度的角度觀察越過衰老后細胞是否出現異常； (3)染色體形態與數量分析:分別對低代次的正常細胞和越過衰老后的細胞進行低滲，固定和破核處理，釋放出染色體后，用Giemsa染色法，分別對這兩種細胞的染色體進行染色，顯微鏡下統計每個細胞染色體的數量以及染色體的形態特征； (4)DNA的含量分析:分別消化低代次的正常細胞和越過衰老后的細胞，PI染色后，用流式細胞儀分別檢測這兩種細胞內DNA的含量，觀察越過衰老后的細胞的DNA含量是否有明顯的變化； (5)表面分子的表達:分別消化低代次的正常細胞和越過衰老后的細胞，分別用針對⑶44，⑶105和Sca-1的熒光抗體與細胞結合，再用流式細胞儀檢測這兩種細胞中⑶44，⑶105和Sca-1的陽性率和表達強度，通過其變化來檢測小鼠脂肪干細胞是否發生了轉化。
2.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于:所述小鼠脂肪干細胞的分離與培養包括以下步驟: (6)取4周齡的ICR雄鼠，處死，對其全身消毒； (7)無菌條件下切取腹股溝處的脂肪組織，放入DMEM/F12中洗凈血污； (8)充分剪碎，加入消化液，37°C消化lh，消化液的組成成分為10%胎牛血清(FBS)，.0.09%膠原酶I，余量為DMEM/F12 ； (9)消化完后，離心，棄掉上層成熟脂肪細胞和中層的消化液，再用DMEM/F12重懸底層的細胞； (10)將細胞懸液依次用孔徑為250μ m和80 μ m的尼龍濾網過濾細胞懸液，收集濾液； (11)將最后得到的濾液離心，吸棄漂浮的脂肪細胞，用基礎培養基反復洗滌3遍，再用含20%胎牛血清，4ng/ml堿性成纖維生長因子，50μδ/πι1維生素C的DMEM/F12中連續傳代。
【文檔編號】C12Q1/04GK104073466SQ201410000495
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】張運海, 魏超, 李運生, 章孝榮, 方富貴, 張鵬飛, 李俠, 姜少帥, 韓菲, 宋丹丹, 劉通 申請人:安徽農業大學