一種煙草白粉病菌生理小種的鑒別方法
【專利摘要】本發明公開了一種煙草白粉病菌生理小種的鑒別方法，其中，按照下述步驟操作：A、鑒別寄主(鑒別寄主體系：烤煙品種CF203、G140、K346、凈葉黃和曬煙品種塘蓬)的培育和白粉菌的純化與繁殖；B、接種、調查和抗性類型劃分，將煙草白粉病菌純化后的分離物接種上述5個鑒別寄主；C、DNA提取；D、利用S42寡聚核苷酸隨機引物進行PCR擴增DNA；E、電泳檢測PCR結果和數據聚類分析；F、分析生物鑒定與S42寡聚核苷酸隨機引物PCR擴增DNA數據聚類分析的結果，將煙草白粉病菌劃分為不同的生理小種。本發明彌補了煙草白粉病菌生理小種鑒別寄主體系和鑒別方法的空白，為煙草白粉病菌的研究提供了技術支撐，同時為煙草白粉病的防治與抗病育種奠定了理論基礎。
【專利說明】一種煙草白粉病菌生理小種的鑒別方法
【技術領域】:
[0001]本發明涉及農業生物【技術領域】，特別涉及一種煙草白粉病菌生理小種的鑒別方法。
【背景技術】:
[0002]煙草白粉病俗稱“上灰”、“下霜”、“上硝”。該病多為害成熟老葉，由下向上發展。葉片發病，初為近圓形的黃褐色小斑，后斑上現白色粉狀小點，使病斑呈粉狀，斑塊擴大，白粉布滿整個葉片，病葉先褪綠變褐，后枯死。嚴重時為害嫩莖，病莖上也布滿白粉。病葉烘烤后薄如紙，喪失經濟價值。中國各煙區均有發生，其中以華南、西南和華中煙區最為普遍，危害也較重。煙草白粉菌除為害煙草外，還可為害葫蘆科、菊科等植物。發病部位以葉片為主，病斑多從下向上擴展。主要發生在大田期。病害癥狀為:幼苗受害后，葉上長滿白粉，葉色變黃，逐漸干枯死亡。大田期成株發病，通常在比較老熟的葉片上先發生，從腳葉開始由下而上逐漸蔓延，很快遍及全株，被害的葉表面出現近圓形的病斑，然后整個葉呈灰色，著生一層白色物。嚴重時也危害嫩莖，后期病部組織變黃、變褐而枯死。病原為二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum DC.),屬于子囊菌亞門，核菌綱，白粉菌目，白粉菌屬。苗期和成株期均可發生。但有性階段很少發現。病菌菌絲具分隔，無色。無性態的分生孢子梗與菌絲垂直，絲狀，較短，無分枝，大小約80-120X12-14微米，頂生分生孢子。分生孢子串生，由上而下順次成熟，無色，單胞，圓筒形，大小為30-32 X 13-15微米。病菌生長適溫22°C -28°C。分生孢子萌發最適溫度23°C _25°C，最適相對濕度60% -80%。在相對濕度20%以下仍有少數孢子可以萌發，但在相對濕度100%或水滴中卻極少能萌發。病菌屬專性寄生菌，全部菌絲體長在寄主表面，以 吸胞伸入寄主表皮細胞內吸取養分。病菌存在生理分化現象，有許多不同致病型，它們對不同寄主的致病力差異很大。病菌寄主范圍廣，除煙草外，還能侵染葫蘆科、菊科等100多種植物。傳播途徑:病菌在病殘體、茄科寄主或再生煙上越冬，借風、雨進行傳播。發病的最適溫度為16-26°C、相對濕度為60-75%。施氮肥過多、煙株生長茂密、田間通風透光不良時，下部葉片易發病。該菌喜中溫中濕的環境條件，反而高溫高濕時，則不利于孢子的萌發和侵入。
[0003]煙草白粉病不僅可造成煙葉質量大幅下降，而且還可引起煙株死亡，是為害煙草的重要病害之一。據報道侵染煙草的二孢白粉菌是異宗配合的，Morrison用多個相似的株系接種煙草葉圓片，5周后可獲得成熟的子囊殼。研究資料還表明，二孢白粉菌包含2種類型，大概2個等位基因控制配合力；此外事實證明來自不同寄主植物的分離物構成了特殊遺傳配合力的生理小種。這都證明煙草白粉病菌的生理小種會不斷出現。如何阻止病菌變異和不斷出現的新的強致病力生理小種，這是目前國際上科學家關注的熱點問題之一。因此摸清目前煙草白粉病菌在我國發生的主要生理小種類型，是防治煙草白粉病的基礎。
[0004]近年來，分子標記技術如RAPD、AFLP, SSR、SCAR等已廣泛應用于植物病原菌生理小種的分類、群體毒性與DNA多態性的研究(時焦等，2002)。Nicholson et al (1999)應用RAH)分析和DNA指紋鑒別了玉米小斑病菌O、C、T 3個生理小種。樸春根等(1996)應用了45個隨機引物對我國小麥條銹病菌的6個生理小種進行RAH)分析，結果將供試小種分為兩組。研究結果表明，RAH)分析是鑒定種屬特異性、群體遺傳結構和指紋圖譜分析等的有效手段之一。但目前尚無將分子標記技術應用于煙草白粉病菌生理小種與遺傳多態性研究的報道。
