專利名稱：一種甲醇蛋白肽的生產方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，特別是一種甲醇蛋白肽的生產方法。
背景技術：
應用發酵法生產單細胞蛋白作為飼料，在國內外已有較多報導，部分加工工藝較為成熟，如用假絲酵母、釀酒酵母等作為發酵菌種，以甜菜渣、啤酒糟、柑橘廢渣、糖蜜等一些農副產品為原料生產的單細胞蛋白報道較多。目前，以甲醇為主要碳源生產單細胞蛋白的報道還不多，國內外生產甲醇蛋白的方法主要有細菌發酵法和酵母菌發酵法，細菌法包括英國的ICI法、德國的Hoechst-Uhde法和瑞典的Norprotein法；酵母菌種生產法包括日本的MGC法、法國的IFP法和美國的Philips Petroleum法，除ICI法工業化生產外(目前已停產)，其他均未工業化。我國部分研究單位公布的實驗室小試生產甲醇蛋白方法多是利用酵母菌生產單細胞蛋白，此蛋白的主要用作動物飼料添加。但研究表明，動物對此類蛋白的消化利用率較低，甚至出現消化不良的情況。

發明內容
針對上述情況，為克服現有技術缺陷，本發明之目的就是提供一種甲醇蛋白肽的生產方法，可有效解決單細胞蛋白作為飼料添加劑后，出現消化不良、轉化效率低的問題。本發明解決的技術方案是，包括如下步驟首先將巴斯德畢赤酵母HGD-Ol菌株接種至YPD試管斜面培養基上，培養得試管斜面種子，試管斜面種子接種到YPD液體培養基上，培養得搖瓶一級種子，搖瓶一級種子接種到PH值為4. 5 5. O的BSM液體培養基上，培養得二級種子，將二級種子全部移種到發酵罐內的發酵培養基中進行甲醇蛋白的發酵生產，發酵72 84小時后，取樣測定發酵液菌體濕重達300 360g/L，得發酵液，經滅活后用箱式隔膜壓濾機進行板框過濾收集濾餅(即菌體蛋白)，然后將濾餅置于發酵液儲罐中，力口入濾餅體積3倍的水稀釋并 攪拌均勻，得濾餅稀釋液，再對濾餅稀釋液降溫至45 50°C，然后取蛋白酶粉(蘇柯漢生物工程有限公司，產品型號SUKAPro AC Pff 50，50000U/g)，加水溶解，倒入濾餅稀釋液(又稱菌體蛋白稀釋液)中，蛋白酶粉的用量為每立方米濾餅稀釋液中加5Kg蛋白酶粉，酶解，當水解度達到75%以上時，得酶解液，滅活后，經箱式隔膜壓濾機(820-U型，徐州市添緣壓濾機廠)過濾，收集濾液、濾餅，回流再次酶解，收集壓濾酶解液后用超濾膜(上海賽奧分離技術工程有限公司)進行超濾濃縮，最后向濃縮液添加淀粉并攪拌均勻，進行噴霧干燥，收集蛋白肽干粉，即得甲醇蛋白肽。本發明所用巴斯德畢赤酵母HGD-Ol菌體蛋白含量高達56%，能以甲醇為主要碳源，以氨水為氮源，輔以磷酸，二水硫酸鈣，硫酸鉀，七水硫酸鎂，甘油和微量元素溶液等制成無機鹽發酵培養基進行甲醇蛋白生產。本發明已對50L、500L及5m3發酵罐獲得的甲醇蛋白進行甲醇蛋白肽的生產，經過5m3發酵罐中試驗生產表明，本發明生產的單細胞蛋白具有蛋白肽含量高，氨基酸組成合理，B族維生素豐富的特點，可作為替代畜禽飼料蛋白的理想原料。
具體實施例方式以下結合實際情況對本發明的具體實施方式
作詳細說明。本發明包括如下步驟
1)、搖瓶一級種子培養
