專利名稱：綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因、含有該基因的表達載體的構建、該基因在宿主細胞中的蛋白表達。
背景技術：
多聚半乳糖酸酸醇(polygalacturonases, PG)屬于果膠醇(pectolytic enzyme or pectinase)的一種，其在應用上，具有與果膠酶相似的特性。果膠酶是指能夠分解果膠物質的多種酶的總稱，其大致分為果膠水解酶、 果膠裂解酶、果膠酯酶和原果膠酶等，其中果膠水解酶又可分為多聚半乳糖醛酸酶 (polygalacturonases, PG)、多聚半乳糖酸酸甲酉旨/K解酶(polymethylgalacturonases, PMG)、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶等。隨著對果膠及果膠酶研究的日益深入，其應用領域已逐漸拓寬.盡管如此，就果膠酶的高效、多功能特點而言，其應用尚有較大的發展空間。果膠酶的應用性研究1.利用果膠酶降解植物細胞的細胞壁，可用于果蔬汁的生產，果酒的澄清等。2.在油料萃取方面，將果膠酶和纖維素酶、半纖維素酶結合使用，可破壞油料作物的細胞壁，便于油料的釋放，從而提高萃取率、提高油料的穩定性。3.中藥藥材處理方面，可利用果膠酶生產的提取物有銀杏葉提取物、大蒜油濃縮液、蘑菇濃縮液、人參漿、當歸浸膏、甘草液等.另外，在金耳多糖、香菇多糖、金針菇多糖、山楂葉總黃酮等的提取中也使用了果膠酶。利用酶類提取，不僅可提高萃取率，還可提高純度。4.造紙工業中的生物制漿與紡織品的生物脫膠類似，都是通過果膠酶等酶處理降解植物纖維原料中的果膠、半纖維素及木質素，使其分散成滿足造紙工業不同要求的束纖維或單纖維，以生產柔軟、均一、有彈性的高品質材料。5.以果膠為底物生產低聚果膠PG可水解細胞壁中的果膠成分產生聚合度為10左右的寡聚半乳糖醛酸，后者是植物防御反應的誘導因子，防御作用包括產生有抗真菌活性的抗毒素，抑制蛋白合成的抑制劑等等。6.制造保健產品方面酶法降解植物細胞間質中的果膠物質產生完整的單細胞懸液的過程稱為浸解作用。在浸解過程中，一方面設法使內源性果膠酯酶滅活，避免細胞軟化；另一方面，用外源果膠酶適度降解胞外果膠及其它成分，避免胞內物質泄漏，降低品質.該工藝常用于生產帶肉果蔬汁飲料、乳制品的配料、即食的干燥土豆泥、胡蘿卜泥等食品，以及蘆薈、人參、越橘葉、紅花等美容保健品的配料。7. PG可水解幾丁質、幾丁聚糖的B2(l，4)2糖苷鍵，得到水溶性寡糖。這類低分子寡糖具有多方面的生理功能，如抗腫瘤、抗菌、增強免疫機能，改善腸道微生物區系的分布， 刺激有益菌的生長等。多聚半乳糖醛酸酶具有分解果膠的作用，刺吸性昆蟲(如綠盲蝽)損失植物時，主要是唾液腺蛋白中的多聚半乳糖醛酸酶分解植物細胞壁的果膠，造成植物細胞壁的損失， 還能引起植物致病菌的侵染。
在植食性刺吸式昆蟲，是指具有刺吸式器，靠吸食植物汁液為生的昆蟲。一般集中在同翅目和半翅目植食性昆蟲，是糧食作物、蔬菜和觀賞植物的主要害蟲之一。
盲蝽是一類刺吸式害蟲，行動活潑，頗善飛翔。多數類群為植食性，寄主廣泛，包括被子植物、針葉樹和蕨類。除取食植物的葉片外，尤其喜食花、蕾、果實等繁殖器官。世界已知盲蝽近萬種，世界各大動物區均有分布。盲蝽對棉花及牧草苜蓿的危害較嚴重，但同時危害蔬菜。
在美國為害嚴重的盲蝽主要有3種美國牧草盲蝽Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois),豆莢草盲蟲春 Lygus hesperus Knight 及苜猜盲蟲春 Adelphocoris Iineolatus(Goeze)。其中牧草盲蝽和豆莢草盲蝽為同屬，分別廣泛分布于落基山脈的東部和西部。美國牧草盲蝽是北美分布最廣本土盲蝽，為害廣泛，寄主植物達到3 種，其中130 種是重要的經濟作物，包括棉花、苜蓿、樹苗、草莓及番茄等。豆莢草盲蝽是加利福尼亞棉田重要害蟲，主要取食植物上部和端部的果實部分，尤其喜食花芽。苜蓿盲蝽，古北區種，歐亞大陸的外來入侵種，危害美國東部加拿大的牧草等。盡管這3種盲蝽在牧草上只是偶爾會達到很高水平，但當苜蓿被收割后，牧草盲蝽和豆莢草盲蝽會轉移到附近其他蔬菜和水果上危害，給農作物帶來巨大損失)。
近年來，隨著轉Bt基因棉在我國大面積種植，棉鈴蟲得到了有效的控制，但由于減少了棉田化學殺蟲劑的使用，盲蝽上升為主要害蟲，其發生和危害日趨嚴重。中國已記錄的盲蝽約200種左右，實際可能達600種。在我國，盲蝽除為害棉花外，也為害苜蓿及豆科作物等。棉盲蝽主要有綠盲蝽Lygocoris lucorum (Meyre-Dur)、牧草盲蝽 Lygus pratensis (Linnaeus)、中 Il 盲 Adelphocoris suturalis (Jakovlev)、！If 盲蟲春 Adelphocoris Iineolatus(Goeze)等幾種。盲蝽若蟲和成蟲均可危害棉株，以刺吸式口器吸食花，果實，種子汁液，在棉花上形成“破頭瘋”和“破葉瘋”，造成嚴重的經濟損失。
