專利名稱：一種利用酸堿度控制乙醇發酵過程實現細胞循環利用的方法
技術領域：
本發明涉及ー種利用酸堿度控制こ醇發酵過程實現細胞循環利用的方法，屬于生物工程領域。
背景技術：
雖然以糖質或淀粉質原料的燃料こ醇生產始終充滿爭議，但無可辯駁的是燃料こ醇已成為現今利用最為廣泛的生物能源產品，其在交通運輸業的大規模使用，有效地降低了人類對化石燃料的依賴(非專利文獻I)。為降低燃料こ醇的生產成本，使用木質纖維素原料是未來的發展方向，但無論實驗室的研究，還是エ業化的嘗試中，基于 木質纖維素的燃料こ醇生產仍面臨著許多技術難題，大規模應用仍需較長的時間(非專利文獻2)。通過改善こ醇發酵エ藝，既可以直接降低現有こ醇生產成本，也為今后以木質纖維素為原料的燃料こ醇生產做好技術儲備。發酵過程中，相當部分的底物轉化為生物量而非產品，降低了底物的轉化率。此夕卜，發酵后期的細胞往往仍具有較高的發酵活性，棄之可惜。因此，使用細胞循環利用技木，將發酵結束后的細胞收集回收，重新投入發酵過程中，即能實現高效底物轉化，又能滿足快速發酵對高生物量的要求。自絮凝釀酒酵母不僅擁有優秀的こ醇發酵性能，而且具有自發凝集成團的特性。在發酵結束后靜置沉降即可快速而簡便的實現細胞與發酵液的分離，進而方便菌體的循環利用。由于沒有使用過濾和離心等對細胞結構有害的分離方式，細胞活性保持良好。此外，細胞再循環利用過程中，生物量得到了累積，使得發酵速度增快，こ醇生產強度提高。(非專利文獻3)在細胞循環利用過程中，何時進行細胞的分離十分重要。如果發酵尚未結束就分離細胞，會造成發酵液中殘糖水平高，増加后期蒸餾和廢水處理的難度。但如果發酵結束后遲遲不采出酵母細胞，細胞在無糖情況下會消耗こ醇并且細胞死亡率會顯著增加。因此，進行細胞循環的時機是發酵剛結束的時刻，此時的標志為殘糖水平低于0.1 g/L。不幸的是，現今并沒有簡單廉價的實時葡萄糖濃度檢測方法，一般的做法是由操作員每隔一定時間采樣分析判斷。這樣極大的增加了人工負擔，并不利于實現過程的自動化。現有文獻及專利未有針對該問題的解決策略。酸堿度(pH)是發酵過程中重要的、通常進行過程優化的環境條件。發酵過程中的PH變化，能夠在一定程度上反映發酵進行的狀態。例如發酵初期，由于大量代謝產物有機酸的合成，造成發酵液PH的下降；發酵后期，糖類底物消耗完畢，細胞利用有機酸充當碳源，使得PH出現回升。因此，本文基于這ー原理，開發出能夠識別發酵結束狀態并且自動實現細胞循環利用的方法。非專利文獻I :Solange IM, Dragone G, Guimaraes PMR, Silva JPA, CarneiroLMj Roberto ICj et2010. Technological trends, global market, andchallenges of bio-ethanol production. Biotechnology Advances 28:817-30.
非專利文獻2:1. Bai FWj Liu CGj Huang H，Tsao GT. 2012. Biotechnology inChina III: Biofuels and Bioenergy. Springer, New York.非專利文獻3 Li F, Zhao XQj Ge XMj Bai FW. 2009. An innovativeconsecutive batch fermentation process for very high gravity ethanolfermentation with self-flocculating yeast. Applied Microbiology andBiotechnology 84:1079-86.

