一株深海真菌枝孢霉及其提取物和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株深海真菌枝孢霉及其提取物和應用。深海真菌枝孢霉(Cladosporium?sp.)FS86于2014年3月27日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址：中國武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC?NO：M?2014108，其發酵提取物對病原真菌白色念珠菌(Candida?albicans)、黑曲霉(Aspergillus?niger)、黃曲霉(Aspergillus?flavus)、綠色木霉(Trichoderma?viride)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum?gloeosporioides)、柱枝雙孢霉(Cylindrocladium?scoparium)或新月彎孢霉(Curvularia?lunata)具有顯著抑制效果。因此，本發明的實現，為開發新的抗病原真菌藥物和發掘深海真菌來源的天然活性物質提供了科學依據。
【專利說明】一株深海真菌枝孢霉及其提取物和應用
【技術領域】:
[0001]本發明屬于生物和醫藥【技術領域】,具體涉及一株深海真菌枝孢霉(Cladosporiumsp.)FS86,以及從該菌株的液體培養產物中制備的發酵提取物，和該提取物在制備抗病原真菌藥物中的應用。
【背景技術】:
[0002]白色念珠菌(Candidaalbicans)是一種重要的條件致病性真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道，一般在正常機體中數量少，不引起疾病，當機體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制約作用失調，則本菌大量繁殖并改變生長形式(芽生菌絲相)侵入細胞引起疾病。近年來隨著大劑量抗生素、激素、免疫抑制劑的應用，以及器官移植術的開展，使深部真菌感染日益增多并可危及生命。白色念珠菌病主要是引起的急性、亞急性或慢性感染，是最常見的真菌病，日益嚴重的耐藥現象和有限的治療藥物使白色念珠菌感染成為臨床上迫切需要解決的問題。
[0003]植物病原真菌是植物病害的主要病原微生物，是威脅植物生存的重大因素，每年都給農林業生產帶來巨大損失。目前植物真菌病害仍以有機合成的化學藥劑防治為主，但大量化學農藥的使用，不但對人類環境造成了嚴重危害，而且增加了病原真菌的抗藥性。在人類越來越關注環境質量的今天，加強生物防治在植物病害中的應用，是病害防治的必然選擇。因此，從微生物資源中尋找新的活性物質代替化學農藥和使用天然抗菌化合物保護作物已成為當前研 究的重點。
[0004]海洋約占地球表面積的71%，蘊藏豐富的微生物資源，其中微生物占海洋生物數量的90%，控制著所有保持地球生態系統平衡的重要生物和生化循環，已有的研究數據表明海洋微生物資源庫遠比陸地微生物資源庫大，而且目前還尚未被人類充分發掘和利用，可見海洋微生物是人類豐富的藥源生物資源。
[0005]海洋中存在著許多自然條件特殊的環境，尤其是深海海洋環境，使生活于深海的海洋微生物處于獨特的物理、化學和生態環境中，在永久黑暗、高水壓、貧營養、劇變的溫度梯度、高鹽度和高濃度的有毒物質包圍下，它們形成了極為特殊的生物結構、代謝機制系統。由于這種極端的環境，使深海海洋真菌能產生結構新穎、活性獨特的代謝產物，具有巨大的應用價值，可為新藥和生物農藥的開發提供優異的種質資源。因此，深海微生物活性物質是研究開發海洋新藥物的必然而有效的選擇，也是目前深海微生物資源開發的熱點。

【發明內容】
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[0006]本發明的第一個目的是提供一株深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86,該菌株于2014年3月27日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCC NO:M2014108o
[0007]本發明的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86是從南海(12° 58.551' E,17° 0.646' N) 1598m深處的沉積物中分離、純化得到。其分離純化方法為:將海泥樣品用含3%粗海鹽的無菌水稀釋到10%，27°C振蕩20min，取0.2mL均勻涂布在分離培養基中，26~28°C恒溫箱培養，待菌落長出后，挑取菌落劃線純化得到。
