專利名稱：具有增加的穩定性的突變型乳酸氧化酶以及涉及其的產品、方法和用途的制作方法
具有增加的穩定性的突變型乳酸氧化酶以及涉及其的產品、方法和用途本發明涉及具有增加的穩定性的突變型乳酸氧化酶(lactate oxidase)、編碼突變型乳酸氧化酶的核酸、包含所述核酸的表達載體、包含所述核酸或所述表達載體的宿主細胞、測定樣品中的乳酸的方法、突變型乳酸氧化酶用于測定乳酸的用途、使用所述突變型乳酸氧化酶用于測定樣品中的乳酸的裝置和包含所述突變型乳酸氧化酶用于測定乳酸的試劑盒。乳酸(lactic acid)也稱為乳酸(milk acid),在幾個生物化學過程中起作用。乳酸是具有化學式C3H6O3的a羥酸。在溶液中它以其離子形式存在，即作為乳酸根(lactate)CH3CH(OH)COO。乳酸(lactate)是手性的，并且具有2種光學異構體。一種稱為L_( + )_乳酸或(幻-乳酸，并且另一種稱為D-()-乳酸或0 )-乳酸。L- ( + )-乳酸是生物學重要的異構體。
在動物(包括人)中，L-乳酸(L-1actate)在正常代謝和運動過程中經由酶乳酸脫氫酶(LDH)由丙酮酸(pyruvate)不斷產生。它通常直到乳酸生產率超過乳酸去除率才在濃度中增加，這由許多因素支配，包括單羧酸轉運蛋白、LDH的濃度和同種型、和組織的氧化能力。在人中，血液乳酸的濃度在靜止時通常是1-2 mmol/L，但在激烈運動過程中可以升高至超過20 mmol/L。乳酸濃度或乳酸與丙酮酸比反映氧化還原態。因此，監控乳酸水平是在組織需氧量和利用之間的平衡的良好指示劑，并且當研究細胞和動物生理學是有用的。相應地，可以監控在生物學樣品例如血清、血漿、血液、尿和唾液中的乳酸或在細胞培養樣品中的細胞內和細胞外乳酸濃度，以便研究或監控受試者或細胞的狀況。血液乳酸的測定頻繁用于競爭性體育運動、健身和康復中，允許
個體運動強度的評估
運動和恢復期的改善 #超負荷和損傷的危險減少
如上文詳述的，無氧糖酵解顯著增加血液乳酸，尤其是對于延長運動。在醫學中，乳酸的測定可以用于 測定組織缺氧
測定疾病的嚴重性和預后，到由乳酸水平反映的程度。例如，乳酸濃度可以在降低機體可用的氧量、增加乳酸生產和/或降低乳酸清除率的任何狀況下增加。這可以是從由于劇烈運動在肌肉中產生的乳酸的局部增加直到威脅生命的全身休克的任何事情。過量乳酸可以存在于一系列疾病、感染和遺傳性代謝和線粒體病癥中。關于增加的血液乳酸的常見原因是起因于此類狀況例如休克、肺炎和充血性心力衰竭的缺氧。乳酸酸中毒還可以在腎衰竭和白血病中出現。此外，硫胺素缺乏病和糖尿病酮癥酸中毒與增加水平的乳酸相關。它們還可以通過特定藥物例如二甲雙胍(由糖尿病患者服用)和異煙肼(肺結核治療)引起。用于測定乳酸的測試是本領域已知的。近年來，用于測定乳酸的酶促方法已得到開發。酶促方法涉及在測定方法中酶的使用，并且一般是簡單的且提供更大的特異性、準確度和重現性。對于乳酸測定描述的第一種酶促方法基于通過乳酸脫氫酶從乳酸到鐵氰化鉀的氫轉移。然而，該程序是麻煩的且未受到廣泛承認。后續方法涉及NADH形成的UV測量。在1974年，描述了測量通過由乳酸脫氫酶催化的乳酸氧化形成的NADH的乳酸程序，使用肼作為用于丙酮酸的捕獲劑。另一種方法還基于乳酸脫氫酶的催化作用，但在反應混合物中包括丙氨酸轉氨酶，以更快速地去除由乳酸轉換形成的丙酮酸。另外一種方法使用涉及乳酸氧化酶的酶促反應，以將乳酸轉換為丙酮酸。通過這種反應產生的過氧化氫隨后可以用于酶促反應中，以生成有色染料。來自綠淺氣球菌(Jerococcus viridans )的乳酸氧化酶通常用于生物傳感器和體外測試中，以便檢測例如在血液中的乳酸。這些生物傳感器和體外測試占優勢地用于例如重點護理患者和運動員的監控中。傳感器的壽命由乳酸氧化酶的穩定性決定，所述乳酸氧化酶在使用和貯存期限過程中變得失活。此外，用于體外測試的試劑的貯存期限和使用中時間受乳酸氧化酶的穩定性影響。因此，增加乳酸氧化酶的穩定性具有很大利益，以便增加生物傳感器和體外測試的貯存期限和使用中時間。相應地，本發明的目的是提供具有增加的穩定性的乳酸氧化酶。 令人驚訝的是，已發現在SEQ ID NO:1的乳酸氧化酶的氨基酸序列的位置191上的酪氨酸突變增加乳酸氧化酶的穩定性。