分類命名為巴斯德畢赤酵母O0ZcAia pastor is") HGD-Ol的菌株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為=CCTCC Ν0:Μ2012342，保藏日期為2012年9月12日；將巴斯德畢赤酵母HGD-Ol的菌株O. 5mL用劃線法接種至YPD試管斜面培養基(試管規格180mmX 20mm)上,48小時,得試管斜面種子，取I支試管斜面種子，用IOmL無菌水將斜面種子全部沖洗下來，接種到裝有300mL YI3D液體培養基的三角瓶中，瓶口用8層紗布包好，搖床振蕩培養，培養溫度30°C，搖床轉速220rpm，培養24 30小時后，菌體OD6tltl達到3 5，獲得搖瓶一級種子；所述的YH)試管斜面培養基是由重量百分比計的1%酵母提取物(oxiod公司產品，公知技術，以下同)、2%胰蛋白胨(oxiod公司產品，公知技術，以下同)、2%葡萄糖、2%瓊脂(北京奧博星化學試劑有限公司產品，公知技術，以下同)和余量的水混合在一起組成；所述的YH)液體培養基是由重量百分比計的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起組成；
2)、二級種子培養
二級種子培養在50L發酵罐中進行，具體如下50L發酵罐裝30L的BSM液體培養基，BSM液體培養基滅菌后，用氨水調BSM液體培養基pH值至4. 5 5. 0，然后將搖瓶一級種子300mL全部接種到50L發酵罐內pH值為4. 5 5. O的BSM液體培養基上，移種前檢查種子質量，鏡檢菌體整齊，健壯，出芽數在2 3個，無雜菌污染，接種時罐壓為O. 05-0.1OMPa,培養時，培養溫度30 32°C，通風比1:1 1.5 vvm，罐壓O. 05MPa，pH4. 5 5. 0，培養周期24 30h，得二級種子；所 述的BSM液體培養基為質量濃度85%磷酸15mL/L，二水硫酸鈣
0.4g/L，硫酸鉀8 g/L，七水硫酸鎂6 g/L，甘油36g/L和微量元素溶液3 mL/L加水制成，也就是說BSM液體培養基為質量濃度85%磷酸15mL，二水硫酸鈣O. 4g，硫酸鉀8 g，七水硫酸鎂6 g，甘油36g和微量元素溶液3 mL加水至I L ;所述的微量元素溶液為五水硫酸銅14g/L，碘化鉀O. 08g/L，一水硫酸錳4g/L，二水鑰酸鈉O. lg/L(北京奧博星化學試劑公司產品，公知技術，以下同)，硼酸O. lg/L，六水合氯化鈷lg/L (北京奧博星化學試劑公司產品，公知技術，以下同)，氯化鋅36g/L、七水合硫酸亞鐵65g/L和質量濃度為98%的濃硫酸5mL/L加水制成，也就是說微量元素溶液為五水硫酸銅Hg，碘化鉀O. 08g, 一水硫酸錳4g，二水鑰酸鈉O. lg，硼酸O. lg，六水合氯化鈷lg，氯化鋅36g、七水合硫酸亞鐵65g和質量濃度為98%的濃硫酸5mL加水至/L ；
3)、發酵生產甲醇蛋白
A、發酵培養基的配方和比例與上述BSM液體培養基相同5m3發酵罐內裝發酵培養基3m3，打開蒸汽閥，通蒸汽進入罐體外盤管及罐體內，用蒸汽將發酵罐中發酵培養基進行滅菌，打開壓力表，待罐內壓力升到O. 15MPa時，調節蒸汽閥門使罐體溫度保持在120°C 125°C，保溫30min，同時對與罐體連接的空氣過濾器進行蒸汽滅菌，滅菌結束后，對發酵培養基進行降溫，當罐內發酵培養基溫度降至30 35°C時，用質量濃度為35%的氨水調節發酵培養基pH至4. 5 5. O ;B、將二級種子30L移種到5m3發酵罐內pH為4. 5 5. O的發酵培養基中開始發酵，發酵溫度30 32°C，通風比1:1. 5 2 vvm，罐壓O. 04MPa, ρΗ4· 5 5. 0，培養16 20h，發酵培養基中的甘油消耗完，溶氧開始持續上升，罐內菌體OD6tltl達到32 35，濕重達到80 100g/L,向罐內流加甲醇，甲醇流加量為5 6克/升 小時，打開空氣進口閥門，保持罐內溶氧在30%以上，當溶氧高于60%以上時，加大甲醇流加量，最大流加量達到10 15克/升 小時，發酵過程中，每12小時補加一次微量元素溶液，每次流加2升，直至發酵結束，發酵72 84小時后，取樣測定菌體濕重達300 360g/L，得發酵液；用蒸汽對罐內發酵液進行滅活處理，發酵液溫度達100°C，保溫時間30min后，對發酵液降溫至60V 65°C ；