發明內容
本發明的目的在于提供ー種自動控制的細胞循環利用策略，從而增加細胞使用效率、提高こ醇收率、并降低勞動強度的方法。
ー種利用酸堿度控制こ醇發酵過程實現細胞循環利用的方法，該方法包括(I)こ醇生產菌的培養與循環利用；(2)監測酸堿度值判斷こ醇發酵的結束狀態；(3)發酵結束狀態啟動控制設備實現自動酵母循環利用。在本發明的方法中，こ醇生產菌為具有自絮凝特征的釀酒酵母。在內容(I)中，當發酵結束時，停止攪拌和通氣，以便讓細胞形成絮凝顆粒快速沉降。待細胞完全沉降分離后，排出上清液，加入新鮮培養基，循環使用酵母。在內容(2)中，控制pH在設定點，如發酵后期pH在一定時間段內(如I h)持續增高，且比こ醇發酵過程pH設定值高出0. 05吋，則認為發酵結束。在內容(3)中，控制系統識別發酵結束的信息，通過程序完成細胞沉降、排出發酵液和補充培養基的操作，實現酵母的循環利用。通過本發明的方法，利用自絮凝酵母沉降特性，輕松實現細胞的分離和循環利用，有利于細胞活性的保持和高生物量的積累，滿足高效こ醇生產的要求。特別是應用了 PH監控和控制該過程，提高了細胞循環的自動化水平，極大地降低了人力成本。為目前以降低成本為目的燃料こ醇生產提供了有力的技術支持。


圖I為本發明中用于發酵及控制裝置結構示意圖。圖2為本發明中進行自動控制的流程圖。圖3為示范例中發酵過程中pH曲線變化圖。
具體實施例方式下面，結合附圖對發明進行詳細說明。<培養こ醇生產菌及循環利用>首先，在發酵罐(F)中使用YH)種子培養基來培養こ醇生產菌。該設計需要有自絮凝能力的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。所述種子培養基使用較低糖濃度(〈100 g/L),加入足量的酵母粉(>10 g/L)和蛋白胨(>5 g/L)。在121°C滅菌10分鐘，冷卻到室溫后，接入斜面保存的酵母菌株。為保證種子量滿足要求并且處于生長最活躍的對數生長期。培養時間優選為15-20 h，更優選為18 h ;培養溫度優選為28-32°C，更優選為30°C。轉速為150 r/min并大量通氣0. 2 vvm加速生物量積累。 發酵時使用的發酵培養基中以葡萄糖為碳源，也可以以淀粉、糖蜜、木薯或者纖維素水解液(例如秸桿水解液)等為發酵培養基中的碳源。發酵溫度優選為28_32°(，更優選為30°(。發酵過程中的？11優選控制在不低于4.5，當PH低于4. 5吋，向培養基中加入氫氧化鈉水溶液或氨水，當pH大于4. 5吋，不需要調整。以殘糖作為發酵結束的指標，當殘糖降至0. I g/L以下時，可認為發酵結束。發酵結束后需要進行細胞循環操作靜置讓細胞沉降，實現菌體與發酵液的分離，再排出發酵液留剩酵母在發酵罐中，加入新鮮培養基循環使用酵母進行新的發酵。循環利用酵母的好處是第一、酵母細胞在發酵結束后仍具有相當高的活性，如果直接排放在經濟上并不劃算，可以回收利用；第二、生物量在循環利用的過程中得到了累積，實現了高密度細胞發酵，極大地加速了發酵速度。<酸堿度值判斷こ醇發酵的結束狀態>以底物糖的濃度低于0.1 g/L作為發酵結束的標志。由于沒有適合的實時檢測糖濃度的方法，需要人工采樣測量來決定何時終止發酵過程，因此存在自動化程度低，結束時間判斷不準的情況。采用監控酸堿度pH，能夠檢測發酵后期葡萄糖是否消耗完畢。批次發酵中的pH變化經歷了下降，穩定和上升三個階段。發酵初期，細胞代謝糖類物質產生各類有機酸導致發酵液中的PH值出現下降，當pH下降低于こ醇發酵過程pH設定值時，控制系統(C)開啟泵(P3)加入定量的堿液(氫氧化鈉或氨水)，維持其在設定值。當發酵結束后，失去了糖類物質作為底物，細胞選擇使用有機酸類作為碳源，導致了發酵液pH值的回升。因此可以利用通過pH值的回升來判斷發酵結束的時刻。為避免錯誤判斷，如堿量加入過量、pH值尚未降至設定值等，控制系統(C)需要監測到PH持續上升至少I h，并且上升的值不小于0.05，方可認為是發酵結束的標志。<控制設備實現自動酵母循環利用>如圖2自動控制的流程圖所示，控制系統(C)不僅維持發酵過程中pH在設定值，還負責解讀PH曲線的變化。一旦出現pH持續上升至少I h，持續上升是指在連續的采樣數據中，后面的數據要始終大于或等于相鄰的前一個數據。滿足這ー前提，如最后ー采樣數據值大于或等于こ醇發酵PH設定值+0.05，則判斷發酵結束。此時控制系統停止攪拌器(R)和空氣泵(A)工作5-10 min，靜置讓酵母絮凝沉降。開啟泵(Pl)抽出上清發酵液，排液管ロ在發酵罐的位置可在工作液面的10-20%處。排出上清液后，關閉泵(P1)，開啟泵(P2)加入培養基至工作液面。開啟攪拌器(R)和空氣泵(A)進行下一次的發酵。如上所述，本發明的方法實現了こ醇發酵過程中細胞的循環利用，提高了底物的利用效率；而且自動化程度高，大大降低了人力資本。