綜上，隨著基因工程技術的迅速發展，對于綠盲蝽PG基因的研究，更多地擴展到分子水平，PG不僅可以應用于傳統的果膠酶應用領域，還可以利用該酶的抑制劑作為對刺吸式害蟲的防治策略，從而達到對目標害蟲的防治。發明內容
本發明公開了一種多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)的核苷酸序列， 以及該序列所編碼的蛋白質的氨基酸序列，在獲得目的基因片段的基礎上，構建了 PG基因的重組表達載體，并將其分別轉化至大腸桿菌、畢赤酵母宿主細胞中表達PG蛋白，將表達出的PG蛋白純化后應用于食品領域、造紙工業等領域。
本發明的一方面在于一種綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :10 或 SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO 12 所示。
本發明的另一方面在于上述的綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因所編碼的蛋白質， 其氨基酸序列依次為SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 14或SEQ ID NO 15所示。
本發明的另一方面在于攜帶上述綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的重組表達載體。
具體的，上述表達載體為原核表達載體或者真核表達載體。具體的，上述的原核表達載體為大腸桿菌表達載體pET48a(+)。具體的，上述的真核表達載體為畢赤酵母表達載體PPIC9。本發明的另一方面在于由上述表達載體所轉化得到的重組菌株。本發明的另一方面在于一種利用權利要求7所述重組菌株制備綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括如下步驟設計引物擴增上述綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因；構建含有上述綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的表達質粒；培養用該質粒所轉化的宿主細胞，經過篩選得到菌株；培養菌株，誘導蛋白表達；分離并純化所表達的蛋白。本發明的另一方面在于上述方法制備的綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶蛋白在食品領域、造紙工業領域的應用。本發明的下述具體實施例部分，公開了本發明技術方案的完整的實施過程首先提取綠盲蝽總RNA，根據該酶的保守序列設計引物，利用RT-PCR方法擴增獲得3個PG的同源基因序列，再利用RACE實驗，獲得5'和3'的未知序列。最后利用大腸桿菌表達系統和畢赤酵母表達系統分別進行了該酶的重組表達、純化及性質分析。有益效果本發明首先解決了綠盲蝽的多聚半乳糖醛酸酶的基因序列獲取問題，還首例解決了昆蟲來源多聚半乳糖醛酸酶的重組表達問題。所獲得的重組菌株能大量表達多聚半乳糖醛酸酶，其在食品(果汁榨取)、油料萃取、中藥藥材處理、造紙工業及低聚果膠保健產品等方面有良好應用前景。另外，針對該酶的抑制劑還可作為對刺吸式害蟲的防治策略，從而達到對目標害蟲的防治。


圖 1 綠盲蝽total RNA 的瓊脂糖凝膠電泳，其中，M :DL2, 000DNA Marker, 1 :total RNA0圖2 =Total RNA的掃描結果。圖3 瓊脂糖凝膠電泳，其中:M :DL2, OOODNAMarker, 1 利用引物Fl和Rl擴增的 PCR產物，2 利用引物F2和R2擴增的PCR產物。圖4 瓊脂糖凝膠電泳，其中:Lane M :DL2，000DNA Marker ；Lane 1 5'未知序列的 PCR 產物；Lane 2 =M-MLV (-)對照。圖5 瓊脂糖凝膠電泳，其中LaneM :DL2，OOODNAMarker ；Lane 1 3'未知序列的 PCR 產物；Lane 2 =M-MLV (-)對照。圖6 瓊脂糖凝膠電泳，其中:Lane M :DL2，000DNA Marker ；Lane 1 利用引物 PGl-F和PGl-R擴增的PG-I的PCR產物；Lane 2 利用引物PG2-1-F和PG2-1-R擴增的 PG2-1的PCR產物；Lane 3 利用引物PG2-2-F和PG2-2-R擴增的PG2-2的PCR產物。