4)、單細胞菌體蛋白的收集與酶解
降溫至60°C 65°C的發酵液用箱式隔膜壓濾機(820-U型，徐州市添緣壓濾機廠)過濾，板框過濾面積30m2,過濾流速O. 5 1. 5m3/h,板框工作壓力O. 3 O. 5MPa,過濾完成后，將箱式隔膜壓濾機上的濾餅清洗下來，投加到5m3的發酵液儲罐中，向罐中加入清水將濾餅稀釋，清水和濾餅的體積比為3 :1，攪拌均勻，得菌體蛋白稀釋液，用向外盤管輸入熱蒸汽或冷水方式將菌體蛋白稀釋液溫度調整到45 50°C，然后稱取蛋白酶粉(蘇柯漢生物工程有限公司，產品型號SUK APro AC Pff 50，50000U/g)用水溶解，得蛋白酶溶液，以每立方米菌體蛋白稀釋液中添加5Kg蛋白酶粉的量，將蛋白酶溶液倒入2m3菌體蛋白稀釋液中并攪拌均勻，在45 50°C，酶解，酶解過程中，每30min取樣測定水解度，當水解度達75%以上時，得酶解液，打開蒸汽閥門，對罐內酶解液中的蛋白酶進行滅活，罐內溫度達100°C，保溫時間20min ；
5 )、酶解液的板框壓濾及甲醇蛋白肽的提取
將上述酶解液經箱式隔膜壓濾機(820-U型，徐州市添緣壓濾機廠)過濾，收集濾液和濾餅，濾液和濾餅再回收到步驟4)中的5m3發酵液儲罐內用步驟4)同樣的方法和用量進行酶解，得壓濾酶解液；
壓濾酶解液用超濾膜(上海賽奧分離技術工程有限公司，膜元件型號SG-UE-P5-4040)進行濃縮，超濾膜面積22m2，過濾壓力O. 6MPa，溫度30°C，得濃縮液，濃縮液中為截獲的分子量在5000Da以上的小分子蛋白肽；
6)、濃縮液噴霧干燥
在濃縮液中添加濃縮液體積5%的淀粉并攪拌均勻，用噴霧干燥機，進行噴霧干燥，調節進口溫度至130 150°C、出口溫度至65-80°C，調節進料流量為O. 5噸/小時，收集蛋白肽干粉(即甲醇蛋白肽)。 實施例1 :
1)、搖瓶一級種子培養
將巴斯德畢赤酵母HGD-Ol的菌株用劃線法接種至Yro試管斜面培養基上，30°C培養48小時，得試管斜面種子，取I支試管斜面種子，用IOmL無菌水將斜面種子全部沖洗下來，接種到裝有300mL YPD液體培養基的三角瓶中，瓶口用8層紗布包好，搖床振蕩培養，培養溫度30°C，搖床轉速220rpm，培養28小時后，菌體0D_達到4，獲得搖瓶一級種子；
2)、二級種子培養
50L發酵罐裝30L的BSM液體培養基，BSM液體培養基滅菌后，用氨水調BSM液體培養基pH值至4. 8，然后將搖瓶一級種子300mL全部接種到50L發酵罐內pH值為4. 8的BSM液體培養基上，移種前檢查種子質量，鏡檢菌體整齊，健壯，出芽數在2 3個，無雜菌污染，接種時罐壓為O. 05-0.1OMPa，培養時，培養溫度30°C，通風比I Γ . 5 vvm，罐壓O. 05MPa，pH4. 8，培養周期28h，得二級種子；
3)、發酵生產甲醇蛋白
