專利名稱：原核表達構建體的制作方法
原核表達構建體
在本文中報道了一種用于在原核細胞中生產多肽的表達構建體。所述表達構建體包含多肽原，所述多肽原在N端至C端方向包含二肽GS、氨基酸標簽、二肽GS和蛋白酶切割位點。
背景技術：
用于生產重組多肽的表達系統是在現有技術中眾所周知的，且描述在例如，Marino, Μ. H. , Biopharm. 2 (1989) 18-33 ；Goeddel, D. V.,等人，Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7 ；ffurm, F.,和 Bernard, A. , Curr. Opin. Biotechnol. 10(1999) 156-159。
通常在哺乳動物細胞(諸如CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、 BHK細胞、PER.C6 細胞等等)中生產用于藥用的多肽(諸如抗體和抗體融合體)。真核表達質粒的元件通常是原核質粒擴增單位，例如就大腸桿菌(E. coli)而言，包含原核復制起點和原核選擇標記、真核選擇標記、以及一個或更多個用于表達目標結構基因的表達盒， 所述表達盒各自含有啟動子、結構基因和轉錄終止子，包括多腺苷酸化信號。為了在哺乳動物細胞中進行瞬時表達，可包含哺乳動物復制起點，諸如SV40 Ori或OriP。可選擇組成型或誘導型啟動子作為啟動子。為了優化轉錄，可在5’非翻譯區中包含Kozak序列。為了 mRNA加工，尤其是mRNA剪接和轉錄終止，可包含mRNA剪接信號(取決于結構基因的組織 (外顯子/內含子組織))以及多腺苷酸化信號。
可以在原核細胞、酵母中，且主要在大腸桿菌中，生產用于藥用的其它多肽，例如胰島素、干擾素ct-2、垂體生長激素、白介素-2、GM-CSF和瑞替普酶(Reteplase)。大腸桿菌表達質粒的元件通常是復制起點、選擇標記、以及一個或更多個用于表達目標結構基因的表達盒。表達盒通常包含啟動子、結構基因和轉錄終止子。可選擇組成型或誘導型啟動子作為啟動子。為了優化轉錄，可在5’非翻譯區中包含在mRNA的起始密碼子前面的夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno-Sequence)或其變體。發明內容
在本文中報道了一種多肽原，其可用于在原核細胞中表達目標多肽。因此，所述多肽原融合到目標多肽的N-端。在本文中報道的多肽原提供提高的表達產量，并改善融合多肽的處理(下游加工、純化)。例如，當使包含所述多肽原的目標蛋白例如與親和色譜材料結合時，實現有效的內毒素除去。此后，通過用相關蛋白酶切割摻入的蛋白酶切割位點，可以從目標多肽有效地切掉所述多肽原。
作為一個方面,在本文中報道了一種多肽原,所述多肽原在N端至C端方向包含
-具有氨基酸序列GS的第一個二肽，
-氨基酸序列標簽，
-具有氨基酸序列GS的第二個二肽，其緊鄰
-酶切割位點。
在一個實施方案中，所述多肽原包含前導氨基酸序列，所述前導氨基酸序列在具有氨基酸序列GS的第一個二肽的N-端。在另一個實施方案中，所述前導氨基酸序列具有至少2個氨基酸殘基且最多20個氨基酸殘基的長度。在另一個實施方案中，所述前導氨基酸序列具有至少2個氨基酸殘基且最多10個氨基酸殘基的長度。在另一個實施方案中，所述前導氨基酸序列是具有選自SEQ ID NO :1-8的氨基酸序列的多肽。在另一個實施方案中， 所述前導氨基酸序列是具有選自SEQ ID NO :1-6的氨基酸序列的多肽。
在一個實施方案中，所述多肽原在N端至C端方向由下述元件組成
-前導氨基酸序列，
-具有氨基酸序列GS的第-一個二二肽，
-氨基酸序列標簽，
-具有氨基酸序列GS的第—二個二二肽，其緊鄰
-酶切割位點。
在本文中報道的另一個方面是，一種融合多肽，其在N端至C端方向包含
-任選的前導氨基酸序列，
-具有氨基酸序列GS的第-一個二二肽，
-氨基酸序列標簽，
-具有氨基酸序列GS的第—二個二二肽，其緊鄰
-酶切割位點，和
-目標蛋白。
