專利名稱：一種高爾基體膜蛋白gp73核酸適配子、其制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種適配子、其制備方法及其用途，尤其是一種高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子、其制備方法及其在制備診斷或治療肝細胞癌藥物中的用途。
背景技術：
隨著基因工程技術的發展，人們可以方便地根據基因序列進行各種蛋白的人工表達，大大推動了基于抗原抗體反應的免疫檢測技術的快速發展。盡管如此，由于抗體本身的 不穩定性，如制備周期長、雜交瘤細胞在長期凍存和傳代過程中易發生染色體突變，以及對外界環境敏感，受pH、溫度影響易失活，保存期短等特性的影響，一定程度上制約了免疫檢測技術的特異性和靈敏度。肝細胞癌(HCC)是世界五大常見癌癥之一，其增長速度非常之快。肝硬化是HCC發病過程中的一個重要發展過程，因此，肝硬化患者組成了 HCC的高危人群。近年來研究發現，一種高爾基體膜蛋白GP73以良好的敏感性被視為最具有潛力的HCC標記物。GP73作為潛在的HCC標記物，首先要考慮的是建立一種經濟、簡便的抗干擾能力強的方法來檢測GP73，這樣才能真正將GP73的價值推廣運用于臨床。目前，檢測人GP73的酶聯免疫吸附實驗(ELLSA)試劑盒已經出現，但由于受到抗體來源和自身不穩定性質的影響，如抗體本身的不穩定性(制備周期長，雜交瘤細胞在長期凍存和傳代過程中易發生染色體突變)，及對外界環境敏感，受pH、溫度影響易失活，保存期短等特性的影響，一定程度上制約了免疫檢測技術的特異性和靈敏度，同時動物實驗難以控制，制備抗體實驗周期較長，成本較高，故目前僅限于科研使用，難以推向臨床。適配體是一種DNA或RNA的寡核苷酸單鏈,它能與其他分子祀標高親和力、高特異性地結合。它是利用指數富集配體進化系統(systematic evolution of ligands byexponential enrichment, SELEX)技術從人工合成的寡核苷酸文庫中篩選而來的。這一技術是基于文庫中的寡核苷酸單鏈能折疊成三維空間立體結構，與靶標高親和力、高特異性地結合的特性建立起來的。適配子(Aptamer，又稱核酸適體)，它是通過模擬自然進化過程的指數富集配體系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)篩選得到的具有識別功能的新型核酸分子，其本質為RNA或單鏈NDA(single stranded DNA,ssDNA)片段，這些片段在遇到靶標分子時，可形成口袋、發卡、G-四聚體等各自獨特的三維結構與靶分子結合，類似于抗體特異性識別相應抗原表位的過程。與抗體相比，適配子與靶標的親和力更高，甚至強于其天然配體，解離常數(kd)多在pmol/L-nmol/L之間；適配子能夠分別出靶分子結構上細微的差別，甚至可以區分I個甲基或I個羥基的差別，形成了識別的高度特異性，而且適配子篩選周期更短，一般一個SELEX需要8 15個循環，約2個月時間。更為重要的是適配子便于修飾，可以在合成時精確、定點、隨意連接其他功能基團和分子，如巰基、氨基和熒光素、生物素、酶等。由于適配子為單核苷酸序列，一旦篩選出，就可以快速源源不斷的人工合成相同的適配子，幾乎不存在適配子制備的批間誤差，真正實現高效、快速、低成本的合成，摒棄了傳統的復雜、重復、難控的抗體制備的動物實驗。因此，適配子的問世是生物診斷領域又一次革命性的新突破。迄今篩選到的凝血酶、茶堿、抗血管內皮因子等適配子已在診斷中彰顯出廣闊的應用前景。基于適配子技術，發展高特異性和高靈敏度的檢測新方法也稱為當前生命科學領域一個非常活躍的研究探索方向，但是針對高爾基體膜蛋白GP73適配子的篩選及其用于肝癌早期診斷的研究在國內外尚未見報道。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足之處而提供一種特異性和靈敏度較高、成本較低的高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子；同時，本發明還提供了所述適配子的制備方法及其用途。 為實現上述目的，本發明采取的技術方案為一種高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子，其核苷酸序列為5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAGTTGGTTTTTTTTTGTTATTTAGAGTAAAAACCTTGTGTGTAGTGACTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ 。所述高爾基涂膜蛋白GP73核酸適配子中，兩端分別為序列固定的20個堿基，中間45個堿基是與GP73某個空間位點結合的關鍵結構。本發明所述高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子的序列能夠很好的同GP73結合，并運用于臨床實驗。目前監測GP73方法的原理主要基于抗原抗體反應，但抗體的制備需要動物實驗，抗體自身保存使用的條件較為苛刻，具有很多不穩定因素，本發明所述的高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子剛好彌補了這些不穩定因素，而且制備方法和成本較抗體低的多，可為后期臨床的廣泛使用打下堅實的基礎。