[0008]所述分離培養基通過以下方式獲得:用水煮200g馬鈴薯20min，過濾得計，再加入葡萄糖20g、KH2P043g、MgSO40.75g、BJOmg、粗海鹽30g，瓊脂20g，用水補足至1L，pH自然。
[0009]通過形態學研究，并根據《真菌鑒定手冊》(魏景超，1979)，該菌株初步被鑒定為枝抱霉(Cladosporium sp.)。
[0010]其形態特征如下:
[0011]在分離培養基中28°C培養3天后，菌落微高出培養基，淺墨綠色，有溝紋，邊緣具白色短絨毛狀菌絲；培養5天后，菌落顏色墨綠色，邊緣菌絲呈灰白色；培養7天后，菌落變成橄欖褐色至黑褐色，有輻射狀溝紋(圖1);菌絲有隔，淡黃褐色或黃褐色，分生孢子梗直立或彎曲，10-50X3 μ m，頂端具1-4個孢痕；分生孢子淡黃褐色至深橄欖色，圓柱形、橢圓形、紡錘形或橄欖形，2.0~9.0 X 2.5~4.5 μ m，O~I個隔膜，大多數無隔膜，I~4個細胞，孢痕和孢臍明顯(圖2)。
[0012]根據常規方法提取該菌株的DNA，并利用真菌的ITS區的通用引物擴增其ITS區，其ITS區的堿基序列如SEQ ID N0.1所示。通過在GenBank中進行Blast檢索，與其相似度最高的兩條序列均為枝孢霉(Cladosporium sp.),相似度達99.2%。
[0013]結合形態學特征和ITS序列分析結果，該菌株被鑒定為枝孢霉(Cladosporiumsp.)，命名為枝抱霉(Cladosporium sp.)FS86。 [0014]該菌株于2014年3月27日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCC NO:M2014108。
[0015]本發明的第二個目的是提供一種具有抗病原真菌作用的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)發酵提取物。
[0016]本發明的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)發酵提取物是通過以下方法制備的，其特征在于，以上述枝孢霉FS86作為發酵菌株，液體發酵獲得發酵培養物，用乙酸乙酯或無水乙醇或體積分數95%以上的乙醇水溶液冷浸，優選是用乙酸乙酯冷浸，冷浸液經濃
縮后獲得。
[0017]所述的冷浸時間優選為24~48小時。
[0018]所述的液體發酵，優選是將枝孢霉FS86菌接種到發酵培養基中，120r/min，26°C培養7d，獲得發酵培養物，所述每升發酵培養基通過以下方式獲得:用水煮200g馬鈴薯20min,過濾得計，再加入葡萄糖10g、甘露醇20g、酵母膏3g、蛋白胨5g、味精5g、粗海鹽
3.0g,用水補足至1L, pH自然。
[0019]本發明的第三個目的是提供深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86發酵提取物在制備抗病原真菌藥物中的應用。
[0020]本發明通過實驗發現,本發明的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86發酵提取物在250yg/片濾紙濃度下,對白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、綠色木霉(Trichoderma viride)、膠抱炭疽菌(Colletotrichum gloeospor1ides)、柱枝雙抱霉(Cylindrocladium scoparium)和新月彎抱霉(Curvularia Iunata)的抑菌圈直徑分別為 45.2mm、41.0mm、40.2mm、30.8mm、36.8mm、35.2mm、30.5mmn 選擇 4mg/mL, 2mg/mL, lmg/mL, 0.5mg/mL, 0.2mg/mL, 0.lmg/mL, 0.05mg/mL7個濃度下進行最低抑菌濃度(MIC值)試驗，確定該發酵提取物對白色念珠菌、黑曲霉、黃曲霉、綠色木霉、膠孢炭疽菌、柱枝雙孢霉和新月彎孢霉的MIC值分別為0.lmg/mL、lmg/mL、2mg/mL、2mg/mL、lmg/mL、lmg/mL、0.25mg/mL。由此可見，本發明的枝孢霉FS86發酵提取物具有顯著的抗病原真菌活性，可用來制備抗病原真菌藥物。
