產中性纖維素酶菌株及選育方法和其生產纖維素酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一株產中性纖維素酶的鏈霉菌屬菌株，其特征是：它于2014年3月3日保藏于中國武漢大學“中國典型培養物保藏中心”，保藏編號為CCTCCNO:M2014056，分類命名為StreptomycesparvusS10A10。該菌株來源于昆蟲腸道。本發明提供了鑒定的菌株培養物的rDNA序列。本發明還提供了該菌株的產酶培養基和培養條件，以及該菌株所產纖維素酶的酶學性質和生產方法。本發明生產的中性纖維素酶活力高，生產成本低廉、發酵周期短。所得到的中性纖維素酶適合作為食品和飼料添加劑，改善食品品質，促進動物生長，降低飼料系數，并可用于紡織行業。
【專利說明】產中性纖維素酶菌株及選育方法和其生產纖維素酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、食品工程及畜牧養殖等領域，具體涉及一種產中性纖維素酶菌株及選育方法和其生產纖維素酶的方法。本發明生產的纖維素酶主要應用于食品加工、飼料添加劑及紡織等行業。
【背景技術】
[0002]纖維素酶是將纖維素及其衍生物水解成葡萄糖的一組酶的總稱。一組完整的纖維素酶系通常有相互協同催 化水解纖維素的三類酶組成:內切纖維素酶(CMCase)、外切纖維素酶和葡萄糖苷酶。按催化反應的最適PH，可將內切纖維素酶分為:酸性內切纖維素酶(最適pH3~5)、中性內切纖維素酶(最適pH6~8)、堿性內切纖維素酶(最適pH8~10)。目前國產商品化纖維素酶多為酸性高溫酶，國內使用的中性纖維素酶幾乎都是國外廠家生產的。技術壟斷導致其商品化中性纖維素酶價格昂貴，制約了其市場推廣。因此，本領域迫切需要開發新的生產高活力中性纖維素酶的菌株。
[0003]能產生內切纖維素酶的微生物主要是真菌和部分細菌。真菌所產纖維素酶多為酸性胞外酶且產酶效率高，且酶系結構完整，但真菌所產纖維素酶都是復合酶，且酶系結構復雜，分子量大，不易分離提取，通常其產酶過程需要加入纖維素類物質進行誘導，且發酵周期長，因此在工業用酶開發方面顯示出了諸多不足。細菌所產纖維素酶雖然成分單一(即通常只含有一類纖維素酶)，可以簡化提取步驟，但是細菌纖維素酶多為中性或者堿性胞內酶，多吸附于菌壁，且其酶活普遍較低，另外，大部分菌株產誘導型內切纖維素酶，需要添加誘導物，不適應用于工業大規模生產。

【發明內容】

[0004]針對現有技術的不足，本發明的目的在于，提供一種產中性纖維素酶菌株及選育方法和其生產纖維素酶的方法，該菌株產生的纖維素酶PH穩定性好、催化能力強，適合較高的酶反應溫度。
[0005]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:一株產中性纖維素酶的鏈霉菌屬菌株，其特征是:它于2014年3月3日保藏于中國武漢大學“中國典型培養物保藏中心”，保藏編號為 CCTCCNO:M2014056，分類命名為 Str印tomycesparvusSlOAlO。
[0006]前述的一株產中性纖維素酶菌株，其特征是:該菌株為放線菌，能有效地獲得高產的中性纖維素酶。
[0007]一種如權利要求1所述的產中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，所述方法包括以下步驟:
[0008](a)取昆蟲腸道無菌研磨加入液體種子培養基中富集培養Id后，將經過富集培養后的菌液稀釋到10_4，取稀釋液，在初篩培養基上涂平板培養；
[0009](b)培養7d后，用接種針挑出同一平板上不同形態的放線菌菌落，再轉接到平板上進行單菌落分離，最終得到多株菌；[0010](C)將每株菌分別接種于液體種子培養基和發酵產酶培養基中，在28°C恒溫培養箱中培養36h，取發酵液進行剛果紅平板的快速篩選，經lmg/mL的剛果紅溶液染色30min，ImoI/L的NaCl溶液脫色30min后，測量平板上菌落水解圈與菌落直徑，計算水解圈和菌株直徑的比值，篩選出比值大于5的菌株，經反復實驗篩選得到一株在兩種培養中均能產生明顯透明圈的菌株，將其命名為StreptomycesparvusSlOAlO。
[0011]前述的產中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(a)和步驟(C)中，所述液體種子培養基的組成為:CMC-Na，IOg ；KH2PO4,4.0g ；MgS04,0.03g ;蒸餾水，1000mL,pH6.0 ~6.5。