在前文報道的所有方面的一個實施方案中，所述氨基酸序列標簽具有選自NO :9至SEQ ID NO :27的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述氨基酸序列標簽具有SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :15的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述酶切割位點具有選自SEQ ID NO :28-42的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述目標多肽選自抗體重鏈或輕鏈、抗體片段、單鏈抗體、載脂蛋白、載脂蛋白變體、載脂蛋白融合體、干擾素、白介素、胰島素、組織型纖溶酶原激活物變體、集落刺激因子、生長激素、骨形態發生蛋白。在一個實施方案中，所述目標多肽具有SEQ ID N0:43或SEQ ID NO :44或SEQ ID NO :45的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述目標多肽是不同于在本文中報道的多肽原的多肽，即所述目標多肽不包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列對應于與氨基酸序列標簽直接融合的具有氨基酸序列GS的二肽。在一個實施方案中，在目標多肽的N-端處的氨基酸在下游加工以后具有游離的α-氨基。在一個實施方案中，所述多肽原和/或所述目標多肽沒有被糖基化。
作為另一個方面，在本文中報道了一種用于生產目標多肽的方法，所述方法包括下述步驟
a)提供細胞，所述細胞包含編碼融合多肽的核酸，所述融合多肽在N端至C端方向包含
-任選的前導氨基酸序列，
-第一個二肽GS，
-氨基酸序列標簽，
-第二個二肽GS，其緊鄰
-酶切割位點，和
-目標多肽，
b)培養所述細胞，
c)從所述細胞或培養基回收所述融合多肽，
d)純化所述融合多肽，
e)酶促切割所述融合多肽，并由此生成目標多肽。
在一個實施方案中，所述細胞是原核細胞。在另一個實施方案中，所述細胞是大腸桿菌(E. coli)細胞或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細胞。在一個實施方案中,所述氨基酸序列標簽具有選自SEQ ID NO :9至SEQID NO :27的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述氨基酸序列標簽具有SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :15的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述酶切割位點具有選自SEQ ID NO :28-42的氨基酸序列。在另一個實施方案中，其它多肽選自抗體重鏈或輕鏈、抗體片段、單鏈抗體、載脂蛋白、載脂蛋白變體、載脂蛋白融合體、干擾素、白介素、胰島素、組織型纖溶酶原激活物變體、集落刺激因子、生長激素、 骨形態發生蛋白。在一個實施方案中，所述目標多肽具有SEQ ID N0:43或SEQ ID NO 44 或SEQ ID NO :45的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述目標多肽是不同于在本文中報道的多肽原的多肽，即所述其它多肽不包含與氨基 酸序列標簽直接融合的具有氨基酸序列GS 的二肽。
作為另一個方面，在本文中報道了試劑盒，所述試劑盒包括核酸，所述核酸在5 ’至 3’方向包含
-一種核酸，其編碼具有氨基酸序列GS的二肽，
-一種核酸，其編碼氨基酸序列標簽，
-一種核酸，其編碼具有氨基酸序列GS的二肽，所述核酸緊鄰
-一種核酸，其編碼酶切割位點。
在本文中報道的一個方面是，一種培養原核細胞的方法，其特征在于，
-在培養基中培養所述細胞，所述培養基包含葡萄糖、酵母提取物、L-亮氨酸、 L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、鹽酸硫胺素、消泡劑，
-給所述細胞供給第一補料溶液，所述第一補料溶液包含酵母提取物、甘油、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-脯氨酸，
-給所述細胞供給第二補料溶液，所述第二補料溶液包含L-脯氨酸，
-使用氫氧化鉀溶液和葡萄糖溶液進行pH控制。
在本文中報道的一個方面是，一種生產多肽的方法，其特征在于，
-在培養基中培養細胞，所述細胞包含編碼所述多肽的核酸，所述培養基包含葡萄糖、酵母提取物、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、鹽酸硫胺素、消泡劑，
-給所述細胞首先供給包含酵母提取物、甘油、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-脯氨酸的補料溶液，
-給所述細胞其次供給包含L-脯氨酸的補料溶液，
-使用氫氧化鉀溶液和葡萄糖溶液進行pH控制，
其中從所述細胞或從所述培養基回收所述多肽，并由此生產多肽。