本發明對進ー步降低燃料こ醇的成本，降低其對國家補貼的依賴性，緩解世界化石能源的短缺具有實用價值。實施例下面結合實施例對本發明作具體說明。但本發明不受下述實施例的限制，在符合本發明前后宗g的范圍內，可對本發明作適當變更。另外，下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學公司購買。こ醇生產菌釀酒酵母SPSC01，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC0587)。Yro種子培養基每升培養基中含葡萄糖30 g、酵母粉5 g、蛋白胨5 g。發酵培養基每升培養基含葡萄糖200 g、酵母粉10 g、蛋白胨10 go培養基使用121で的蒸汽滅菌15 min后冷卻使用。先使用種子培養基培養絮凝酵母，該步驟的主要目的是大量培養生物量為后續循環利用提供充足的細胞。發酵罐工作體積為Iし培養條件為溫度30で，攪拌速率150 r/min,通氣量0.2 vvm。pH控制不低于4. 5。發酵過程使用發酵培養基，通氣量減小至0.05 vvm。發酵過程中將pH控制最低點控制在4. 5，具體控制方式為使用pH電極檢測發酵液中的pH值，當pH值下降到設定值4. 5以下吋，開啟泵(P3)通入I mol/L的氫氧化鈉溶液使pH值上升，當pH值大于4. 5吋，停止泵(P3)。在控制中，使用PID的控制方式。圖3為絮凝酵母細胞多次循環利用過程中的PH變化曲線。可以看出在發酵過程中，雖然pH值有ー些波動，但是并沒有滿足pH持續上升I h，且超出こ醇發酵過程pH設定值0.05的情況，因此控制設備并沒有任何動作。在發酵結束吋，pH出現持續性的上升，為保證判斷的可靠性，本實驗選取pH=4. 57作為控制結束的標志。控制系統停止攪拌器(R)和空氣泵(A)，靜置10 min讓酵母絮凝沉降。開啟泵(Pl)抽出上清發酵液，排液管ロ在發酵罐的位置在工作液面的10%處。排出上清液后，關閉泵(P1)，開啟泵(P2)加入培養基至工作體積為Iし開啟攪拌器(R)和空氣泵(A)進行下一次的發酵。本實驗共循環使用酵母細胞6次。發酵結果表明如表I所示，細胞的生物量在循環利用中得到了積累，6次循環過后生物量接近初始的4倍，且存活率保持良好，并未因長時間的使用而出現明顯下降。因此發酵時間也相應的縮短，第6次發酵所用時間僅為首次時間的33. 9%。表I細胞循環利用的效果
權利要求
1.一種利用酸堿度控制乙醇發酵過程實現細胞循環利用的方法，其特征在于，該方法包括 (1)乙醇發酵菌的培養與循環利用； (2)利用酸堿度值監測乙醇發酵的結束狀態； (3)步驟(2)所判斷的結束狀態啟動控制設備自動完成酵母循環利用的操作。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，在步驟(I)所述乙醇生產菌為具有自絮凝特性的釀酒酵母。循環利用酵母的方式為發酵結束時停止通氣與攪拌后，利用酵母絮凝沉降實現菌體與發酵液的分離，進而排出發酵液加入培養基，循環利用酵母。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中發酵后期pH值高于乙醇發酵過程設定值O. 05后，認為發酵過程結束。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于， 通過發酵后期PH值高于乙醇發酵過程pH設定值O. 05的判斷，啟動控制設備自動完成細胞沉降、排出發酵液和補充培養基的操作，實現酵母細胞的循環利用。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于， 通過發酵后期PH值高于乙醇發酵過程pH設定值O. 05的判斷，啟動控制設備自動完成細胞沉降、排出發酵液和補充培養基的操作，實現酵母細胞的循環利用。
全文摘要
本發明是一種利用酸堿度控制乙醇發酵過程實現細胞循環利用的方法，該方法包括乙醇發酵菌的培養與循環利用、利用酸堿度值監測乙醇發酵的結束狀態和自動控制完成酵母循環的操作。通過本發明的方法，利用自絮凝酵母沉降特性而進行細胞循環利用。首先，減少了細胞合成對底物造成的分流，提高了底物到產物的轉化率，降低了原料成本；其次，細胞累積縮短了發酵時長，提高了設備生產強度，減少了過程中的能耗成本；再次，使用酸堿度監控，實現了過程的自動化，降低了人力成本。因此，該發明為以降低成本為目的燃料乙醇生產提供了有力的技術支持。
文檔編號C12N1/18GK102952829SQ201210461609
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者劉晨光, 劉黎陽, 白鳳武 申請人:大連理工大學