制備板栗蛋白質的方法
【專利摘要】本發明公開了制備板栗蛋白的方法，該方法包括以下步驟：將板栗粉水溶液進行超聲波破碎處理；利用纖維素酶對所述經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液進行第一酶解處理；利用第一α-淀粉酶將第一酶解產物進行第二酶解處理；將第二酶解處理產物進行堿提處理；將堿提產物進行第一離心，并收集上清液，以便獲得蛋白質堿提液；利用第二α-淀粉酶將該蛋白質堿提液進行第三酶解處理；利用等電點沉淀法將第三酶解產物進行酸沉；將酸沉產物依次進行靜置和第二離心，以便收集獲得沉淀；以及將該沉淀進行水洗至中性，以便獲得所述板栗蛋白質。利用該方法能夠有效提高板栗蛋白提取率，并且由于提取條件溫和，所以不會破壞蛋白的活性，制得的板栗蛋白活性好。
【專利說明】制備板栗蛋白質的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及制備板栗蛋白質的方法。
【背景技術】
[0002]板栗中含蛋白質5%~11%，含量高于稻米，并且賴氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸，纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等氨基酸的含量超過FA0/WH0的標準，而賴氨酸是水稻，小麥，玉米，和大豆類的第一限制性氨基酸，蘇氨酸是水稻，小麥的第二限制性氨基酸，色氨酸和蛋氨酸分別是玉米和豆類的第二限制性氨基酸。由此可見，食用板栗或者直接食用板栗蛋白質可以補充禾谷類和豆類中限制氨基酸的不足，可使膳食的營養成分更加完善 ο
[0003]然而，現階段提取制備板栗蛋白質的方法仍有待改進。

【發明內容】

[0004]本發明是基于發明人的下列發現而完成的:
[0005]國內外對板栗蛋白的提取方法主要有兩種，一種是傳統的堿水法，這種方法的缺點是提取率低。另一種是亞臨界水萃取法，這種方法的缺點是提取蛋白的過程容易造成蛋白的變性。
[0006]本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種提取率高、蛋白活性好的制備板栗蛋白的方法。
[0007]根據本發明的一個方面，本發明提出了一種制備板栗蛋白的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟:將板栗粉水溶液進行超聲波破碎處理，以便獲得經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液；利用纖維素酶對所述經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液進行第一酶解處理，以便獲得第一酶解產物；利用第一 α -淀粉酶將所述第一酶解產物進行第二酶解處理，以便獲得第二酶解產物；將所述第二酶解處理產物進行堿提處理，以便獲得堿提產物；將所述堿提產物進行第一離心，并收集上清液，以便獲得蛋白質堿提液；利用第二α -淀粉酶將所述蛋白質堿提液進行第三酶解處理，以便獲得第三酶解產物；利用等電點沉淀法將所述第三酶解產物進行酸沉，以便獲得酸沉產物；將所述酸沉產物依次進行靜置和第二離心，以便收集獲得沉淀；以及將所述沉淀進行水洗至中性，以便獲得所述板栗蛋白質。發明人驚奇地發現，利用本發明的方法能夠有效提取制備板栗蛋白，并且板栗蛋白提取率高，活性好。具體地，本發明的方法利用超聲波和纖維素酶進行酶解作用促進板栗蛋白的溶出，且利用α-淀粉酶酶解破壞蛋白質(在本文中有時也將“蛋白質”簡稱為“蛋白”)與淀粉的包絡作用，從而有效提高了板栗蛋白的提取率，蛋白提取率可高達66%，相對于傳統方法提高了 20%，并且獲得的板栗蛋白中蛋白含量可高達88%，純度高，質量好，并且由于提取條件溫和，能夠很好地保持板栗蛋白的活性。
[0008]另外，根據本發明上述實施例的制備板栗蛋白質的方法還可以具有如下附加的技術特征:[0009]需要說明的是，適用于本發明的原料包括鮮板栗、干燥過的板栗、板栗粉。本發明的方法中所采用的主要萃取劑為去離子水。原料的品種、品質以及蛋白的含量，對終產品的品質與得率將產生一定的影響，但均比采用現有技術制備板栗蛋白質的效率高，品質好。
[0010]根據本發明的實施例，于400w超聲功率下，進行超聲波細胞破碎處理6_14min，優選lOmin。由此，能夠使細胞結構松動，加強后續纖維素酶的作用效果。根據本發明的實施例，所述板栗粉水溶液的料液比為Ig:15ml。換句話說，所述板栗粉水溶液是通過將板栗粉和水按照Ig:15ml的比例混合配制獲得的。由此，有利于后續蛋白的溶出和提取。此外，需要說明的是，前述的板栗粉可以通過以下方法制備獲得:選用無霉變蟲蛀的新鮮板栗為原料，經過去皮、切片、冷凍干燥后經粉碎機粉碎，過60目篩制成板栗粉。