在本文報道的方法的一個實施方案中，在578nm測得約15的光密度時，開始第一補料的加入，在578nm測得約50的光密度時，開始第二補料的加入，且在578nm測得約90 的光密度時，用IPTG誘導所述多肽的表達。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述培養基包含約8. 85g/l葡萄糖、約 63. 5g/l酵母提取物、約2. 2g/l NH4C1、約1.95g/l L-亮氨酸、約2. 9g/l L-脯氨酸、約 O. 75g/l L-甲硫氨酸、約 17. 3g/l KH2P04*3H20、約 2g/l MgS04*7H20、約 25. 8mg/l 鹽酸硫胺素、約1.0ml/110%消泡劑。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述第一補料溶液包含約333g/l酵母提取物、約333g/185% -甘油、約1. 7g/l L-甲硫氨酸和各自約5g/l的L-亮氨酸和L-脯氨酸。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述第二補料溶液包含約600g/l L-脯氨酸。
在本文報道的方法的一個實施方案中，用于pH調節的堿是10% (w/v)K0H溶液，酸是75%葡萄糖溶液。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述培養是在約25°C。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述培養是在約pH6. 5和約pH6. 9之間的 pH。·
在一個實施方案中，所述培養是以約101的體積進行。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述第一補料在70g/h的速率開始。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述第二補料在10ml/h的速率開始。
在本文報道的方法的一個實施方案中，溶解氧值保持在50%以上。在一個具體的實施方案中，通過并行地增加攪拌器速率、通氣率和空氣壓力，保持溶解氧值在50%以上。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述攪拌器速率是約500rpm至約 1500rpmo
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述通氣率是約101/min至約201/min。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述空氣壓力是約300毫巴至約500毫巴。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述原核細胞是大腸桿菌細胞。
在本文報道的方法的一個實施方案中，所述多肽是載脂蛋白Al。在一個具體的實施方案中，所述載脂蛋白Al是四連蛋白-載脂蛋白Al前體蛋白。
在本文中報道的一個方面是，一種原核細胞培養基，其包含約8. 85g/l葡萄糖、 約63. 5g/l酵母提取物、約2. 2g/l NH4C1、約1. 95g/l L-亮氨酸、約2. 9g/l L-脯氨酸、約O.75g/l L-甲硫氨酸、約 17. 3g/l KH2P04*3H20、約 2g/l MgS04*7H20、約 25. 8mg/l 鹽酸硫胺素、約1.0ml/110%消泡劑。
在一個實施方案中，所述培養基另外包含第一補料，所述第一補料包含約333g/l 酵母提取物、約333g/l 85% -甘油、約1. 7g/l L-甲硫氨酸和各自約5g/l的L-亮氨酸和 L-脯氨酸。
在一個實施方案中，所述培養基另外包含第二補料溶液，所述第二補料溶液包含約600g/l L-脯氨酸。
具體實施方式
本文報道的多肽原可用于在原核細胞中表達目標多肽。它提供提高的表達產量， 并改善例如在下游加工和純化過程中的處理。例如，當使包含所述多肽原的目標蛋白例如與親和色譜材料結合時，實現有效的內毒素除去。此后，所述多肽原可以通過摻入的蛋白酶切割位點用相關蛋白酶從目標多肽有效地切掉。
在本文中報道了一種多肽原，所述多肽原在N端至C端方向包含
-任選的前導氨基酸序列，
-第一個二肽GS，
-氨基酸序列標簽，
-第二個二肽GS，其緊鄰
-酶切割位點。
