專利名稱：一種煙草赤星病菌孢子懸浮液及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業微生物技術領域，具體涉及一種煙草赤星病菌孢子懸浮液及其應用。
背景技術：
煙草赤星病(Tobacco Brown Spot)是煙葉成熟期普遍發生的葉部病害，其病原為鏈格孢菌(Altorimriei alternata)。目前,在實驗室一般采用平板培養菌絲、自然產孢后制備煙草赤星病菌孢子懸浮液，但其菌絲培養時間通常在10天以上才能長滿平板，菌絲老熟、產孢量足以制備孢子懸浮液還需要繼續培養5 10天，由于其培養時間長，容易造成培養基干燥，培養物污染，而且不經過誘導菌絲產孢效率低。盡管有個別研究通過紫外光誘導可加快產孢，但紫外劑量與時間難以控制，容易造成變異，也容易導致培養物污染。因此，如何更為有效的制備煙草赤星病菌孢子懸浮液是一個亟待解決的技術問題。
發明內容
本發明的第一目的在于提供一種培養快速、產孢量大、質量穩定的煙草赤星病菌孢子懸浮液，第二目的在于提供該煙草赤星病菌孢子懸浮液的應用。除非另有說明，本發明中所采用的百分數均為質量百分數。本發明的第一目的是這樣實現的，所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液是按以下步驟制備的:
A、病菌分離:從發病 田塊中采集有典型癥狀的煙草病葉，經過分離、純化、致病力測定篩選出煙草赤星病菌菌種；
B、病菌培養:將菌種產生孢子的菌絲點接到培養基平板上，每個平板接種3 4點，在18h黑暗6h光照交替條件下，于27 29°C恒溫培養4飛(1，選擇菌絲呈黑褐色、菌絲較致密的培養物用于誘導產孢；
C、誘導產孢:將符合誘導產孢條件的培養基平板密封后置于2 4°C的冰箱內黑暗誘導培養2 3d，然后轉入培養箱，黑暗、梯度降溫培養，歷時2 3d由20°C降溫至15°C ；
D、制備孢子懸浮液:誘導培養完成后，使用促進孢子萌發溶液將培養基平板上的孢子和菌絲洗下，組織搗碎f2min，使孢子與菌絲分離、孢子從孢子鏈斷開成單孢，然后過濾除去菌絲，濾液即為赤星病菌孢子懸浮液。本發明的第二目的是這樣實現的，所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液在煙草品種抗感赤星病測定中的應用；或所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液在防治煙草赤星病藥劑、生防菌或天然產物篩選中的應用；或所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液在研究煙草赤星病菌的土壤生態及病菌侵染循環中的應用。本發明采用多點接種方式，能夠較快長滿平板，比常規中央平板接種方式要縮短3 4天；通常病菌在培養基平板上由于營養耗盡、菌絲老熟而激發和促進自然產孢，產孢時間比較分散，比本發明產孢時間還要延長2 3天以上。本發明縮短培養時間達5 7天，培養周期大大縮短。本發明利用低溫高濕刺激、梯度程序降溫、黑暗誘導等方法的綜合作用促進煙草赤星病菌快速、大量的產生孢子，病菌在前期適溫、短時間光照(相當于短日照)培養時，菌絲生長速度快；在2 4°C黑暗冰箱中造成低溫高濕刺激，20°C到15°C梯度程序降溫、黑暗誘導直接促進了老熟菌絲大量產生孢子；經測算，同樣大小的培養基平板，利用本發明方法產孢量為常規產孢量的5(Γ100倍。本發明由于接種量大、病菌前期培養菌絲生長快，誘導產孢時為密封狀態，大大降低了培養物被污染的機會，從而保證了培養質量；培養菌絲、誘導產孢的時間相對固定、集中，能夠達到同步生長、同步產孢，同一病菌同批次、不同批次間制備的孢子量差異小，所以質量更為穩定。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變更或改進，均屬于本發明的保護范圍。本發明所述煙草赤星病菌孢子懸浮液是按以下步驟制備的:
Α、病菌分離:從發病田塊中采集有典型癥狀的煙草病葉，經過分離、純化、致病力測定篩選出煙草赤星病菌菌種；
B、病菌培養:將菌種產生孢子的菌絲點接到培養基平板上，每個平板接種3 4點，在18h黑暗6h光照交替條件下，于27 29°C恒溫培養4飛(1，選擇菌絲呈黑褐色、菌絲較致密的培養物用于誘導產孢；