由于傳感器和測試的有限貯存期限和使用中時間，它們必須頻繁取代，因為活性下降到技術可接受的水平下。明顯地，傳感器和測試設備的頻繁變化是消費者不友好的、資源的浪費且因此要避免的。由于野生型乳酸氧化酶的低穩定性，涉及乳酸氧化酶的測定通常在低溫下執行。增加的乳酸氧化酶穩定性的另外優點將是當測量乳酸時，在用于血液分析的裝置中，用于將溫度減少至25 - 30°C的恒溫器(thermostate)是可以避免的，因為血氣分析(通常伴隨執行)通常在37°C執行。相應地，更穩定的乳酸氧化酶將顯著減少裝置的復雜性。這將提供關于低成本裝置的基礎，這例如在所謂的新興市場中具有特別關聯性。相應地，在第一個方面，本發明提供了具有增加的穩定性的突變型乳酸氧化酶，其包含這樣的氨基酸序列，其
(i)與SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其功能活性變體至少90%等同；
和
(ii)具有在對應于SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的位置Tyrl91的位置上的氨基酸
置換，
其中功能活性變體具有在選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的Gly36、Ala95、Thrl03、Glul60、Vall98、Asn212、Ala/Gly232和Phe277的位置上的至少一個進一步的氨基酸置換。術語“乳酸氧化酶”(由國際生化聯合會的酶學委員會(Enzyme Commission of theInternational Union of Biochemistry)分類為 EC 1.1.3.15)一般意指催化 L-乳酸至丙酮酸的氧化的酶，伴隨O2至H2O2的還原((S)-2-羥酸氧化酶)。乳酸氧化酶是FMN (黃素單核苷酸)依賴性a羥酸氧化酶家族的成員。它采用黃素單核苷酸(FMN)作為輔因子。乳酸氧化酶在病毒和細胞生物中出現。根據本發明，與在位置191上不含突變的各自乳酸氧化酶相比較，突變型乳酸氧化酶具有增加的穩定性。令人驚訝的是，發現其中Tyr由另一種氨基酸置換的在位置191上的突變，特別是帶有非極性較大側基的氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸和色氨酸的置換，相對于野生型乳酸氧化酶，增加在堿性環境的存在下酶的穩定性。用于研究酶的穩定性特別是依賴于環境條件例如培養基條件的合適測試是技術人員眾所周知的。合適和示例性測試也在實施例特別是實施例1中描述。在本發明的一個優選實施方案中，相對于在位置191上不含突變的各自乳酸氧化酶，突變型乳酸氧化酶的增加的穩定性表示為相對于在位置191上不含突變的各自乳酸氧化酶的半衰期(t1/2 (野生型191))，在突變型的半衰期(t1/2 (mutl91))中的增加。酶的半衰期(t1/2)指示其中50%的原始活性(在t=0時的活性)喪失(關于進一步舉例說明參見實施例I)和在這之后殘留活性量至50%的時間量。·
相應地，增加的穩定性導致相對于在位置191上不含突變的各自乳酸氧化酶，突變型增加的半衰期。優選地，半衰期增加至少10%、20%、30%或40%，優選至少50%、75%或100%，更加優選至少125%、150%、175%或200%，尤其是250%且最優選300%。半衰期中的增加百分比可以測定為[t1/2 (mutl91)/t1/2 (野生型191) 一 I] * 100。如本文提及的術語“SEQ ID NO:1”指示如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，并且代表來自綠淺氣球菌的野生型乳酸氧化酶的氨基酸序列，具有羧基末端缺失但不具有突變的Tyrl91。綠淺氣球菌的野生型乳酸氧化酶片段是276氨基酸蛋白質。特別地，術語“SEQ ID NO:1”指如下所示的氨基酸序列(請注意上文指定的置換位點由下劃線指出且由位置編號指定)
權利要求