在本申請中使用的術語“氨基酸”或“氨基酸殘基”是指羧基α -氨基酸，其可直接或以前體形式由核酸編碼。由三個核苷酸(所謂的密碼子或堿基三聯體)組成的核酸編碼單個氨基酸。每一個氨基酸由至少一個密碼子編碼。這稱作“遺傳密碼的簡并性”。在本申請中使用的術語“氨基酸”是指天然存在的羧基α -氨基酸，包括丙氨酸(三字母代碼ala， 單字母代碼A)、精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、 谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、組氨酸(his，H)、異亮氨酸(ile，I)、 亮氨酸(leu, L)、賴氨酸(lys, K)、甲硫氨酸(met, Μ)、苯丙氨酸(phe, F)、脯氨酸(pro, P)、 絲氨酸(ser, S)、蘇氨酸(thr, T)、色氨酸(trp, W)、酪氨酸(tyr, Y),和纟顏氨酸(val, V)。
術語“多肽”表示由通過肽鍵連接的氨基酸組成的聚合物，無論是天然地還是合成地生成的。少于約20個氨基酸殘基的多肽可稱為“肽”，而由2個或更多個多肽組成的分子或含有具有100個以上氨基酸殘基的一個多肽的分子可稱為“蛋白質”。術語“ 二肽”表示由2個通過肽鍵彼此相連的氨基酸殘基組成的肽。多肽也可含有非氨基酸組分，例如糖基、金屬離子或羧酸酯。非氨基酸組分可由表達該多肽的細胞添加，并且可隨細胞的類型而變化。在本文中根據多肽的氨基酸主鏈結構或編碼多肽的核酸來定義多肽。通常不指明添加例如糖基，但其可存在。在一個實施方案中，所述目標多肽是載脂蛋白或載脂蛋白變體/ 融合體。在另一個實施方案中，所述載脂蛋白是載脂蛋白Al或載脂蛋白Al變體/融合體。 在另一個實施方案中，所述載脂蛋白Al在N-端與四連蛋白三聚化結構域融合，從而產生人工的四連蛋白-載脂蛋白Al融合多肽。在一個實施方案中，所述目標多肽具有選自SEQ ID NO 43至SEQ ID NO 76的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述目標多肽具有選自SEQ ID NO 43 或 SEQ ID NO 44 或 SEQ ID NO 45 的氨基酸序列。
術語“前導氨基酸序列”表示，通過肽鍵彼此相連的氨基酸或氨基酸殘基的序列。在一個實施方案中，所述前導氨基酸序列由1-20個氨基酸殘基組成。在另一個實施方案中，所述前導氨基酸序列由2-15個氨基酸殘基組成。在另一個實施方案中，所述前導氨基酸序列由4-10個氨基酸殘基組成。在另一個實施方案中，所述前導氨基酸序列具有下述氨基酸序列MR、或 SEQ ID NO :1(KAKRFKKH)、或 SEQ ID NO :2 (AHFWQQA)、或 SEQ ID NO 3 (CDLPQTHSL)、或 SEQ ID NO 4 (IEPD)、或 SEQ ID NO 5 (IEPDSPGT)、或 SEQ ID NO 6(MCDLPQTHSL)、或SEQ ID NO 7 (AEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYD SAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTffSGQYVGGAEARINTQffLLTSGTTEANAffKSTLVGHDTFTKVKPSAA S)、或SEQ ID NO8(TDPEFQQQQQLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDSLAPDWDNMTWQEWEKQVRYLEANI SKSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSffDIRSVV)。在另一個實施方案中，所述前導氨基酸序列具有選自下述的氨基酸序列MR、或SEQ ID N0:1(KAKRFKKH)、 或SEQ ID NO :2 (AHFWQQA)、或SEQ ID NO :3 (CDLPQTHSL)、或SEQ ID NO :4(IEPD)、或SEQ ID NO 5 (IEPDSPGT)、或 SEQ ID NO 6 (MCDLPQTHSL)。
術語“氨基酸序列標簽”表示，具有特異性結合性質的通過肽鍵彼此相連的氨基酸殘基的序列。在一個實施方案中，所述氨基酸序列標簽是親和標簽或純化標簽。在一個實施方案中，所述氨基酸序列標簽選自Arg-標簽、His-標簽、Flag-標簽、3xFlag-標簽、Strep-標簽、Nano-標簽、SBP-標簽、c-myc-標簽、S-標簽、 丐調蛋白-結合肽、纖維素-結合結構域、殼多糖-結合結構域、GST-標簽或MBP-標簽。