[0021]本發明的第四個目的是提供一種抗病原真菌藥物，其特征在于，該抗病原真菌藥物包含枝孢霉FS86發酵提取物作為活性成分。
[0022]所述的抗病原真菌藥物優選為抗白色念珠菌、黑曲霉、黃曲霉、綠色木霉、膠孢炭疽菌、柱枝雙孢霉或新月彎孢霉的藥物。
[0023]本發明的枝孢霉FS86發酵提取物具有廣譜抗病原真菌活性，表明該發酵提取物具有很好的應用前景，因此本發明為開發新的抗病原真菌藥物、發掘深海真菌來源的天然活性物質提供了科學依據。
[0024]本發明的枝孢霉((:1&(108?01^111118?.奸586于2014年3月27日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCC NO:M2014108。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0025]圖1是枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86在分離培養基中的菌落特征,其中A、B、C分別為培養3天、5天、7天。
[0026]圖2是枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86在光學顯微鏡和電子顯微鏡下的照片，A為分生孢子和分生孢子梗的光學顯微照片為分 生孢子的光學顯微照片；C-D為分生孢子和分生孢子梗的掃描電鏡照片；D-F為分生孢子的掃描電鏡照片。
【具體實施方式】:
[0027]以下通過具體實施例來對本發明進一步說明，但并非限制本發明。
[0028]實施例1:深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86的分離和鑒定
[0029]深海真菌枝孢霉(Cladosporiumsp.)FS86 是從南海(12。58.551 ' E,17° 0.646' N) 1598m深處的沉積物中分離、純化得到。其分離純化方法為:將海泥樣品用含3%粗海鹽的無菌水稀釋到10%，27°C振蕩20min，取0.2mL均勻涂布在分離培養基中，26~28°C恒溫箱培養，待菌落長出后，挑取菌落劃線純化得到。所述分離培養基每升通過以下方式獲得:用水煮200g馬鈴薯20min,過濾得計，再加入葡萄糖20g、KH2P043g、MgSO40.758、811011^、粗海鹽3(^瓊脂20g，用水補足至1L，pH自然。
[0030]通過形態學研究，并根據《真菌鑒定手冊》(魏景超，1979)，該菌株初步被鑒定為枝抱霉(Cladosporium sp.)。
[0031]其形態特征如下:
[0032]在分離培養基中28°C培養3天后，菌落微高出培養基，淺墨綠色，有溝紋，邊緣具白色短絨毛狀菌絲；培養5天后，菌落顏色墨綠色，邊緣菌絲呈灰白色；培養7天后，菌落變成橄欖褐色至黑褐色，有輻射狀溝紋(圖1);菌絲有隔，淡黃褐色或黃褐色，分生孢子梗直立或彎曲，10-50X3 μ m，頂端具1-4個孢痕；分生孢子淡黃褐色至深橄欖色，圓柱形、橢圓形、紡錘形或橄欖形，2.0~9.0 X 2.5~4.5 μ m，O~I個隔膜，大多數無隔膜，I~4個細胞，孢痕和孢臍明顯(圖2)。[0033]根據常規方法提取該菌株的DNA，并利用真菌的ITS區的通用引物擴增其ITS區，其ITS區的堿基序列如SEQ ID N0.1所示。通過在GenBank中進行Blast檢索，與其相似度最高的兩條序列均為枝孢霉(Cladosporium sp.),相似度達99.2%。
[0034]結合形態學特征和ITS序列分析結果，該菌株被鑒定為枝孢霉(Cladosporiumsp.)，命名為枝抱霉(Cladosporium sp.)FS86。
[0035]該菌株于2014年3月27日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址:中國武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCC NO:M2014108。
[0036]實施例2:深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86發酵提取物的制備
[0037]將枝孢霉FS86菌接種到發酵培養基中，120r/min，26°C培養7d，獲得枝孢霉FS86發酵培養物。
[0038]將枝孢霉FS86的發酵培養物，用乙酸乙酯冷浸24h，冷浸液再經減壓濃縮得即得到褐色膏狀的提取物，即為枝孢霉FS86發酵提取物。
[0039]所述每升發酵培養基通過以下方式獲得:用水煮200g馬鈴薯20min，過濾得計，再加入葡萄糖10g、甘露醇20g、酵母膏3g、蛋白胨5g、味精5g、粗海鹽3.0g,用水補足至1L,pH:自然。