[0012]前述的產中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(a)中，所述初篩培養基的組成為:羧甲基纖維素鈉，5.0g ；K2HPO4,1.0g ；NaN03,3.0g ；KC1,0.5g ；MgS04,0.5g ；FeSO4,0.01g ;瓊脂，17.0g ;蒸餾水，1000mL, ρΗ6.0 ~6.5。
[0013]前述的產中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(C)中，所述發酵產酶培養基的組成為:水稻秸桿粉，IOg ; (NH4) 2S04，4g ； KH2PO4, 2g ；MgS04,0.5g ;蒸餾水，lOOOmL，ρΗ6.0 ~6.5。
[0014]一種利用權利要求 1所述的產中性纖維素酶菌株生產纖維素酶的方法，其特征是，所述方法包括以下步驟:
[0015]⑴產酶培養
[0016]將StreptomycesparvusSlOAlO接種于斜面高氏I號培養基，27°C培養2d后轉接液體種子培養基，27°C條件下培養24h ;以2%接種量再轉接發酵產酶培養基，發酵培養基最適初始pH為6~6.5，27 °C條件下培養5d ；
[0017](2)胞外產物粗酶液的處理
[0018]將發酵液以4000r/min的轉速冷凍離心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于0.05mol/L、pH為6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中透析過夜；用聚乙二醇濃縮透析液，再經0.45 μ m微孔濾膜過濾除雜，保存濾液；
[0019](3)分子篩層析
[0020]預先用pH為6.2的磷酸鹽緩沖液充分平衡葡聚糖凝膠層析柱SephadexG-1OO柱，上樣后用PH為6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉洗脫，收集有酶活的洗脫峰，即為純化后的纖維素酶。
[0021]前述的一種利用權利要求1所述的產中性纖維素酶菌株生產纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述高氏I號培養基的組成為:可溶性淀粉，20g;KN03，Ig ;Κ2ΗΡ04，0.5g ；MgS04.7Η20，0.5g ；NaCl,0.5g ；FeS04.7H20，0.01g ；瓊脂，20g ；蒸餾水，lOOOmL，ρΗ6.0 ~6.5。
[0022]前述的一種利用權利要求1所述的產中性纖維素酶菌株生產纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述液體種子培養基的組成為:CMC-Na，IOg ；KH2PO4,4.0g ；MgS04,
0.03g ;蒸懼水，lOOOmL, pH6.0 ~6.5。
[0023]前述的一種利用權利要求1所述的產中性纖維素酶菌株生產纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述發酵產酶培養基的組成為:水稻秸桿粉，log; (NH4) 2S04，4g;KH2PO4, 2g ；MgS04,0.5g ;蒸餾水，1000mL, ρΗ6.0 ~6.5。
[0024]本發明的有益效果是:[0025](I)本發明所篩選到的StreptomycesparvusSlOAlO屬于組成型纖維素酶高產菌株，與當前工業用酶的細菌菌株相比，發酵產酶周期短，酶活力高，且產酶過程無需誘導，因此其產生的纖維素酶即為組成型纖維素酶，因此該菌適用于大規模的發酵生產的特點；
[0026](2)從本發明StreptomycesparvusSlOAlO提取的纖維素酶總酶的活力比活達33.02U/mL,與報道菌株相比，具有更高的催化能力；該酶最適反應pH為5.0，為罕見的酸性組成型纖維素酶；該酶在pH4.0~8.0的緩沖液中保存2h酶活力可保持最高酶活的90%以上，體現了較好的pH穩定性；最適反應溫度為50~65°C ;有耐Na+、K+、Ca2+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Pb2+、Fe3+等金屬離子的良好特性，EDTA對酶活性影響甚微，該酶為非金屬離子纖維素酶，顯示了良好的特性，在紡織、食品加工和飼料等工業領域具有良好的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發明StreptomycesparvusSlOAlO菌株在初篩培養基上的透明圈；
[0028]圖2為本發明StreptomycesparvusSlOAlO菌株的掃描電鏡形態圖片；