1.一種具有增加的穩定性的突變型乳酸氧化酶，其包含這樣的氨基酸序列，其 (i)與SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其功能活性變體至少90%等同；和 (ii)具有在對應于SEQID NO:1或SEQ ID NO: 2的位置Tyrl91的位置上的氨基酸置換， 其中所述功能活性變體具有在選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的Gly36、Ala95、Thrl03、Glul60、Vall98、Asn212、Ala/Gly232 和 Phe277 的位置上的至少一個進一步的氨基酸置換。
2.權利要求1的突變型乳酸氧化酶，其特征在于在位置191上的酪氨酸由非極性氨基酸置換，特別地其中所述氨基酸置換選自Tyrl91Phe、Tyrl91Leu、Tyrl91Ile、Tyrl91Met和Tyrl91Trp,尤其地所述氨基酸置換是Tyrl91Phe或Tyrl91Leu,優選Tyrl91Phe。
3.權利要求1或2的突變型乳酸氧化酶，其特征在于所述至少一個進一步的氨基酸置換選自 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:2 的 Gly36Ser、Ala95Gly、Thrl03Ser、Glul60Gly、Vall98Ile、Asn212Asp、Ala/Gly232Ser 和 Phe277Tyr。
4.權利要求1- 3的突變型乳酸氧化酶，其特征在于所述至少一個進一步的氨基酸置換是Ala95，特別是Ala95Gly。
5.權利要求1- 4的突變型乳酸氧化酶，其特征在于相對于相應的野生型酶，所述突變型乳酸氧化酶具有至少1. 5倍增加的穩定性，優選至少2倍增加的穩定性，優選至少2. 5倍增加的穩定性，更優選至少3倍增加的穩定性。
6.權利要求4或5的突變型乳酸氧化酶，其特征在于相對于相應的野生型酶，所述突變型乳酸氧化酶具有與羥乙酸相比較對于乳酸至少2倍增加的選擇性，優選至少2. 5倍增加的選擇性，優選至少3倍增加的選擇性，更優選至少3. 5倍增加的選擇性，且最優選至少4倍增加的選擇性。
7.—種核酸，其編碼權利要求1 - 6中任一項的突變型乳酸氧化酶。
8.—種表達載體，其包含權利要求7的核酸，其中所述核酸與能夠促進所述核酸在宿主細胞中的表達的啟動子序列可操作地連接。
9.一種宿主細胞,其包含權利要求7的核酸或權利要求8的表達載體。
10.一種測定樣品中的乳酸的方法，所述方法包括 a)在有助于所述乳酸氧化酶的活性的條件下，使所述樣品與權利要求1- 6中任一項的突變型乳酸氧化酶接觸；和 b)測定 i)在乳酸的存在下由所述突變型乳酸氧化酶產生的丙酮酸和/或H2O2，和/或 ii)在乳酸的存在下由所述突變型乳酸氧化酶消耗的02， 從而測定乳酸。
11.權利要求10的方法， a)其中所述H2O2的測定通過轉換成色原執行，特別是通過過氧化物酶介導的轉換執行；和/或 b)其中所述突變型乳酸氧化酶是傳感器、測試條、測試元件、測試條裝置或液體測試的一部分。
12.權利要求1- 6中任一項的突變型乳酸氧化酶用于測定乳酸的用途。
13.—種用于測定樣品中的乳酸的裝置，其包含根據權利要求1 - 6中任一項的突變型乳酸氧化酶和對于所述測定所需的任選的進一步組分。
14.根據權利要求13的裝置，其特征在于所述裝置包含傳感器，優選電化學傳感器或光傳感器，或測試條。
15.—種用于測定乳酸的試劑盒，其包含根據權利要求1 - 6中任一項的突變型乳酸氧化酶和對于所述測定所需的至少一種進一步試劑。
全文摘要
本發明涉及具有增加的穩定性的突變型乳酸氧化酶、編碼所述突變型乳酸氧化酶的核酸、包含所述核酸的表達載體、包含所述核酸或所述表達載體的宿主細胞、測定樣品中的乳酸的方法、突變型乳酸氧化酶用于測定乳酸的用途、使用所述突變型乳酸氧化酶用于測定樣品中的乳酸的裝置和包含所述突變型乳酸氧化酶用于測定乳酸的試劑盒。
文檔編號C12N15/53GK103013940SQ20121035120
公開日2013年4月3日 申請日期2012年9月20日 優先權日2011年9月20日
發明者T.邁爾, B.薩法爾, T.施托伊澤, B.尼德茨基, S.萊特格布 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司