在另一個實施方案中，所述氨基酸序列標簽選自SEQ ID NO : 9 (RRRRR)、或SEQ ID NO: 10 (RRRRRR)、或 SEQ ID NO : 11 (HHHHHH)、或 SEQ ID NO 12 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK),或 SEQ ID NO :13(DYKDDDDK)、或 SEQ ID NO:14(DYKDHDO)YKDHDIDYKDDDDK)、*SEQ ID NO: 15 (AffRHPQFGG)、或 SEQ ID NO 16 (WSHPQFEK)、或 SEQ ID NO 17 (MDVEAffLGAR)、或 SEQ ID NO18(MDVEAffLGARVPLVET)、或 SEQ ID NO 19 (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQRE P)、或 SEQ ID NO 20 (EQKLISEEDL)、或 SEQ ID NO 21 (KETAAAKFERQHMDS)、或 SEQ ID NO 22(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、或 SEQ ID NO :23 (纖維素結合結構域)、或 SEQ ID NO: 24 (纖維素結合結構域)、或 SEQ ID NO 25 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWE PSNVPALWQLQ)、或 SEQ ID NO 26 (GST-標簽)、或 SEQ ID NO 27 (MBP-標簽)。
術語“酶切割位點”表示，可以被蛋白酶特異性地切 割的通過肽鍵彼此相連的氨基酸殘基的序列。在一個實施方案中，所述蛋白酶是IgA-蛋白酶、顆粒蛋白酶B、Tev蛋白酶、 Prescission蛋白酶、凝血酶、因子Xa或腸激酶。
術語“ IgA-蛋白酶”表示,源自淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的一種蛋白酶，其識別位點包含下述序列之一，其中“ 4”表示切割的鍵的位置
Pro-Ala-Pro 丨 Ser_Pro(SEQIDNO28),
Pro-ProI Ser-Pro(SEQIDNO29),
Pro-ProI Ala-Pro(SEQID NO 30)，
Pro-ProI Thr-Pro(SEQID NO 31)，
Pro-ProI Gly-Pro(SEQID NO 32)，
Pro-Arg--Pro-Pro 丨 Thr_Pro(SEQIDNO33),
Val-Val-Ala-Pro-Pro IAla-Pro(SEQIDNO34),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ISer-Pro(SEQIDNO35)
Val-Val-Ala-Pro-Pro IThr-Pro(SEQIDNO36)
Val-Val-Ala-Pro-Pro IGly-Pro(SEQIDNO37)
Ala-Pro-Pro-Ala 丨 Ala-Pro(SEQIDNO39),
Pro-Arg-Pro-Pro I Ala-Pro(SEQIDNO40).
Pro-Arg-Pro-Pro I Ser-Pro(SEQIDNO41)
Pro-Arg-Pro-Pro I Gly-Pro(SEQIDNO42)
術語“可操作地連接”表示，兩種或多種組分的并列連接，其中所述的組分處于允許它們以它們的預期方式發揮作用的關系中。例如，連接2個多肽編碼區，諸如分泌型前導序列和多肽。
通過本領域已知的重組方法，例如，使用PCR方法和/或通過在便利的限制位點處連接，實現編碼氨基酸序列的核酸的連接。如果便利的限制位點不存在，則根據常規實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
就在原核細胞中重組生產目標多肽而言，除了別的以外，預見到高表達產量和實用的下游加工。
在本文中報道的多肽原可用于表達可操作地連接的目標多肽，所述多肽原在N端至C端方向包含
-第一個二肽GS，
-氨基酸序列標簽，
-第二個二肽GSjP
-酶切割位點。
當在本文中報道的多肽原融合到目標多肽(其意圖通過重組方式在原核細胞中表達)的N-端時，可以產生有利的性質。因而，在本文中報道的多肽原可以用于提高表達產量和下游加工。所述目標多肽被原核細胞表達為融合多肽，所述融合多肽包含在本文中報道的多肽原和所述目標多肽。也就是說，所述融合多肽在N端至C端方向包含本文報道的多肽原和所述目標多肽。
表1:不同的融合多肽的表達產量。使用根據實施例3b的發酵方法，得到在每個格中給出的第一個產量值，使用根據實施例3a的發酵方法，得到在每個格中給出的第二個產量值。
·
權利要求
1.一種多肽原，所述多肽原在N端至C端方向包含-第一個二肽GS，-氨基酸序列標簽，-第二個二肽GS，其緊鄰，-酶切割位點。
2.根據權利要求1所述的多肽原，其特征在于，所述多肽原包含在第一個二肽GS的N-端的長度為至少2個氨基酸殘基的前導氨基酸序列。