[0029]圖3為本發明純化的纖維素酶聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(M為標準蛋白分子量，3為酶蛋白分子量為82Kd內切纖維素酶。)；
[0030]圖4為SephadexG-1OO柱層析得到含纖維素酶活性峰的色譜圖；
[0031]圖5為pH對纖維素內切酶活的影響；
[0032]圖6為溫度對纖維素內切酶活的影響；
[0033]序列表為StreptomycesparvusSlOAlO 菌株的 16SrDNA 序列鑒定。
[0034]生物材料樣品保藏:
[0035]StreptomycesparvusSlOAlO已保藏于中國武漢大學“中國典型培養物保藏中心”，保藏地址:湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏編號為保藏編號為CCTCCNO:M2014056，保藏日期為2014年3月3日。
【具體實施方式】
[0036]為進一步揭示本發明的技術方案，下面結合附圖詳細說明本發明的實施方式:
[0037]本發明中所用培養基為:
[0038]高氏(Gause)I 號培養基:可溶性淀粉，20g ；KN03, Ig ;Κ2ΗΡ04，0.5g ；MgS04.7H20，
0.5g ；NaCl,0.5g ；FeS04.7H20，0.01g ;瓊脂，20g ;蒸餾水，lOOOmL, ρΗ6.0 ~6.5。
[0039]初篩培養基:羧甲基纖維素鈉，5.0g ；K2HPO4,1.0g ；NaN03,3.0g ；KC1,0.5g ；MgS04,
0.5g ；FeS04,0.01g ;瓊脂，17.0g ;蒸餾水 lOOOmL, ρΗ6.0 ~6.5。
[0040]液體種子培養基:CMC-Na,IOg ；KH2PO4,4.0g ；MgS04,0.03g ;蒸餾水 1000mL,
ρΗ6.0 ~6.5。
[0041]發酵產酶培養基:水稻秸桿粉，IOg； (NH4) 2S04，4g ；KH2PO4, 2g ;MgS04，0.5g ;蒸餾水lOOOmL，ρΗ6.0 ~6.5。
[0042]實施例1
[0043]StreptomycesparvusSlOAlO 的篩選過程:
[0044]取黑盾鞭蝎(Typopeltisniger)腸道無菌研磨加入液體種子培養基中富集培養Id后，將經過富集培養后的菌液稀釋到10-4，取稀釋液，在初篩培養基上涂平板培養。培養約7d后，用接種針挑出同一平板上不同形態的放線菌菌落，再轉接到平板上進行單菌落分離，最終得到42株菌株。將每株菌分別接種于液體種子培養基和發酵產酶培養基中，在2 8 °C恒溫培養箱中培養3 6 h，取發酵液進行剛果紅平板的快速篩選，經lmg/mL的剛果紅溶液染色30min，lmol/L的NaCl溶液脫色30min后，測量平板上菌落水解圈與菌落直徑，計算水解圈和菌株直徑的比值，篩選出比值大于5的菌株，經反復實驗篩選得到一株在兩種培養中均能產生明顯透明圈的菌株(D/d>5)，將其命名為StreptomycesparvusSlOAlOo 圖1 為 StreptomycesparvusSlOAlO 菌株在初篩培養基上的透明圈，圖2為StreptomycesparvusSlOAlO菌株的顯微觀察圖片。
[0045]實施例2
[0046]從StreptomycesparvusSlOAlO中提取中性組成型內切纖維素酶的方法:
[0047]1.產酶培養
[0048]將StreptomycesparvusSlOAlO接種于斜面高氏I號培養基，27° C培養2d后轉接種子培養基，27° C條件下培養24h ;以2%接種量再轉接液體發酵培養基，發酵培養基最適初始PH為6~6.5 ;27° C條件下培養5d。
[0049]2.胞外產物粗酶液的前處理
[0050]將發酵液以4000r/min的轉速冷凍離心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于0.05mol/L、pH值6 .2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中透析過夜；用聚乙二醇濃縮透析液，再經0.45 μ m微孔濾膜過濾除雜，保存濾液。
[0051]3.分子篩層析
[0052]預先用ρΗ6.2的磷酸鹽緩沖液充分平衡葡聚糖凝膠層析柱SephadexG-1OO柱,上樣后用ΡΗ6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉洗脫，收集有酶活的洗脫峰(見圖4)。
[0053]SephadexG-1OO柱層析條件如下:
[0054]平衡緩沖液:0.05mol/L、pH值6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；
[0055]洗脫緩沖液:0.05mol/L、pH值6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；
[0056]上樣流速:1.0mL/min ；
[0057]洗脫流速:1.5mL/min。
[0058]分管收集蛋白峰，檢測酶活力和蛋白濃度，得到含纖維素酶活性峰的收集液。
[0059]酶活測定方法:
[0060]①總酶(濾紙酶活力、FPA)活力的測定:
[0061]取稀釋10倍后的粗酶液0.5mL，加入1.0ml0.05mol/L的檸檬酸緩沖液(pH值4.8)和50mg新華濾紙，以不加底物為對照，50°C反應60min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入ISmL蒸餾水。以空白管做對照，采用分光光度計測得在540nm處的OD值。
[0062]②纖維素內切酶(羧甲基纖維素酶、CMCA)活力的測定:
[0063]取稀釋10倍后的粗酶液0.5mL，加入1.0mL、I %羧甲基纖維素鈉溶液(pH值4.8)，以不加底物為對照，50°C反應30min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入ISmL蒸餾水。以空白管做對照，采用分光光度計測得在540nm處的OD值。
[0064]③纖維素外切酶(微晶纖維素酶)活力的測定:[0065]取0.5mL稀釋3倍后的酶液，加入1.0mL、I %的微晶纖維素溶液(pH值4.8)，以不加底物為對照，50°C反應60min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入ISmL蒸餾水。以空白管做對照，采用分光光度計測得在540nm處的OD值。
[0066]④β -葡萄糖苷酶(BGA)活力測定:
[0067]取0.5mL稀釋3倍后的酶液，加入1.0mL、l%的水楊苷溶液(pH值4.8)，以不加底物為對照，50°C反應30min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入18mL蒸餾水。以空白管做對照，采用分光光度計測得在540nm處的OD值。
[0068]酶活力的計算方法:
[0069]酶活力的定義:在pH4.8，50°C條件下，每ImL酶液在Imin內水解底物生成I μ g葡萄糖的酶量稱作一個酶活力單位(U)。
[0070]纖維素酶活力單位=GXnX 1000/(0.5Xt)
[0071]G——所測得的OD值在葡萄糖標準曲線上查出的還原糖濃度，mg/mL ；
[0072]η——酶液的稀釋倍數；
[0073]1000——毫克換算成微克；
[0074]0.5——反應酶液的體積；
[0075]t-酶和底物反應時間，min。
[0076]取粗酶液測定酶的活力，經測定，總酶、內切酶和外切酶酶活分別為33.02U/mL、18.51U/mL 和 23.92U/mL。
[0077]分別對粗酶液、樣品前處理液和經S^hadexG-1OO柱層析后的樣品進行總酶活力的測定，如表1所示，結果表明StreptomycesparvusSlOAlO纖維素酶純化后得率78%,得率較高，且酶活在純化過程中較為穩定。
[0078]表1纖維素酶的內切酶活力測定
【權利要求】
1.一株產中性纖維素酶的鏈霉菌屬菌株，其特征是:它于2014年3月3日保藏于中國武漢大學“中國典型培養物保藏中心”，保藏編號為CCTCC NO:M 2014056，分類命名為Streptomyces parvus SlOAlO0
2.根據權利要求1所述的一株產中性纖維素酶菌株，其特征是:該菌株為放線菌，能有效地獲得高產的中性纖維素酶。
3.—種如權利要求1所述的產中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，所述方法包括以下步驟: (a)取昆蟲腸道無菌研磨加入液體種子培養基中富集培養Id后，將經過富集培養后的菌液稀釋到10_4，取稀釋液，在初篩培養基上涂平板培養； (b)培養7d后，用接種針挑出同一平板上不同形態的放線菌菌落，再轉接到平板上進行單菌落分離，最終得到多株菌； (c)將每株菌分別接種于液體種子培養基和發酵產酶培養基中，在28°C恒溫培養箱中培養36h，取發酵液進行剛果紅平板的快速篩選，經I mg/mL的剛果紅溶液染色30 min, Imol/L的NaCl溶液脫色30 min后，測量平板上菌落水解圈與菌落直徑，計算水解圈和菌株直徑的比值，篩選出比值大于5的菌株，經反復實驗篩選得到一株在兩種培養中均能產生明顯透明圈的菌株，將其命名為Sirepio焊parvus S10A10。