本發明還提一種如上所述高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子的制備方法，所述方法包括以下步驟(I)隨機ssDNA文庫的構建構建人工合成的隨機SsDNA文庫，文庫中所有寡核苷酸分子的兩端為固定相同序列，中間為隨機序列，隨機序列的長度為20-1 IOnt，文庫中不同寡核苷酸分子的容量為IO14-IO15 ；(2)將步驟(I)構建的ssDNA文庫直接用于篩選，篩選過程包括靶標的固定、文庫與靶標共同孵育、洗滌并棄去未結合的適配子、洗脫并收集結合靶標的適配子、PCR擴增收集的適配子、PCR得到雙鏈DNA轉變成ssDNA進行下輪篩選；或者將步驟(I)構建的ssDNA文庫反轉錄成RNA文庫，然后用于篩選，篩選過程包括靶標的固定、文庫與靶標共同孵育、洗滌并棄去未結合的適配子、洗脫并收集結合靶標的適配子、將收集到的適配子反轉錄成ssDNA、PCR擴增收集的適配子、PCR得到雙鏈DNA轉變成ssDNA進行下輪篩選；(3)重復步驟(2)進行8-15輪，即可篩選到高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子。適配子的SELEX篩選過程中，首先要構建人工合成的隨機ssDNA文庫，文庫中所有寡核苷酸分子的兩端為固定相同序列，中間為隨機序列，隨機序列的長短一般在20-110nt，所以文庫中不同寡核苷酸分子的容量可達到IO14-IO15,構成了具有豐富分子構象的多樣性文庫，理論上包括了幾乎能與自然界所有分子相結合的適配子。ssDNA文庫可直接用于篩選，也可反轉錄成RNA文庫后用于篩選，兩者的區別在于ssDNA較RNA更為穩定，但RNA文庫的構象較ssDNA更為豐富，實驗中可根據具體的實驗要求選擇不同的文庫。SESEX整個過程以ssDNA文庫為例，包括靶標的固定、文庫與靶標共同孵育、洗滌并棄去未結合的適配子、洗脫并收集結合靶標的適配子、PCR擴增收集的適配子(若選擇RNA文庫，先要將收集到的適配子反轉錄成ssDNA，再進行PCR擴增)、PCR得到的雙鏈DNA轉變成ssDNA (該ssDNA為初始文庫中的單鏈，不是其反鏈)進行下輪篩選。重復上述步驟進行8-15輪，即可篩選到與靶標高親和力和特異性的適配子。此時，將最后一輪篩選所得的PCR產物進行克隆測序，分析適配子的序列，并進行特異性和親和力的鑒定，進一步分離出有價值的適配子。作為本發明所述高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子的制備方法的優選實施方式，所述步驟(I)中構建的ssDNA文庫為全長85bp的單鏈DNA文庫5’ -ACGCTC GGA TGC CACTAC AG-45n-CTC ATG GAC GTG CTG GTG AC-3，，兩端分別為序列固定的20個堿基，中間45個堿基為隨機序列，整個文庫容量為454。 另外，本發明還提供了所述高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子在制備診斷或治療肝細胞癌藥物中的用途。本發明所述高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子與現有的抗原抗體技術相比，所述適配子不需要難控復雜的動物實驗，只需要在普通實驗室即可完成，因為實驗過程中不需要將蛋白作為抗原注入動物體內，只需要以蛋白為靶標，經過重復篩選即可獲得。實驗周期較短，從篩選到克隆測序分析完成，r2個月即可完成，而動物實驗最快也要5個月才能完成。篩選獲得適配子后，只需要按照適配子的序列，即可源源不斷的合成相同的適配子，只要技術適當，可以避免批間差異的產生，這一點是抗體制備過程中無法控制避免的。而且篩選的適配子可以進行各種修飾，且保持時間長，使用條件不苛刻，更加廣泛地應用于其他方面。


圖I為本發明所述高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子的SELEX篩選過程示意圖。圖2為ssDNA次級文庫篩選過程示意圖。圖3為PCR擴增所得dsDNA電泳圖；圖3中，M :東盛IowDNA marker ；1 PCR循環數為5時，dsDNA電泳結果；2 =PCR循環數為8時，dsDNA電泳結果；3 :PCR循環數為12時，dsDNA電泳結果；4 :PCR循環數為16時，dsDNA電泳結果；5 :PCR循環數為20時，dsDNA電泳結果；6 :PCR循環數為30時，dsDNA電泳結果。圖4為1、3、5、6、8、10輪篩選文庫與重組GP73結合率的直方圖；圖4中，橫坐標表示不同篩選輪數所得的文庫；縱坐標表示在405nm處的吸光度。圖5為正常肝組織和肝癌組織在低倍鏡和高倍鏡下的光鏡觀察圖；圖5中，A :正常肝組織，箭頭表示在低倍鏡下觀察到的膽管中有棕紅色物質；B :正常肝組織，箭頭表示在高倍鏡下觀察膽管中的棕紅色物質；C :肝癌組織，箭頭分別表示低倍鏡下膽管中和廣泛肝組織中的紅棕色物質；D :肝癌組織，箭頭表示在高倍鏡下，觀察膽管中和廣泛肝組織中的紅棕色物質。