3.一種融合多肽，其在N端至C端方向包含-根據權利要求1-2中任一項所述的多肽原，和 -目標多肽。
4.根據權利要求3所述的融合多肽，其特征在于，在根據權利要求1-3中任一項所述的多肽原的N-端處的氨基酸具有游離的α-氨基。
5.根據前述權利要求中任一項所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列標簽具有SEQ ID NO : 11或SEQ ID NO 15的氨基酸序列。
6.根據前述權利要求中任一項所述的多肽，其特征在于，所述酶切割位點具有SEQID NO :33或SEQ ID NO 34的氨基酸序列。
7.根據權利要求2-6中任一項所述的多肽，其特征在于，在第一個二肽GS的N-端的前導氨基酸序列具有選自SEQ ID NO 01-08的氨基酸序列。
8.根據權利要求3-7中任一項所述的融合多肽，其特征在于，所述目標多肽選自抗體重鏈或輕鏈、抗體片段、單鏈抗體、載脂蛋白、載脂蛋白變體、載脂蛋白融合體、干擾素、白介素、胰島素、組織型纖溶酶原激活物變體、集落刺激因子、生長激素或骨形態發生蛋白。
9.根據權利要求3-7中任一項所述的融合多肽，其特征在于，所述目標多肽具有SEQ ID NO 43 或 SEQ ID NO 44 或 SEQ ID NO 45 的氨基酸序列。
10.用于生產目標多肽的方法，所述方法包括下述步驟a)提供細胞，所述細胞包含編碼融合多肽的核酸，所述融合多肽在N端至C端方向包含-第一個二肽GS，-氨基酸序列標簽，-第二個二肽GS，其緊鄰，-酶切割位點，和 -所述目標多肽，b)培養所述細胞，c)從所述細胞或培養基回收所述融合多肽，d)純化所述融合多肽，e)酶促切割所述融合多肽,并由此產生目標多肽。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述融合多肽包含在第一個二肽GS 的N-端的長度為至少2個氨基酸殘基的前導氨基酸序列。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，在第一個二肽GS的N-端的前導氨基酸序列具有選自SEQ ID NO 01~08的氣基酸序列。
13.根據權利要求10-12中任一項所述的方法，其特征在于，所述細胞是原核細胞。
14.根據權利要求10-13中任一項所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列標簽具有 SEQ ID NO : 11或SEQ ID NO 15的氨基酸序列。
15.根據權利要求10-14中任一項所述的方法，其特征在于，所述酶切割位點具有SEQ ID NO :33或SEQ ID NO 34的氨基酸序列。
16.根據權利要求10-15中任一項所述的方法，其特征在于，所述目標多肽選自抗體重鏈或輕鏈、抗體片段、單鏈抗體、載脂蛋白、載脂蛋白變體、載脂蛋白融合體、干擾素、白介素、胰島素、組織型纖溶酶原激活物變體、集落刺激因子、生長激素或骨形態發生蛋白。
17.根據權利要求10-15中任一項所述的方法，其特征在于，所述多肽具有SEQID NO: 43或SEQ ID NO 44或SEQ ID NO 45的氨基酸序列。
18.試劑盒，其包含核酸，所述核酸在5’至3’方向包含-編碼二肽GS的核酸，-編碼氨基酸序列標簽的核酸，-編碼二肽GS的核酸，其緊鄰 -編碼酶切割位點的核酸。
19.一種用于培養原核細胞的方法，其特征在于，-在培養基中培養所述細胞，所述培養基包含葡萄糖、酵母提取物、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、鹽酸硫胺素、消泡劑，-給所述細胞供給第一補料溶液，所述第一補料溶液包含酵母提取物、甘油、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-脯氨酸，-給所述細胞供給第二補料溶液，所述第二補料溶液包含L-脯氨酸，-使用氫氧化鉀溶液和葡萄糖溶液進行PH控制。
20.一種用于生產多肽的方法，其特征在于，-在培養基中培養細胞，所述細胞包含編碼所述多肽的核酸，所述培養基包含葡萄糖、 酵母提取物、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、鹽酸硫胺素、消泡劑，-給所述細胞首先供給包含酵母提取物、甘油、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-脯氨酸的補料溶液，-給所述細胞其次供給包含L-脯氨酸的補料溶液，-使用氫氧化鉀溶液和葡萄糖溶液進行PH控制，其中從所述細胞或從所述培養基回收所述多肽，并由此生產多肽。