[0011]根據本發明的實施例，于40-60攝氏度優選50攝氏度，PH4-6優選pH4.5條件下進行所述第一酶解處理5-15min，優選lOmin。由此，能夠有效促進板栗蛋白溶出，且能夠保持蛋白活性。根據本發明的另一些實施例，進行所述第一酶解處理時，所述纖維素酶與所述經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液的比例為50-150U/g，優選100U/g。由此，能夠有效破壞細胞壁促進蛋白溶 出，有利于后續的蛋白提取。
[0012]根據本發明的實施例，于30-50攝氏度優選40攝氏度，pH5.5-6.5優選pH6.1條件下進行所述第二酶解處理25-35min，優選30min。由此，能夠使板栗淀粉有效酶解，進而能夠有效解除淀粉對蛋白質的包絡，從而有利于蛋白溶出。根據本發明的另一些實施例，進行所述第二酶解處理時，所述第一 α -淀粉酶與所述第一酶解產物的比例為80-160U/g，優選120U/g。由此，能夠有效提高板栗淀粉的酶解效率，去除淀粉對蛋白質的包絡，且能夠保持蛋白質的活性。
[0013]根據本發明的一些優選示例，于40攝氏度下，按照120U/g的比例利用第一 α -淀粉酶進行所述第二酶解處理30min。由此，淀粉酶解效率高，對蛋白質的包絡少，且能夠保持蛋白質的結構和活性。
[0014]根據本發明的實施例，所述堿提處理包括:將所述第二酶解處理產物進行pH調節至pH為8.0-10.0優選10.0,并于30-50攝氏度優選40攝氏度下進行所述堿提25_35min，優選30min。由此，能夠提高蛋白的溶出率，獲得富含蛋白質的堿提產物。根據本發明的一些具體示例，將所述第二酶解處理產物進行PH調節至ρΗΙΟ.0，并于40攝氏度下進行所述堿提30min。由此，能夠使蛋白高效溶出。
[0015]根據本發明的實施例，可以將經過第一離心后獲得的濾渣加去離子水洗滌、超聲破碎后再離心，然后收集上清液合并入所述蛋白質堿提液，以便提高板栗蛋白的提取率。
[0016]需要說明的是，發明人發現，蛋白質堿提液中淀粉含量仍然較高，因而，本發明的方法在蛋白質堿提液中加入淀粉酶水解其中的淀粉，以便蛋白的分離。根據本發明的實施例，于30-50攝氏度優選40攝氏度，pH5.5-6.5優選pH6.1條件下進行所述第三酶解處理25-35min，優選30min。由此，能夠有效打破淀粉對蛋白的包絡作用，方便后續酸沉的進行。根據本發明的實施例，進行所述第三酶解處理時，所述第二 α-淀粉酶與所述蛋白質堿提液的比例為80-160U/g，優選120U/g。由此，板栗淀粉溶解效率高，對包絡板栗蛋白質的淀粉去除效果好，且不會破壞蛋白質的活性。
[0017]根據本發明的實施例，所述酸沉是在等電點pH4.2條件下進行的。由此，能夠使板
栗蛋白質有效沉淀。[0018]根據本發明的實施例，該制備板栗蛋白質的方法進一步包括將所述板栗蛋白進行真空冷凍干燥。由此，能夠有效獲得板栗蛋白粗提取物。具體地，根據本發明的一些實施例，利用真空冷凍干燥機進行所述真空冷凍干燥。由此，能夠有效實現真空冷凍干燥，獲得板栗蛋白粗提取物。
[0019]根據本發明的一些具體示例，本發明的制備板栗蛋白質的方法還可以包括以下步驟:將板栗粉與水按1:15( g/mL)比例溶解獲得板栗粉水溶液，然后將其于超聲波功率400W下進行超聲波破碎處理lOmin。接著,按100U/g的比例向經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液中加入纖維素酶，調PH到4.5，放入50°C恒溫水浴攪拌酶解lOmin。然后調pH=6.1，加入低溫α-淀粉酶，酶添加量為120U/g，并于40°C下繼續保溫攪拌酶解30min，接著，用Imol/mLNaOH調pH到10.0后，放入40°C水浴鍋中浸提30min，然后，離心取上清液，調上清液的PH至6.1后，按120U/g的酶添加量加入低溫α -淀粉酶，并于40°C下繼續保溫攪拌酶解30min后，在等電點pH4.2條件下進行酸沉，離心取沉淀，水洗沉淀至中性后即得板栗蛋白質，然后將其真空冷凍干燥保存。
[0020]需要說明的是，相對于傳統方法，本發明的制備板栗蛋白質的方法著重考慮在提高板栗蛋白提取率的同時保護板栗蛋白的結構不被破壞，通過α-淀粉酶、纖維素酶和超聲波細胞破碎儀的作用，促進板栗蛋白的溶出，減少了板栗淀粉的殘留，并且由于提取條件溫和，能夠有效保持蛋白質的活性，從而有利于生物活性和功能性蛋白質的后續研究及工業化生產。