C、誘導產孢:將符合誘導產孢條件的培養基平板密封后置于2 4°C的冰箱內黑暗誘導培養2 3d，然后轉入培養箱，黑暗、梯度降溫培養，歷時2 3d由20°C降溫至15°C (降溫速率約每9.6 14.4h降溫1°C);
D、制備孢子懸浮液:誘導培養完成后，使用促進孢子萌發溶液將培養基平板上的孢子和菌絲洗下，組織搗碎f2min，使孢子與菌絲分`離、孢子從孢子鏈斷開成單孢，然后過濾除去菌絲，濾液即為赤星病菌孢子懸浮液。作為優選實施方式:
B步驟所述的培養基為燕麥培養基(0A)、馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)、馬鈴薯蔗糖培養基(PSA)、查彼培養基(Czapek’ s medium)或理查培養基(Richard’ s medium)。D步驟所述的促進孢子萌發的溶液為f 2%的滅菌葡萄糖、果糖、蔗糖、蛋白胨溶液中一種或一種以上組合。或者，D步驟所述的促進孢子萌發溶液為2 5%感病品種煙草成熟的新鮮煙葉組織搗碎液，所述的組織搗碎液是經過濾滅菌的。所述的感病品種煙草為K326、云煙85或G140。D步驟所述的組織搗碎采用的是研缽、搗碎機或研磨機。D步驟所述的過濾為脫脂棉過濾或4飛層脫脂紗布過濾。本發明所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液在煙草品種抗感赤星病測定中的應用，是將煙草赤星病菌孢子懸浮液調整濃度、加入分散劑作為煙草赤星病的人工接種物。或所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液在防治煙草赤星病藥劑、生防菌或天然產物篩選中的應用，調整煙草赤星病菌孢子懸浮液濃度涂布平板即可。或所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液在研究煙草赤星病菌的土壤生態及病菌侵染循環中的應用，調整煙草赤星病菌孢子懸浮液濃度后，吸附于載體上，然后埋入或拌入土壤。本發明的工作原理:
本發明采用多點接種方式，加快了培養進程，縮短培養周期。本發明利用低溫高濕刺激、梯度程序降溫、黑暗誘導等方法的綜合作用促進煙草赤星病菌快速、大量的產生孢子，產孢量為常規產孢量的5(Γ100倍。本發明由于接種量大、病菌前期培養菌絲生長快，誘導產孢時為密封狀態，大大降低了培養物被污染的機會，從而保證了培養質量；培養菌絲、誘導產孢的時間相對固定、集中，能夠達到同步生長、同步產孢，同一病菌同批次、不同批次間制備的孢子量差異小，所以質量更為穩定。實施例1
從發病田塊中采集有典型癥狀的煙草病葉，經過分離、純化、致病力測定篩選出煙草赤星病菌菌種；將菌種產生孢子的菌絲點接到培養基平板上，每個平板接種3點，在18h黑暗6h光照交替條件下，于27°C恒溫培養4d，選擇菌絲呈黑褐色、菌絲較致密的培養物用于誘導產孢；將符合誘導產孢條件的培養基平板，在密封狀態下置于2°C的冰箱內黑暗誘導培養2d，然轉入培養箱黑暗、梯度降溫培養，歷時2d由20°C降溫至15°C (降溫速率約每9.6h降溫1°C);誘導培養完成后，以1%的滅菌葡萄糖溶液作為促進孢子萌發溶液，使用促進孢子萌發溶液將培養基平板上的孢子和菌絲洗下，以研缽組織搗碎lmin，使孢子與菌絲分離、孢子從孢子鏈斷開成單孢，然后用脫脂棉過濾過濾除去菌絲，濾液即為赤星病菌孢子懸浮液。實施例2
從發病田塊中采集有典型癥狀的煙草病葉，經過分離、純化、致病力測定篩選出煙草赤星病菌菌種；將菌種產生孢子的菌絲點接到培養基平板上，每個平板接種4點，在18h黑暗6h光照交替條件下，于29°C恒溫培養6d，選擇菌絲呈黑褐色、菌絲較致密的培養物用于誘導產孢；將符合誘導產孢條件的培養基平板，在密封狀態下置于4°C的冰箱內黑暗誘導培養3d，然轉入培養箱黑暗、梯度降溫培養，歷時3d由20°C降溫至15°C(降溫速率約每14.4h降溫ΓΟ;誘導培養完成后，以2%的滅菌果糖、蔗糖溶液作為促進孢子萌發溶液，使用促進孢子萌發溶液將培養基平板上的孢子和菌絲洗下，以搗碎機組織搗碎2min，使孢子與菌絲分離、孢子從孢子鏈斷開成單孢，然后用6層脫脂紗布過濾除去菌絲，濾液即為赤星病菌孢子懸浮液。實施例3