[0040]實施例3:深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86發酵提取物的抗病原真菌活性
[0041]一、抗菌活性測定:
[0042]采用濾紙片法測定枝孢霉FS86發酵提取物對白色念珠菌、黑曲霉、黃曲霉、綠色木霉、膠孢炭疽菌、柱枝雙孢霉或新月彎孢霉的抗菌活性。
[0043]將實施例2得到的枝孢霉FS86發酵提取物用DMSO溶解，并稀釋至50mg/mL濃度。
[0044]將液體發酵獲得的上述病原真菌菌液用生理鹽水分別稀釋至菌數或孢子數含量為106個/mL的濃度，吸取濃度為106個/mL的菌夜或孢子懸浮液ImL于培養皿中，倒入已冷卻至合適溫度的PDA培養基,混合均勻,用無菌鑷子夾取厚度為1.5_、直徑為6mm的濾紙片置于含菌平板上，同時在濾紙片上分別滴加枝孢霉FS86發酵提取物稀釋液5 μ L作為樣品組，以DMSO代替該發酵提取物稀釋液作為空白對照組，將平板置于26°C恒溫箱培養72h，用十字測量法測量抑菌圈直徑的大小，重復三次實驗，以抑菌圈直徑大小來評價抗菌活性。
[0045]實驗結果如表1所示:
[0046]表1:深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86發酵提取物的抗病原真菌作用
(X n=3)
[0047]
【權利要求】
1.一株深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.) FS86，其保藏編號為CCTCC NO:M2014108。
2.一種深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.) FS86發酵提取物,其特征在于,其是通過以下方法制備的:以權利要求1所述的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86作為發酵菌株，液體發酵獲得發酵培養物，用乙酸乙酯或無水乙醇或體積分數95%以上的乙醇水溶液冷浸，冷浸液經濃縮后獲得深海真菌枝孢霉FS86發酵提取物；所述的冷浸時間為24~28小時。
3.根據權利要求2所述的深海真菌枝孢霉(Cladosporiumsp.)FS86發酵提取物,其特征在于，所述的液體發酵是將深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86菌接種到發酵培養基中，120r/min，26°C培養7d，獲得發酵培養物，所述發酵培養基每升通過以下方式獲得:用水煮200g馬鈴薯20min,過濾得計,再加入葡萄糖10g、甘露醇20g、酵母膏3g、蛋白胨5g、味精5g、粗海鹽3.0g，用水補足至1L，pH自然。
4.權利要求2所述的深海真菌枝孢霉(Cladosporiumsp.)FS86發酵提取物在制備抗病原真菌藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的抗病原真菌藥物為抗白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、綠色木霉(Trichoderma viride)、膠抱炭疽菌(Colletotrichum gloeospor1ides)、柱枝雙抱霉(Cylindrocladiumscoparium)或新月彎抱霉(Curvularialunata)的藥物。
6.一種抗病原真菌藥物，其特征在于，該抗病原真菌藥物包含權利要求2所述的深海真菌枝孢霉(Cladosporium sp.)FS86發酵提取物作為活性成分。
7.根據權利要求6所述的抗病原真菌藥物，其特征在于，所述的抗病原真菌藥物為抗白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、綠色木霉(Trichoderma viride)、膠抱炭疽菌(Colletotrichumgloeospor1ides)、柱枝雙抱霉(Cylindrocladiumscoparium)或新月彎抱霉(CurvulariaIunata)的藥物。
【文檔編號】C12R1/645GK104031844SQ201410212196
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月19日 優先權日:2014年5月19日
【發明者】李浩華, 章衛民, 王磊, 譚國慧 申請人:廣東省微生物研究所