[0021]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實 踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0023]圖1顯示了根據本發明一個實施例的制備板栗蛋白質的方法的流程示意圖。【具體實施方式】
[0024]下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0025]一般方法:
[0026]參照圖1，根據本發明的實施例，本發明的制備板栗蛋白質的方法一般包括以下步驟:
[0027]首先，將板栗粉水溶液進行超聲波破碎處理，以便獲得經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液。
[0028]其次，利用纖維素酶對所述經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液進行第一酶解處理，以便獲得第一酶解產物。
[0029]再次，利用第一 α -淀粉酶將所述第一酶解產物進行第二酶解處理，以便獲得第二酶解產物。
[0030]接著，將所述第二酶解處理產物進行堿提處理，以便獲得堿提產物。
[0031]接下來，將所述堿提產物進行第一離心，并收集上清液，以便獲得蛋白質堿提液。
[0032]然后，利用第二 α -淀粉酶將所述蛋白質堿提液進行第三酶解處理，以便獲得第三酶解產物。
[0033]接著，利用等電點沉淀法將所述第三酶解產物進行酸沉，以便獲得酸沉產物。
[0034]接下來，將所述酸沉產物依次進行靜置和第二離心，以便收集獲得沉淀。 [0035]然后，將所述沉淀進行水洗至中性，以便獲得所述板栗蛋白質。
[0036]實施例1
[0037]根據前面所述的一般方法，參照圖1，按照以下步驟制備板栗蛋白質:
[0038]選用無霉變蟲蛀的新鮮板栗為原料，經過去皮、切片、冷凍干燥后經粉碎機粉碎，過60目篩制成板栗粉。然后，將板栗粉與去離子水按照1:15 (g/mL)的比例溶解獲得板栗粉水溶液并置于超聲破碎儀(JAV-1V型超聲波細胞粉碎儀，濟寧市奧波超聲波電器有限公司)中，在400w超聲功率下，處理lOmin。然后按照100U/g的比例向經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液中加入纖維素酶(西格瑪奧德里奇公司，貨號22178)，再調pH至4.5，轉入50°C恒溫水浴鍋(W201B型恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司)攪拌酶解lOmin。接著，調pH=6.1，加入α-淀粉酶(西格瑪奧德里奇公司，貨號A1031)，酶添加量為120U/g，于40°C下保溫攪拌酶解30min。然后，用Imol/mL NaOH調pH到10.0,并放入40°C水浴鍋(W201B型恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司)中浸提30min后，離心取上清液，再調上清液pH至6.1，然后按照120U/g的酶添加量加入α -淀粉酶(西格瑪奧德里奇公司，貨號Α1031)，并于40°C下繼續保溫攪拌酶解30min后，在等電點pH4.2條件下進行酸沉，然后離心取沉淀，水洗沉淀至中性即得板栗蛋白質，再將其真空冷凍干燥(Thermo Fisher LL1500凍干機，美國賽默飛世爾科技有限公司)保存。
[0039]經計算，板栗蛋白質提取率為66%，且因為提取條件溫和，制得的板栗蛋白活性非常好。另外，通過凱氏定氮法(KDY-9830凱氏定氮儀，北京市通潤源機電技術有限責任公司)測得板栗粗蛋白的蛋白含量為88.43%。
[0040]對比例I
[0041]選用無霉變蟲蛀的新鮮板栗為原料，經過去皮、切片、冷凍干燥后經粉碎機粉碎，過60目篩制成板栗粉。然后，利用傳統堿水法，按照以下流程所示的步驟提取制備板栗蛋白質:
[0042]脫脂板栗粉末一按料水比1:15 (g/mL)加入蒸餾水調pH到9.0 —在45°C水浴下浸提 140min —離心(4000r/min, lOmin)—取上清液一酸沉(用 lmol/L HCl 調 pH 至Ij 4.2)—
收集沉淀。
[0043]所述沉淀即為板栗蛋白，經計算，板栗蛋白提取率為39.69%。
[0044]對比例2
[0045]選用無霉變蟲蛀的新鮮板栗為原料，經過去皮、切片、冷凍干燥后經粉碎機粉碎，過60目篩制成板栗粉。然后，利用亞臨界水提取法，按照以下流程所示的步驟提取制備板栗蛋白質:
[0046]脫脂板栗粉末一按料水比1:15 (g/mL)加入蒸餾水調pH到9.0 —亞臨界水萃取(提取溫度180°C、提取時間25min和提取壓力4.0MPa條件下)一冷卻一離心(4000r/min，IOmin)—取上清液一酸沉(用lmol/L HCl調pH到4.2)—收集沉淀。