A、發酵培養基的配方和比例與BSM液體培養基相同5m3發酵罐內裝發酵培養基3m3,打開蒸汽閥，通蒸汽進入罐體外盤管及罐體內，用蒸汽將發酵罐中發酵培養基進行滅菌，打開壓力表，待壓力升到O. 15MPa時，調節蒸汽閥門使罐體溫度保持在120°C 125°C，保溫30min，同時對與罐體連接的空氣過濾器進行蒸汽滅菌，滅菌結束后，對發酵培養基進行降溫，當罐內發酵培養基溫度降至32°C時，用質量濃度為35%的氨水調節發酵培養基pH至4. 8 ；
B、將二級種子30L移種到5m3發酵罐內pH為4.8的發酵培養基中開始發酵，發酵溫度30°C，通風比1:1.7 vvm，罐壓O. 04MPa，pH4. 8，培養18h，發酵培養基中的甘油消耗完，溶氧開始持續上升，罐內菌體OD6qq達到33，濕重達到90g/L，向罐內流加甲醇，甲醇流加量為5 6克/升·小時，打開空氣進口閥門，保持罐內溶氧在30%以上，當溶氧高于60%以上時，力口大甲醇流加量，最大流加量達到12克/升·小時，發酵過程中，每12小時補加一次微量元素溶液，每次流加2升，直至發酵結束，發酵80小時后，取樣測定菌體濕重達330g/L，得發酵液；用蒸汽對罐內發酵液進行滅活處理，發酵液溫度達100°C，保溫時間30min，將發酵液降溫至65 °C ；
4)、單細胞菌體蛋白的收集與酶解
降溫至65°C的發酵液用箱式隔膜壓濾機過濾，板框過濾面積30m2，過濾流速lm3/h，板框工作壓力O. 4MPa，過濾完成后，將箱式 隔膜壓濾機上的濾餅清洗下來，投加到發酵液儲罐中O. 5m3濾餅，向罐中加入1. 5m3的清水將濾餅稀釋，攪拌均勻，得菌體蛋白稀釋液，降溫至48 V，然后稱取IOKg蛋白酶粉，用水溶解，倒入菌體蛋白稀釋液中并攪拌均勻，在48 °C，酶解4 5h，酶解過程中，每30min取樣測定水解度，水解度達75%以上，得酶解液，打開蒸汽閥門，對罐內酶解液進行滅活，罐內溫度達100°C，保溫時間20min ；
5 )、酶解液的板框壓濾及甲醇蛋白肽的提取
將上述酶解液經箱式隔膜壓濾機(820-U型，徐州市添緣壓濾機廠)過濾，收集濾液和濾餅，濾液和濾餅再回收到步驟4)中的發酵液儲罐內用步驟4)同樣的方法和用量進行酶解，得壓濾酶解液；
取1. 8 2. Om3壓濾酶解液用超濾膜進行濃縮，超濾膜面積22m2，過濾壓力O. 6MPa，溫度30°C，得濃縮液，濃縮液中為截獲的分子量在5000Da以上的小分子蛋白肽，濃縮液體積
O.6 O. 8m3 ；
6)、濃縮液噴霧干燥
在濃縮液中添加濃縮液體積5%的淀粉并攪拌均勻，用噴霧干燥機，進行噴霧干燥，調節進口溫度至130 150°C、出口溫度至65-80°C，調節進料流量為O. 5噸/小時，收集蛋白肽干粉，稱重，25公斤/袋，包裝。本發明用甲醇和氨水作為主要碳源和氮源，配以無機鹽和微量元素溶液配制成發酵培養基，利用巴斯德畢赤酵母HGD-Ol在該培養基中發酵獲得單細胞菌體蛋白，再對菌體進行滅活處理，對滅活菌體蛋白進行酶解獲得小分子甲醇蛋白肽。其中，發酵液先經100°C處理30min以使單細胞蛋白變性,用酶活力IXlO5 U/g的蛋白酶進行酶解，酶解結束后再用100°C高溫處理20min使酶蛋白失活；酶解液需先經壓濾板框過濾去除部分未酶解菌體，再用超濾膜截獲5000Da以上的小分子蛋白肽，最后將超濾濃縮液添加5%的淀粉再進行噴霧干燥，獲得小分子甲醇蛋白肽成品；本發明甲醇蛋白肽的粗蛋白含量> 56%，蛋白小肽>40%，細胞壁多糖含量大于5%;大大提高了甲醇蛋白飼料的功能性作用。其中，甲醇轉化率達45%以上，發酵周期短、遺傳穩定性和安全性好，經50噸發酵罐進行工業化中試表明，本發明實現了工業化生產，具體如下