具體實施例方式為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合附圖和具體實施例對本發明作進一步描述。實施例I高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子的篩選I、隨機ssDNA文庫與相應引物的合成設計合成全長為85bp 的單鏈 DNA (ssDNA)文庫5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-45n-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’，兩端分別為序列固定的20個堿基，以便設計相應的PCR引物，中間45個堿基為隨機序列，整個文庫容量達到了 454 ;上游引物5’ -ACG CTC GGA TGCCAC TAC AG-3’，下游引物 5’-GT CAC CAG CAC GTC CAT GAG-3’ ；上游標記引物 5’-DIG (地高辛)-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-3’，下游標記引物 5’-Biotin (生物素)-GT CAC CAGCAC GTC CAT GAG-3，。2、GP73蛋白適配子的篩選 (I) GP73蛋白以每孔200ng的量包被于96孔板上(包被液為0. 05mol/LNaHC03,PH9. 6的緩沖液)，4°C包被過夜，設立空白對照孔；次日棄去孔中液體，用PBS-T洗滌3次，于吸水紙上拍干，蛋白包被孔和空白對照孔均以3%BSA200ii L37°C封閉2h。(2)將IOiiM的ssDNA文庫隨機與一定量結合緩沖液SHCMK液混合(注意調整ssDNA文庫量，在第一輪的篩選中，文庫量為2000pmol，經過篩選輪數的增加，文庫量逐漸減少)，混合后的文庫先與3%BSA封閉的空白對照孔37°C結合40min，反篩去與空白孔結合的ssDNA，然后將混合液轉移到蛋白包被孔，37 0C結合40min，用沖洗緩沖液(SHCMK液+0. 05%Tween20)洗六次，洗去未結合的ssDNA,再加洗脫緩沖液(20mmol/L Tris-HCL,4mol/L異硫氰酸胍，lmmol/DTT, PH8. 3)于80 °C作用IOmin,洗脫下與目的蛋白結合的ssDNA,經DNA純化試劑盒，將ssDNA溶解于50微升TE緩沖液中。(3)以上述純化所得的ssDNA為模板，用上游引物和生物素下游標記引物進行PCR擴增，擴增體系如下
權利要求
1.一種高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子，其特征在于，其核苷酸序列為5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAGTTGGTTTTTTTTTGTTATTTAGAGTAAAAACCTTGTGTGTAGTGACTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，。
2.一種如權利要求I所述高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)隨機ssDNA文庫的構建構建人工合成的隨機ssDNA文庫，文庫中所有寡核苷酸分子的兩端為固定相同序列，中間為隨機序列，隨機序列的長度為20-1 IOnt，文庫中不同寡核苷酸分子的容量為IO14-IO15 ； (2)將步驟(I)構建的ssDNA文庫直接用于篩選，篩選過程包括靶標的固定、文庫與靶標共同孵育、洗滌并棄去未結合的適配子、洗脫并收集結合靶標的適配子、PCR擴增收集的適配子、PCR得到雙鏈DNA轉變成ssDNA進行下輪篩選；或者將步驟(I)構建的ssDNA文庫反轉錄成RNA文庫，然后用于篩選，篩選過程包括靶標的固定、文庫與靶標共同孵育、洗滌并棄去未結合的適配子、洗脫并收集結合靶標的適配子、將收集到的適配子反轉錄成ssDNA、PCR擴增收集的適配子、PCR得到雙鏈DNA轉變成ssDNA進行下輪篩選； (3)重復步驟(2)進行8-15輪，即可篩選到高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子。
3.如權利要求I所述高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中構建的ssDNA文庫為全長85bp的單鏈DNA文庫5’-ACG CTC GGA TGC CAC TACAG-45n-CTC ATG GAC GTG CTG GTGAC-3’，兩端分別為序列固定的20個堿基，中間45個堿基為隨機序列，整個文庫容量為454。
4.如權利要求I所述高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子在制備診斷或治療肝細胞癌藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開一種高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子，所述適配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明所述高爾基體膜蛋白GP73核酸適配子，能夠很好的同高爾基體膜蛋白GP73結合，具有較高的特異性和靈敏度，而且保存時間長，成本較低。本發明還公開了所述適配子的制備方法及其在制備診斷或治療肝細胞癌藥物中的用途。
文檔編號C12Q1/68GK102766632SQ20121023595
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月9日 優先權日2012年7月9日
發明者徐霞, 蔡媛媛 申請人:徐霞