SEQ ID NO :1是根據多聚半乳糖醛酸酶的同源序列設計引物Fl和R1，以綠盲蝽全 RNA為模板，通過RT-PCR反應得到綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PGl的保守核苷酸序列。序列長為739bp。SEQ ID NO :2是根據多聚半乳糖醛酸酶的同源序列設計引物F2和R2，以綠盲蝽全RNA為模板，通過RT-PCR反應得到綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2中的一個亞型(命名為PG2-1)的保守核苷酸序列。序列長為578bp。
SEQ ID NO :3是根據多聚半乳糖醛酸酶的同源序列設計引物F2和R2，以綠盲蝽全 RNA為模板，通過RT-PCR反應得到綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2中的另一個亞型(命名為 PG2-2)的保守核苷酸序列。序列長為486bp。
SEQ ID NO :4 是通過 5 ‘ -Full RACE 實驗，禾丨J 用弓丨物 5，RACE-PG1-R1 和 5，RACE-PGl-R2擴增的PGl的5'未知核苷酸序列。序列長為222bp，第40，41，42的ATG 為起始密碼子。
SEQ ID NO :5 是通過 3 ‘ -Full RACE 實驗，利用弓丨物 3，RACE-PGI-Fl 和 3，RACE-PG1-F2擴增的PGl的3'未知核苷酸序列。序列長為180bp，第129，130，131的 TGA為終止密碼子。
SEQ ID NO :6 是通過 5 ‘ -Full RACE 實驗，利用引物 5，RACE-PG2-1-R1 和 5，RACE-PG2-1-R2擴增的PG2-1的5'未知核苷酸序列。序列長為354bp，第43，44，45的 ATG為起始密碼子。
SEQ ID NO :7 是通過 3 ‘ -Full RACE 實驗，利用引物 3，RACE-PG2-1-F1 和 3，RACE-PG2-1-F2擴增的PG2-1的3'未知核苷酸序列。序列長為497bp，第440，441，442 的TAA為終止密碼子。
SEQ ID NO :8 是通過 5 ‘ -Full RACE 實驗，利用引物 5，RACE-PG2-2-R1 和 5，RACE-PG2-2-R2擴增的PG2-2的5'未知核苷酸序列。序列長為207bp，第38,39,40的 ATG為起始密碼子。
SEQ ID NO :9 是通過 3 ‘ -Full RACE 實驗，利用引物 3，RACE-PG2-2-F1 和 3，RACE-PG2-2-2擴增的PG2-2的3'未知核苷酸序列。序列長為481bp，第440，441，442 的TAA為終止密碼子。
SEQ ID NO 10是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PGl的核苷酸序列。序列長為105;3bp， 第01，02，03的ATG為起始密碼子，第1051，1052，1053的TGA為終止密碼子。
SEQ ID NO :11是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2-1的核苷酸序列。序列長為 1098bp，第01，02，03的ATG為起始密碼子，第1096，1097，1098的TAA為終止密碼子。
SEQ ID NO :12是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2-2的核苷酸序列。序列長為 llOlbp，第01，02，03的ATG為起始密碼子，第1099，1100，1101的TAA為終止密碼子。
SEQ ID NO 13是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PGl的氨基酸序列。共350個氨基酸殘基。
SEQ ID NO 14是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2-1的氨基酸序列。共365個氨基酸殘基。
SEQ ID NO 15是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2-2的氨基酸序列。共366個氨基酸殘基。
具體實施方式
下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