對8批次的5L和IOL發酵罐中發酵的甲醇蛋白產量分別進行檢測(見表I )，5L發酵罐中各批次濕菌體產量均在108-150g/L之間，其平均值為125g/L ；10L發酵罐中各批次濕菌體產量均在180-250g/L之間，其平均值為212. 5g/L。表1. 8批次的5L和IOL發酵罐甲醇蛋白產量
權利要求
1.一種甲醇蛋白肽的生產方法，其特征在于，包括如下步驟 1)、搖瓶一級種子培養 分類命名為巴斯德畢赤酵母HGD-Ol的菌株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2012342 ;將巴斯德畢赤酵母HGD-Ol的菌株O. 5mL用劃線法接種至YPD試管斜面培養基上，30°C培養48小時，得試管斜面種子，取I支試管斜面種子，用IOmL無菌水將斜面種子全部沖洗下來，接種到裝有300mL YI3D液體培養基的三角瓶中，瓶口用8層紗布包好，搖床振蕩培養，培養溫度30°C，搖床轉速220rpm，培養24 30小時后，菌體OD6tltl達到3 5，獲得搖瓶一級種子；所述的YPD試管斜面培養基是由重量百分比計的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂和余量的水混合在一起組成；所述的YPD液體培養基是由重量百分比計的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起組成； 2)、二級種子培養 二級種子培養在50L發酵罐中進行，具體如下50L發酵罐裝30L的BSM液體培養基，BSM液體培養基滅菌后，用氨水調BSM液體培養基pH值至4. 5 5. O,然后將搖瓶一級種子300mL全部接種到50L發酵罐內pH值為4. 5 5. O的BSM液體培養基上，接種時罐壓為·O. 05-0. lOMPa，培養時，培養溫度 30 32°C，通風比 I Γ . 5 vvm，罐壓 O. 05MPa, ρΗ4· 5 ·5. 0，培養周期24 30h，得二級種子；所述的BSM液體培養基為質量濃度85%磷酸15mL/L，二水硫酸鈣O. 4g/L，硫酸鉀8 g/L,七水硫酸鎂6 g/L，甘油36g/L和微量元素溶液3 mL/L加水制成，也就是說BSM液體培養基為質量濃度85%磷酸15mL，二水硫酸鈣O. 4g，硫酸鉀8g，七水硫酸鎂6 g，甘油36g和微量元素溶液3 mL加水至I L ;所述的微量元素溶液為五水硫酸銅14g/L，碘化鉀O. 08g/L, 一水硫酸錳4g/L，二水鑰酸鈉O.1 g/L,硼酸O.1 g/L,六水合氯化鈷lg/L，氯化鋅36g/L、七水合硫酸亞鐵65g/L和質量濃度為98%的濃硫酸5mL/L加水制成，也就是說微量元素溶液為五水硫酸銅Hg，碘化鉀O. 08g, 一水硫酸錳4g，二水鑰酸鈉O.1g,硼酸O.1g,六水合氯化鈷lg，氯化鋅36g、七水合硫酸亞鐵65g和質量濃度為98%的濃硫酸5mL加水至/L ; 3)、發酵生產甲醇蛋白 A、發酵培養基的配方和比例與上述BSM液體培養基相同5m3發酵罐內裝發酵培養基3m3，打開蒸 汽閥，通蒸汽進入罐體外盤管及罐體內，用蒸汽將發酵罐中發酵培養基進行滅菌，打開壓力表，待罐內壓力升到O. 15MPa時，調節蒸汽閥門使罐體溫度保持在120°C 125°C，保溫30min，同時對與罐體連接的空氣過濾器進行蒸汽滅菌，滅菌結束后，對發酵培養基進行降溫，當罐內發酵培養基溫度降至30 35°C時，用質量濃度為35%的氨水調節發酵培養基pH至4. 