4.根據權利要求3所述的產中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(a)和步驟(c)中，所述液體種子培養基的組成為=CMC-Na, 10 g；KH2P04,4.0 g ；MgS04,0.03 g ;蒸餾水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
5.根據權利要求3所述的產中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(a)中，所述初篩培養基的組成為:羧甲基纖維素鈉，5.0 g ；Κ2ΗΡ04,1.0 g；NaN03,3.0 g ；KC1,0.5 g ；MgS04,0.5 g ；FeS04,0.01 g ;瓊脂，17.0 g ;蒸餾水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
6.根據權利要求3所述的產中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(c)中，所述發酵產酶培養基的組成為:水稻秸桿粉，10 g ； (NH4) 2S04，4 g ；KH2PO4, 2 g ；MgS04,0.5 g ;蒸懼水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
7.一種利用權利要求1所述的產中性纖維素酶菌株生產纖維素酶的方法，其特征是，所述方法包括以下步驟: (1)產酶培養 、備Streptomyces parvus SlOAlO接種于斜面高氏I號培養基,27°C培養2d后轉接液體種子培養基，27°C條件下培養24h ;以2%接種量再轉接發酵產酶培養基，發酵培養基最適初始pH為6~6.5，27 °C條件下培養5d ； (2)胞外產物粗酶液的處理 將發酵液以4000r/min的轉速冷凍離心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于0.05 mol/L、pH為6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中透析過夜；用聚乙二醇濃縮透析液，再經0.45 μ m微孔濾膜過濾除雜，保存濾液； (3)分子篩層析 預先用pH為6.2的磷酸鹽緩沖液充分平衡葡聚糖凝膠層析柱Sephadex G-100柱,上樣后用pH為6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉洗脫，收集有酶活的洗脫峰，即為純化后的纖維素酶。
8.根據權利要求7所述的一種利用權利要求1所述的產中性纖維素酶菌株生產纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述高氏I號培養基的組成為:可溶性淀粉，20 g ；KNO3,1 g ；K2HP04,0.5 g ;MgS04.7Η20，0.5 g ；NaCl,0.5 g ；FeS04.7H20,0.01 g;瓊脂，20 g ；蒸懼水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
9.根據權利要求7所述的一種利用權利要求1所述的產中性纖維素酶菌株生產纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述液體種子培養基的組成為:CMC-Na，10 g；KH2PO4,4.0 g ；MgS04,0.03 g ;蒸餾水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
10.根據權利要求7所述的一種利用權利要求1所述的產中性纖維素酶菌株生產纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述發酵產酶培養基的組成為:水稻秸桿粉，10 g；(NH4) 2S04，4 g ；KH2P04, 2 g ；MgS04,0.5 g ;蒸餾水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
【文檔編號】C12N1/20GK103937732SQ201410199636
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】張李陽, 霍光明, 劉維周 申請人:南京曉莊學院