[0047]所述沉淀即為板栗蛋白，經計算，板栗蛋白提取率為45.28%。
[0048]對比實施例1、對比例I和對比例2可知，本發明的制備板栗蛋白質的方法的板栗蛋白質提取率，相對于傳統喊水法提聞了 26%,相對于亞臨界水提取法提聞了 21%。表明相對于傳統方法，本發明的制備板栗蛋白質的方法的板栗蛋白質提取率顯著提高。此外，由實施例I可知，本發明的制備板栗蛋白質的方法獲得的板栗蛋白純度高，活性好，蛋白含量可聞達88%。
[0049]在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
[0050]盡管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解:在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由權利要求及其等同 物限定。
【權利要求】
1.一種制備板栗蛋白質的方法，其特征在于，包括以下步驟: 將板栗粉水溶液進行超聲波破碎處理，以便獲得經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液； 利用纖維素酶對所述經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液進行第一酶解處理，以便獲得第一酶解產物； 利用第一 α-淀粉酶將所述第一酶解產物進行第二酶解處理，以便獲得第二酶解產物； 將所述第二酶解處理產物進行堿提處理，以便獲得堿提產物； 將所述堿提產物進行第一離心，并收集上清液，以便獲得蛋白質堿提液； 利用第二 α-淀粉酶將所述蛋白質堿提液進行第三酶解處理，以便獲得第三酶解產物； 利用等電點沉淀法將所述第 三酶解產物進行酸沉，以便獲得酸沉產物； 將所述酸沉產物依次進行靜置和第二離心，以便收集獲得沉淀；以及 將所述沉淀進行水洗至中性，以便獲得所述板栗蛋白質。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，于400W超聲功率下，進行所述超聲波破碎處理 6_14min,優選 lOmin。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，于40-60攝氏度優選50攝氏度，pH4-6優選pH4.5條件下進行所述第一酶解處理5-15min,優選IOmin, 任選地，進行所述第一酶解處理時，所述纖維素酶與所述經過超聲波破碎處理的板栗粉水溶液的比例為50-150U/g，優選100U/g。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，于30-50攝氏度優選40攝氏度，pH5.5-6.5優選pH6.1條件下進行所述第二酶解處理25_35min，優選30min， 任選地，進行所述第二酶解處理時，所述第一 α -淀粉酶與所述第一酶解產物的比例為 80-160U/g，優選 120U/g。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述堿提處理包括: 將所述第二酶解處理產物進行PH調節至pH為8.0-10.0優選10.0,并于30-50攝氏度優選40攝氏度下進行所述堿提25-35min,優選30min。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，于30-50攝氏度優選40攝氏度，pH5.5-6.5優選pH6.1條件下進行所述第三酶解處理25_35min，優選30min， 任選地，進行所述第三酶解處理時，所述第二 α -淀粉酶與所述蛋白質堿提液的比例為 80-160U/g，優選 120U/g。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸沉是在等電點PH4.2條件下進行的。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，進一步包括將所述板栗蛋白進行真空冷凍干燥。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，利用真空冷凍干燥機進行所述真空冷凍干燥。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述板栗粉水溶液的料液比為Ig:15ml。
【文檔編號】C12P21/06GK103695515SQ201310589684
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】王豐俊, 呂佼, 王建中 申請人:北京林業大學