21.根據權利要求19-20中任一項所述的方法，其特征在于，在578nm測得約15的光密度時，開始第一補料的加入，在578nm測得約50的光密度時，開始第二補料的加入，且在 578nm測得約90的光密度時，用IPTG誘導所述多肽的表達。
22.根據權利要求19和21中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養基包含約8.85g/l葡萄糖、約63. 5g/l酵母提取物、約2. 2g/l NH4C1、約1. 95g/l L-亮氨酸、約2. 9g/ I L-脯氨酸、約 O. 75g/l L-甲硫氨酸、約 17. 3g/l KH2P04*3H20、約 2g/l MgS04*7H20、約25.8mg/l鹽酸硫胺素、約1. 0ml/110%消泡劑。
23.根據權利要求19-22中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一補料溶液包含 約333g/l酵母提取物、約333g/185% -甘油、約1. 7g/l L-甲硫氨酸和各自約5g/l的L-亮氨酸和L-脯氨酸。
24.根據權利要求19-23中任一項所述的方法，其特征在于，所述第二補料溶液包含約 600g/l L-脯氨酸。
25.根據權利要求19-24中任一項所述的方法，其特征在于，用于pH調節的堿是10% (w/v) KOH溶液，酸是75 %葡萄糖溶液。
26.根據權利要求19-25中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養是在約25°C。
27.根據權利要求19-26中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養是在約pH6.5和約PH6.9之間的pH。
28.根據權利要求19-27中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一補料以70g/h的速率開始。
29.根據權利要求19-28中任一項所述的方法，其特征在于，所述第二補料以10ml/h的速率開始。
30.根據權利要求19-29中任一項所述的方法，其特征在于，溶解氧值保持在50%以上。
31.根據權利要求30所述的方法，其特征在于，通過并行地增加攪拌器速率、通氣率和空氣壓力，保持溶解氧值在50 %以上。
32.根據權利要求19-31中任一項所述的方法，其特征在于，所述攪拌器速率是約 500rpm 至約 1500rpm。
33.根據權利要求19-32中任一項所述的方法，其特征在于，所述通氣率是約101/min 至約 201/min。
34.根據權利要求19-33中任一項所述的方法，其特征在于，所述空氣壓力是約300毫巴至約500毫巴。
35.根據權利要求19-34中任一項所述的方法，其特征在于，所述原核細胞是大腸桿菌 (E. coli)細胞。
36.根據權利要求19-35中任一項所述的方法，其特征在于，所述多肽是載脂蛋白Al。
37.根據權利要求36所述的方法，其特征在于，所述載脂蛋白Al是四連蛋白-載脂蛋白Al前體蛋白。
38.一種原核細胞培養基，其包含約8.85g/l葡萄糖、約63. 5g/l酵母提取物、約2.2g/l NH4C1、約1. 95g/l L-亮氨酸、約2. 9g/l L-脯氨酸、約O. 75g/l L-甲硫氨酸、約17.3g/l KH2P04*3H20、約 2g/l MgS04*7H20、約 25. 8mg/l 鹽酸硫胺素、約1. 0ml/110%消泡劑。
39.根據權利要求38所述的培養基，其特征在于，所述培養基還包含第一補料，所述第一補料包含約333g/l酵母提取物、約333g/185% -甘油、約1. 7g/l L-甲硫氨酸和各自約 5g/l的L-亮氨酸和L-脯氨酸。
40.根據權利要求39所述的培養基，其特征在于，所述培養基還包含第二補料溶液，所述第二補料溶液包含約600g/l L-脯氨酸。
全文摘要
在本文中報道了一種多肽原，其可用于在原核細胞中表達目標多肽。因此，所述多肽原融合到目標多肽的N-端。在本文中報道的多肽原提供提高的表達產量，并改善融合多肽的處理(下游加工、純化)。例如，當使包含所述多肽原的目標蛋白例如與親和色譜材料結合時，實現有效的內毒素除去。此后，多肽原可通過摻入的蛋白酶切割位點用相關蛋白酶從目標多肽有效地切割。
文檔編號C12P21/02GK103025875SQ201180036594
公開日2013年4月3日 申請日期2011年8月25日 優先權日2010年8月30日
發明者阿德爾伯特·格羅斯曼, 弗里德里克·黑塞, 埃哈德·科佩茨基, 維爾馬·勞, 克里斯蒂安·尚茨 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司