[0005]生理小種是指種和變種內形態相同，但致病力等方面均有不同表現的群體，這些群體對不同品種的致病力可以存在差異。目前比較常用的傳統的生理小種鑒定方法是采用鑒別寄主，配合生理生化特性研究的生物鑒定手段。如中國專利申請20公開了大麥白粉病菌致病型鑒別寄主體系的構建方法，該方法包括:(I)菌株的采集與病原菌毒性類型的劃分；(2)備選大麥品種或品系的收集與鑒別；(3)備選鑒別寄主抗病性和病原菌致病性的測定；(4)鑒別寄主體系的建立等步驟。這種方法為傳統的鑒別方法，存在時間長，誤差大的缺點。而且，小麥為糧食作物，煙草為經濟作物，其種植地區，生長所需條件，物性本身屬性等均不相同，所以，針對煙草用常規方法鑒別白粉病菌的生理小種效果不好。鑒于上述技術問題，需要探索出一種方法簡單，鑒別準確，篩選快速的一種煙草白粉病菌生理小種的鑒別方法。此方法將生物鑒定與分子生物學鑒定相結合，彌補了煙草白粉病菌生理小種鑒別寄主體系與生理小種鑒別方法的空白，為煙草白粉病菌的研究提供了技術支撐，同時為煙草白粉病的防治與抗病育種奠定了理論基礎。
【發明內容】
:
[0006]本發明的目的在于克服現有技術的缺乏，提供方法簡單，鑒別準確、快速的一種煙草白粉病菌生理小種鑒別方法。彌補煙草白粉病菌生理小種鑒別寄主體系與生理小種鑒別方法的空白，為煙草白粉病菌的研究提供技術支撐，同時為煙草白粉病的防治與抗病育種
奠定理論基礎。
[0007]為了實現上述目的，本發明提供了一種煙草白粉病菌生理小種的鑒別方法，其特征在于，按照下述步
[0008]驟操作:
[0009]A、鑒別寄主煙苗的培育和分離物的純化與繁殖
[0010]煙苗的培育:將曬煙品種塘蓬，烤煙品種CF203、G140、K346和凈葉黃按照常規育苗方法于無菌隔離條件下育苗，培育至7-8片真葉時備用；
[0011]分離物的純化與繁殖:從主要產煙區采集33個新鮮白粉病樣品(表1)，然后在無煙草白粉病菌的隔離條件下，用病葉樣品接種煙草感病品種中煙90煙株，進行純化，并利用新形成的單個粉孢子堆上的粉孢子進行病菌繁殖，將繁殖所得純培養用于生理小種的鑒定;
[0012]表1 33個分離物編號與來源
[0013]
【權利要求】
1.一種煙草白粉病菌生理小種的鑒別方法，其特征在于，按照下述步驟操作: A、鑒別寄主煙苗的培育和白粉菌的純化與繁殖: 煙苗的培育:將曬煙品種塘蓬，烤煙品種CF203、G140、K346和凈葉黃以及曬煙品種塘蓬按照常規育苗方法于無菌隔離條件下育苗，培育至7-8片真葉時備用； 白粉菌的純化與繁殖:從主要產煙區采集33個新鮮白粉病樣品，然后在無煙草白粉病菌的隔離條件下，用病葉樣品接種煙草感病品種中煙90煙株，進行純化，并利用新形成的單個粉孢子堆上的粉孢子進行病菌繁殖，將繁殖所得純培養用于生理小種的鑒定； B、接種調查和抗性水平劃分: 采用噴霧接種法接種，接種用粉孢子濃度為IxlO4~16個孢子/mL，在無煙草白粉病菌的隔離室中，將步驟A中純化的單個分離物接種到步驟A的5個煙草品種7-8片真葉期的煙苗，每個供試品種接種15~18株；隔離室溫度25°C左右，相對濕度65%~75%;各品種煙苗隨機排列，自然發病后進行觀察記載，接種后3周，4周和5周，按照煙草行業白粉病調查分級標準，分別調查記載單片葉片的發病等級，并根據植物病理學病情指數計算公式計算病情指數，根據3次調查的平均病情指數計算得出相對抗病指數； 病情指數計算公式: 病情指數=100X Σ (各級病葉數X各級代表值)/(調查總葉數X最高級代表值) 相對抗病性評價方法: 依據其相對抗病指數L 00，0.60~0.99和< 0.59將抗病類型分別劃分為:免疫(I)、抗病(R)和感病⑶；相對抗病指數和相對病情指數的計算方法為: 相對抗病指數=1-相對病情指數， 相對病情指數=鑒定品種平均病情指數/對照品種平均病情指數(對照品種為發病最嚴重的品種)； C、DNA提取 白粉病分離物經純化后接種煙草感病品種中煙90煙株，從發病嚴重的煙株上收集白粉病菌粉孢子于1.5mL離心管中，于_20°C冰箱中貯藏，以備提取DNA ； DNA提取采用CTAB法，選用北京艾德萊生物試劑有限公司生產的新型植物基因組DNA快速提取試劑盒提取，研磨前在裝有粉孢子的1.5mL離心管中放少許滅過菌的石英砂，利于研磨；用1%的瓊脂糖電泳檢測DNA質量，將提取好的DNA置于-20°C冰箱中保存，用于PCR ； D、用引物S42進行PCR擴增DNA 利用Invitrogen公司生產的S42寡聚核苷酸隨機引物，以步驟C中提取的DNA為模板，進行PCR擴增； PCR(PCR所用試劑除引物外，都從北京艾德萊生物試劑有限公司購買)擴增反應總體積為 25 μ I，包括 2 X PCR Master Mix [Taq DNA 聚合酶(0.05U/uL)、MgC12 (4mmol)、0.4mmoldNTPs (dATP、dCTP、dGTP、dTTP) ] 12.5uL,引物(5umol/L) IuL,模板 DNA (20_40ng/uL) IuL,加ddH20至25uL ;同時以滅菌雙蒸水代替模板DNA作為陰性對照；擴增程序為94°C 5min,94°C 30s,37°C 45s,72°C 70s, 44 個循環，72°C 7min ； E、電泳檢測和數據分析: 以5000bp DNA MarkerIII (北京艾德萊生物試劑有限公司生產的)為分子量標記，取SuLPCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，經溴乙錠染色后，拍照記錄電泳圖譜； 電泳圖譜中的每一條帶均作為I個位點，擴增片段的出現與否分別賦值“I”和“0”，制成0-1矩陣表。然后將制成的0-1矩陣表輸入NTSYS-PC軟件用UPGMA法進行聚類分析，自動生成樹狀圖； F、分析結果并鑒定生理小種: 接種同一白粉菌分離物后，5個鑒別寄主為步驟A中所述的五種煙苗，發病情況存在差異，首先計算病情指數，然后計算相對抗病指數，劃分不同鑒別寄主對某一白粉病菌分離物的抗病類型，根據5個鑒別寄主對不同白粉菌分離物的抗病類型，初步將白粉菌分離物劃分為1-4號生理小種， 然后結合分子生物學鑒定，即利用Invitrogen公司生產的S42寡聚核苷酸隨機引物進行PCR擴增DNA的結果進行聚類分析，以遺傳相似系數0.83為閾值，將供試菌株劃分為.4個類群，最終根據生物鑒定和分子生物學試驗數據的聚類分析，將白粉病菌進一步劃分為.1-6號生理小種，即生物鑒定為同一生理小種類型的，且S42擴增DNA結果的聚類分析聚為同一類的樣品，就按生物鑒定劃分結果，劃分為同一生理小種，即1-4號生理小種。對于生物鑒定了生理小種類型，但在聚類分析中，未聚為同一類的樣品，按照他們是否能夠侵染塘蓬品種，分為另外2個生理小種，即5號和6號生理小種。如，生物鑒定結果，其中編號為1、.2、3、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、22、23、24、25、26、27、29、30、31、32、33 的分離物在生物鑒定中屬于生理小種I號，在聚類分析中編號為1、2、3、6、7、8、9、10、11、13、14、.15、16、17、19、25、26、27、29、30、31、32、33的分離物也聚為同一類，就劃分為生理小種I號；.4和12號分離物在生物鑒定中屬于生理小種2號，在聚類分析中也聚為同一類，就劃分為生理小種2號；20和21號分離物在生物鑒定中屬于生理小種3號，在聚類分析中也聚為同一類，就劃分為生理小種3 號；28分離物在生物鑒定中屬于生理小種4號，在聚類分析中也單獨聚為一類，就劃分為生理小種4號；5、18、22、23、24分離物在生物鑒定中屬于生理小種I號，但在聚類分析中并未聚為同一類，按照他們是否能夠侵染塘蓬品種，分為生理小種5號和生理小種6號，即不能夠侵染塘蓬品種的為生理小種5號，能夠侵染塘蓬品種的為生理小種6號。
【文檔編號】C12Q1/04GK104031988SQ201410201602
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月7日 優先權日:2014年5月7日
【發明者】時焦, 孟坤, 張保全, 徐宜民, 雒振寧, 王海波 申請人:中國農業科學院煙草研究所