綠盲蝽Lygocoris Iucorum(Meyre-Dur)，由中國農業科學院植物保護研究所贈與。下述實施例中涉及到使用試劑盒的實驗操作，均按照試劑盒說明書進行操作。實施例1綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的獲得一、綠盲蝽的total RNA提取使用RNAiso plus (大連寶生物公司，Code No. D9108A)對綠盲蝽進行總RNA提取， 獲得綠盲蝽的總RNA。取Iul上述綠盲蝽總RNA進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1 Lane M :DL2, OOODNAMarker，其由 DNA 片段，共 6 條帶2，OOObpU, OOObp、750bp、 500bp、250bp 以及 IOObp 組成。Lane 1 綠盲蝽 total RNA,其 ^S rRNA 分子量接近于 DL2, 000DNA Marker 的第 2 條帶(IOOObp)，且亮度較高，18S rRNA分子量接近于DL2，OOODNAMarker第5條帶(250bp)， 且^S的亮度接近于18S的1. 5倍。結論電泳條帶正常。綠盲蝽總RNA的OD測定及掃描取2ul綠盲蝽總RNA，使用NanoDrop-1000進行OD測定及掃描，OD測定結果如表
1 表1. OD測定結果
權利要求
1.綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQID N0:10或 SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO 12 所示。
2.權利要求1所述的綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因所編碼的蛋白質，其氨基酸序列依次為 SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO 14 或 SEQ ID NO 15 所示。
3.含有權利要求1所述的綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的重組表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于其為原核表達載體或者真核表達載體。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于原核表達載體為大腸桿菌表達載體 pET-28a(+)ο
6.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于真核表達載體為畢赤酵母表達載體 pPIC9。
7.由權利要求5或6所述的表達載體所轉化得到的重組菌株。
8.一種利用權利要求7所述重組菌株制備綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括如下步驟設計引物擴增上述綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因；構建含有上述綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的表達質粒；培養用該質粒所轉化的宿主細胞，經過篩選得到菌株；培養菌株， 誘導蛋白表達；分離并純化所表達的蛋白。
9.權利要求2所述的綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶蛋白在食品領域、造紙工業領域的應用。
全文摘要
本發明公開一種綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶(PG)的基因序列和一種制備該酶的方法。首先提取綠盲蝽總RNA，根據該酶的保守序列設計引物，利用RT-PCR方法擴增獲得3個PG的同源基因序列，再利用RACE實驗，獲得5′和3′的未知序列。最后利用大腸桿菌表達系統和畢赤酵母表達系統分別進行了該酶的重組表達、純化及性質分析。本發明首先解決了綠盲蝽的多聚半乳糖醛酸酶的基因序列獲取問題，還首例解決了昆蟲來源多聚半乳糖醛酸酶的重組表達問題。在食品(果汁榨取)、油料萃取、中藥藥材處理、造紙工業及低聚果膠保健產品等方面有應用前景。另外，針對該酶的抑制劑還可作為對刺吸式害蟲的防治策略，從而達到對目標害蟲的防治。
文檔編號C12R1/19GK102492706SQ20111040705
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者劉田, 姜秀萍, 楊君, 楊青, 賈秋磊 申請人:大連理工大學