5 5. O ; B、將二級種子30L移種到5m3發酵罐內pH為4.5 5. O的發酵培養基中開始發酵，發酵溫度30 32°C，通風比1:1. 5 2 vvm，罐壓O. 04MPa, ρΗ4· 5 5. 0，培養16 20h，罐內菌體OD6tltl達到32 35，濕重達到80 100g/L，向罐內流加甲醇，甲醇流加量為5 6克/升 小時，打開空氣進口閥門，保持罐內溶氧在30%以上，當溶氧高于60%以上時，加大甲醇流加量，最大流加量達到10 15克/升 小時，發酵過程中，每12小時補加一次微量元素溶液，每次流加2升，直至發酵結束，發酵72 84小時后，菌體濕重達300 360g/L，得發酵液；用蒸汽對罐內發酵液進行滅活處理，發酵液溫度達100°C，保溫時間30min后，對發酵液降溫至60 V 65 °C ；[4)、單細胞菌體蛋白的收集與酶解 降溫至60°C 65°C的發酵液用箱式隔膜壓濾機過濾，板框過濾面積30m2，過濾流速O. 5 1. 5m3/h，板框工作壓力O. 3 O. 5MPa，過濾完成后，將箱式隔膜壓濾機上的濾餅清洗下來，投加到5m3的發酵液儲罐中，向罐中加入清水將濾餅稀釋,清水和濾餅的體積比為3 :1，攪拌均勻，得菌體蛋白稀釋液，用向外盤管輸入熱蒸汽或冷水方式將菌體蛋白稀釋液溫度調整到45 50°C，然后稱取蛋白酶粉用水溶解，得蛋白酶溶液，以每立方米菌體蛋白稀釋液中添加5Kg蛋白酶粉的量，將蛋白酶溶液倒入2m3菌體蛋白稀釋液中并攪拌均勻，在45 50°C，酶解，當水解度達75%以上時，得酶解液，打開蒸汽閥門，對罐內酶解液中的蛋白酶進行滅活，罐內溫度達100°C，保溫時間20min ； [ 5 )、酶解液的板框壓濾及甲醇蛋白肽的提取 將上述酶解液經箱式隔膜壓濾機過濾，收集濾液和濾餅，濾液和濾餅再回收到步驟4)中的5m3發酵液儲罐內用步驟4)同樣的方法和用量進行酶解，得壓濾酶解液； 壓濾酶解液用超濾膜進行濃縮，超濾膜面積22m2，過濾壓力O. 6MPa，溫度30°C，得濃縮液，濃縮液中為截獲的分子量在5000Da以上的小分子蛋白肽； [6)、濃縮液噴霧干燥 在濃縮液中添加濃縮液體積5%的淀粉并攪拌均勻，用噴霧干燥機，進行噴霧干燥，調節進口溫度至130 150°C、出口溫度至65-80°C，調節進料流量為O. 5噸/小時，收集蛋白肽干粉。
2.根據權利要求1所述的甲醇蛋白肽的生產方法，其特征在于，包括如下步驟1)、搖瓶一級種子培養 將巴斯德畢赤酵母HGD-Ol的菌株用劃線法接種至Yro試管斜面培養基上，30°C培養48小時，得試管斜面種子，取I支試管斜面種子，用IOmL無菌水將斜面種子全部沖洗下來，接種到裝有300mL YPD液體培養基的三角瓶中，瓶口用8層紗布包好，搖床振蕩培養，培養溫度30°C，搖床轉速220rpm，培養28小時后，菌體OD_達到4，獲得搖瓶一級種子； [ 2)、二級種子培養 50L發酵罐裝30L的BSM液體培養基，BSM液體培養基滅菌后，用氨水調BSM液體培養基pH值至4. 8，然后將搖瓶一級種子300mL全部接種到50L發酵罐內pH值為4. 8的BSM液體培養基上，接種時罐壓為O. 05-0.1OMPa，培養時，培養溫度30°C，通風比I1. 5 vvm，罐壓O. 05MPa, pH4. 8，培養周期28h，得二級種子； [3)、發酵生產甲醇蛋白 A、發酵培養基的配方和比例與BSM液體培養基相同5m3發酵罐內裝發酵培養基3m3,打開蒸汽閥，通蒸汽進入罐體外盤管及罐體內，用蒸汽將發酵罐中發酵培養基進行滅菌，打開壓力表，待壓力升到O. 