從發病田塊中采集有典型癥狀的煙草病葉，經過分離、純化、致病力測定篩選出煙草赤星病菌菌種；將菌種產生孢子的菌絲點接到培養基平板上，每個平板接種3點，在18h黑暗6h光照交替條件下，于28°C恒溫培養5d，選擇菌絲呈黑褐色、菌絲較致密的培養物用于誘導產孢；將符合誘導產孢條件的培養基平板，在密封狀態下置于3°C的冰箱內黑暗誘導培養2.5d，然轉入培養箱黑暗、梯度降溫培養，歷時2.5d由20°C降溫至15°C (降溫速率約每12h降溫1°C);誘導培養完成后，以1.5%的滅菌蔗糖、蛋白胨混合溶液作為促進孢子萌發溶液，使用促進孢子萌發溶液將培養基平板上的孢子和菌絲洗下，以研磨機組織搗碎1.5min,使孢子與菌絲分離、孢子從孢子鏈斷開成單孢，然后用4層脫脂紗布過濾除去菌絲，濾液即為赤星病菌孢子懸浮液。 實施例4從發病田塊中采集有典型癥狀的煙草病葉，經過分離、純化、致病力測定篩選出煙草赤星病菌菌種；將菌種產生孢子的菌絲點接到培養基平板上，每個平板接種4點，在18h黑暗6h光照交替條件下，于27°C恒溫培養4d，選擇菌絲呈黑褐色、菌絲較致密的培養物用于誘導產孢；將符合誘導產孢條件的培養基平板，在密封狀態下置于2°C的冰箱內黑暗誘導培養3d，然轉入培養箱黑暗、梯度降溫培養，歷時2d由20°C降溫至15°C (降溫速率約每9.6h降溫1°C);誘導培養完成后，以經過濾滅菌的3.5%感病品種煙草G140成熟的新鮮煙葉組織搗碎液作為促進孢子萌發溶液，使用促進孢子萌發溶液將培養基平板上的孢子和菌絲洗下，以研缽組織搗碎lmin，使孢子與菌絲分離、孢子從孢子鏈斷開成單孢，然后用5層脫脂紗布過濾除去菌絲，濾液即為赤星病菌孢子懸浮液。實施例5
從發病田塊中采集有典型癥狀的煙草病葉，經過分離、純化、致病力測定篩選出煙草赤星病菌菌種；將菌種產生孢子的菌絲點接到培養基平板上，每個平板接種4點，在18h黑暗6h光照交替條件下，于29°C恒溫培養6d，選擇菌絲呈黑褐色、菌絲較致密的培養物用于誘導產孢；將符合誘導產孢條件的培養基平板，在密封狀態下置于4°C的冰箱內黑暗誘導培養2d，然轉入培養箱黑暗、梯度降溫培養，歷時3d由20°C降溫至15°C(降溫速率約每14.4h降溫1°C);誘導培養完成后，以經過濾滅菌的2%感病品種煙草K326成熟的新鮮煙葉組織搗碎液作為促進孢子萌發溶液，使用促進孢子萌發溶液將培養基平板上的孢子和菌絲洗下，以研缽、搗碎機或研磨機組織搗碎2min，使孢子與菌絲分離、孢子從孢子鏈斷開成單孢，然后用脫脂棉過濾過濾 除去菌絲，濾液即為赤星病菌孢子懸浮液。實施例6
從發病田塊中采集有典型癥狀的煙草病葉，經過分離、純化、致病力測定篩選出煙草赤星病菌菌種；將菌種產生孢子的菌絲點接到培養基平板上，每個平板接種3點，在18h黑暗6h光照交替條件下，于28°C恒溫培養5d，選擇菌絲呈黑褐色、菌絲較致密的培養物用于誘導產孢；將符合誘導產孢條件的培養基平板，在密封狀態下置于3°C的冰箱內黑暗誘導培養2.5d，然轉入培養箱黑暗、梯度降溫培養，歷時2.5d由20°C降溫至15°C (降溫速率約每12h降溫1°C);誘導培養完成后，以經過濾滅菌的5%感病品種煙草云煙85成熟的新鮮煙葉組織搗碎液作為促進孢子萌發溶液，使用促進孢子萌發溶液將培養基平板上的孢子和菌絲洗下，以研缽、搗碎機或研磨機組織搗碎1.5min，使孢子與菌絲分離、孢子從孢子鏈斷開成單孢，然后用4層脫脂紗布過濾除去菌絲，濾液即為赤星病菌孢子懸浮液。實施例7
以赤星病菌97Aa003菌株按實施例1的方法制備煙草赤星病菌孢子懸浮液，并以該懸浮液進行品種抗性評價，具體步驟為:
1.材料與方法 1.1材料
供試品種為NC71、NC297、云煙201、KRK26共4個品種，抗病對照品種為凈葉黃，感病對照品種為G140共6個品種。1.2 方法
1.2.1抗性測定品種的小區布置
試驗處理為6個處理，每個品種為I個處理，每處理植煙30株，4次重復。小區隨機排列。管理與種植同優質烤煙模式。試驗用地約1.5畝。本試驗在云南省煙草農業科學研究院研和試驗基地進行。1.2.2病菌人工接種
封頂去2片腳葉后，將煙草赤星病菌孢子懸浮液用1%的葡萄糖稀釋至10萬個孢子/ml，按0.2%的質量比加入吐溫80、過325目標準篩的硅藻土，攪拌均勻，噴霧處理中下部葉，至葉片布滿均勻一層細小水珠為止，接種后在試驗田中灌注水至半溝，保濕24 48h。1.2.3病情調查
在煙草赤星病菌接種的前一天，進行一次病情基數調查，接種后每7d調查一次病情。調查各處理的葉片，調查記載采用GB/T 23222 “煙草病害分級及調查方法”中煙草赤星病害的國家標準。以發病盛期時病情指數的高低，評價抗性。2.結果與分析
受試驗品種的抗性測定結果見表I。表I抗性品種的測定結果(病情基數為O)