15MPa時，調節蒸汽閥門使罐體溫度保持在120°C 125°C，保溫30min，同時對與罐體連接的空氣過濾器進行蒸汽滅菌，滅菌結束后，對發酵培養基進行降溫，當罐內發酵培養基溫度降至32°C時，用質量濃度為35%的氨水調節發酵培養基pH至4.8 ； B、將二級種子30L移種到5m3發酵罐內pH為4.8的發酵培養基中開始發酵，發酵溫度30°C，通風比1:1.7 vvm，罐壓O. 04MPa，pH4. 8，培養18h，罐內菌體OD_達到33，濕重達到90g/L,向罐內流加甲醇，甲醇流加量為5 6克/升·小時，打開空氣進口閥門，保持罐內溶氧在30%以上，當溶氧高于60%以上時，加大甲醇流加量，最大流加量達到12克/升 小時，發酵過程中，每12小時補加一次微量元素溶液，每次流加2升，直至發酵結束，發酵80小時后，菌體濕重達330g/L，得發酵液；用蒸汽對罐內發酵液進行滅活處理，發酵液溫度達·100°C，保溫時間30min，將發酵液降溫至65°C ； · 4)、單細胞菌體蛋白的收集與酶解 降溫至65°C的發酵液用箱式隔膜壓濾機過濾，板框過濾面積30m2，過濾流速lm3/h，板框工作壓力O. 4MPa，過濾完成后，將箱式隔膜壓濾機上的濾餅清洗下來，投加到發酵液儲罐中O. 5m3濾餅，向罐中加入1. 5m3的清水將濾餅稀釋，攪拌均勻，得菌體蛋白稀釋液，降溫至·48 V，然后稱取IOKg蛋白酶粉，用水溶解，倒入菌體蛋白稀釋液中并攪拌均勻，在48 °C，酶解4 5h，水解度達75%以上，得酶解液，打開蒸汽閥門，對罐內酶解液進行滅活，罐內溫度達100°C，保溫時間20min ； ·5 )、酶解液的板框壓濾及甲醇蛋白肽的提取 將上述酶解液經箱式隔膜壓濾機過濾，收集濾液和濾餅，濾液和濾餅再回收到步驟4)中的發酵液儲罐內用步驟4)同樣的方法和用量進行酶解，得壓濾酶解液； 取1. 8 2. Om3壓濾酶解液用超濾膜進行濃縮，超濾膜面積22m2，過濾壓力O. 6MPa，溫度30°C，得濃縮液，濃縮液中為截獲的分子量在5000Da以上的小分子蛋白肽，濃縮液體積·O.6 O. 8m3 ； 6)、濃縮液噴霧干燥 在濃縮液中添加濃縮液 體積5%的淀粉并攪拌均勻，用噴霧干燥機，進行噴霧干燥，調節進口溫度至130 150°C、出口溫度至65-80°C，調節進料流量為O. 5噸/小時，收集蛋白肽干粉。
全文摘要
本發明涉及甲醇蛋白肽的生產方法，有效解決單細胞蛋白作為飼料添加劑后，出現消化不良、轉化效率低的問題，巴斯德畢赤酵母HGD-01菌株接種至YPD斜面培養基上，得試管斜面種子，試管斜面種子接種到YPD液體培養基上，得搖瓶一級種子，搖瓶一級種子接種到BSM液體培養基上，得二級種子，二級種子移種到發酵培養基中發酵得發酵液，滅活后過濾收集濾餅，加水稀釋得濾餅稀釋液，蛋白酶粉加水溶解，倒入濾餅稀釋液中酶解，得酶解液，滅活，過濾，收集濾液、濾餅，回流再次酶解，收集壓濾酶解液，超濾濃縮，加淀粉攪拌，噴霧干燥，本發明具有蛋白肽含量高，氨基酸組成合理，B族維生素豐富的特點，可作為替代畜禽飼料蛋白的理想原料。
文檔編號C12P21/06GK103060411SQ20131000172
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月5日 優先權日2013年1月5日
發明者喬國厚, 王蘭甫, 茍萬曉, 胡元森, 張寅 , 曹敏, 樊崇, 張國杰, 許宗浩, 衛紅偉, 田亞鵬, 朱廣有, 王霞 申請人:義馬煤業集團煤生化高科技工程有限公司