權利要求
1.一種煙草赤星病菌孢子懸浮液，其特征在于所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液是按以下步驟制備的: A、病菌分離:從發病田塊中采集有典型癥狀的煙草病葉，經過分離、純化、致病力測定篩選出煙草赤星病菌菌種； B、病菌培養:將菌種產生孢子的菌絲點接到培養基平板上，每個平板接種3 4點，在18h黑暗6h光照交替條件下，于27 29°C恒溫培養4飛(1，選擇菌絲呈黑褐色、菌絲較致密的培養物用于誘導產孢； C、誘導產孢:將符合誘導產孢條件的培養基平板密封后置于2 4°C的冰箱內黑暗誘導培養2 3d，然后轉入培養箱，黑暗、梯度降溫培養，歷時2 3d由20°C降溫至15°C ； D、制備孢子懸浮液:誘導培養完成后，使用促進孢子萌發溶液將培養基平板上的孢子和菌絲洗下，組織搗碎f2min，使孢子與菌絲分離、孢子從孢子鏈斷開成單孢，然后過濾除去菌絲，濾液即為赤星病菌孢子懸浮液。
2.根據權利要求1所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液，其特征是:B步驟所述的培養基為燕麥培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基、馬鈴薯蔗糖培養基、查彼培養基或理查培養基。
3.根據權利要求1所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液，其特征是:D步驟所述的促進孢子萌發的溶液為廣2%的滅菌葡萄糖、果糖、蔗糖、蛋白胨溶液中一種或一種以上組合。
4.根據權利要求1所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液，其特征是:D步驟所述的促進孢子萌發溶液為2 5%感病品種煙草成熟的新鮮煙葉組織搗碎液，所述的組織搗碎液是經過濾滅菌的。
5.根據權利要求4所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液，其特征是:所述的感病品種煙草為K326、云煙85或G140。
6.根據權利要求1所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液，其特征是:D步驟所述的組織搗碎采用的是研缽、搗碎機或研磨機。
7.根據權利要求1所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液，其特征是:D步驟所述的過濾為脫脂棉過濾或4飛層脫脂紗布過濾。
8.—種權利要求1所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液在煙草品種抗感赤星病測定中的應用。
9.一種權利要求1所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液在防治煙草赤星病藥劑、生防菌或天然產物篩選中的應用。
10.一種權利要求1所述的煙草赤 星病菌孢子懸浮液在研究煙草赤星病菌的土壤生態及病菌侵染循環中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種煙草赤星病菌孢子懸浮液及其應用，所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液是通過病菌分離、病菌培養、誘導產孢、制備孢子懸浮液步驟獲得的。所述的煙草赤星病菌孢子懸浮液應用于煙草品種抗感赤星病測定中，或防治煙草赤星病藥劑、生防菌或天然產物篩選中，或研究煙草赤星病菌的土壤生態及病菌侵染循環中。本發明采用多點接種方式，培養速度快、培養周期短；利用低溫高濕刺激、梯度降溫、黑暗誘導等方法的綜合作用促進煙草赤星病菌快速、大量的產生孢子，為常規產孢量的50~100倍。本發明方法污染小，培養菌絲、誘導產孢的時間相對固定、集中，同步生長、同步產孢，同批次、不同批次制備孢子量差異小，質量更為穩定。
文檔編號C12R1/645GK103194421SQ20131009416
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月22日 優先權日2013年3月22日
發明者方敦煌, 劉勇, 李永平, 肖炳光 申請人:云南省煙草農業科學研究院