專利名稱：一種蜂王漿多肽的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，特別涉及一種蜂王漿多肽的制備方法。
背景技術：
近年來，隨著人類平均壽命的增加，老年人口的比例不斷上升，我國人口老齡化日趨明顯，阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease,AD)作為老年期癡呆最常見的類型，已經引起全社會的廣泛關注。阿爾茨海默病是一種以記憶力下降和認知功能障礙為特征的復雜的多因素慢性進行性精神衰退疾病，臨床表現為進行性記憶和認知能力減退、語言障礙、精神運動異常等癥狀。患者早期以近記憶下降為主，疾病后期遠記憶也受累及，日常生活受到影響，表現為學習新知識困難，工作主動性下降，承擔新任務無法勝任，并隨時間推移而加重， 伴有語言障礙、計算障礙，視空間障礙，喪失日常技能，失去認知能力等。阿爾茨海默病發病隱匿，進行性加重，會給患者及其家人帶來巨大的痛苦，嚴重阻礙著社會經濟的健康穩定發展。如今，阿爾茨海默病已成為繼心臟病、腫瘤和中風之后的第四大殺手，國際國內針對阿爾茨海默病的治療還沒有特效藥物，且其綜合治療療程長、顯效慢。國際國內學者對阿爾茨海默病的研究結果表明，阿爾茨海默病發病機制非常復雜，其確切病機目前尚不清楚，同大多數其他長期性疾病一樣，阿爾茨海默病是由多因素導致的，由此形成了多種假說。但眾多的研究證明，Αβ級聯假說是目前阿爾茨海默病發病機理的主流學說，該假說指出Aβ的過度積累是AD發病的基礎，而Αβ產生與清除的失衡是導致其過度累積的原因。蜂王漿(Royal Jelly,RJ)又名蜂皇漿，俗稱蜂王乳，是6-18日齡青年工蜂的下咽頭腺和上顎腺等腺體所分泌的特殊物質。蜂王漿呈乳白色或淡黃色，半透明，微黏稠，有特殊香味，味酸、澀、辛、微甜，主要為蜂王的終身食物及工蜂幼蟲孵化后的前三天食物，具有免疫調節、抗菌、抗炎、抗腫瘤、調節血壓、降低血糖和促進細胞生長等功能。研究發現，蜂王漿對包括阿爾茨海默病在內的神經性疾病有良好的改善作用，蜂王漿中的某些物質具有提高神經系統的傳遞功能、增強對大腦的營養功能、增加特定神經營養因子的表達量、促進大腦細胞的神經生長、促進大腦中神經干細胞向神經元、星狀細胞和膠質細胞的分化，改善小鼠的認知功能障礙，提高大鼠的學習記憶指數等作用。因此，蜂王漿能夠成為改善阿爾茨海默病等神經性障礙疾病的發生和發展的潛在藥物來源。我國是世界上最大的蜂王漿生產國，產量占世界的90%以上，但其多以原料性的產品出口，缺乏深加工產品，從而導致產品價格較低，所獲利潤較少，因此，對蜂王漿進行深加工，可以有效提高我國蜂王漿的品質，增加出口創匯。新鮮蜂王漿含有多種生物活性物質，但貯存不當極易發生腐爛變質，失去原有的生物活性和營養價值。研究表明，蜂王漿的變質主要是其所含的蛋白質發生變化，從而導致一系列的化學反應促使其變質，因此蜂王漿中的蛋白質對蜂王漿發揮整體功效起著極其關鍵的作用。蜂王漿中所含的蛋白質對溫度十分敏感，在貯存過程中部分蛋白質易發生降解， 并且在不同的溫度條件下，不同蛋白質的降解速率不一樣。貯存溫度越高、時間越長，蜂王漿越容易發生美拉德反應(Maillard reaction)，變性速率越快。目前有研究發現，在蜂王漿的保健功效中起著舉足輕重作用的水溶性蛋白質，降解產物會發生聚合，從而使水不溶性蛋白增加。研究者發現，通過酶水解得到的蜂王漿多肽不但存儲要求降低，而且酶解后的蛋白質具有不易變質，更利于體內的代謝吸收，所含成分具有更理想的藥理功能，更有助于闡明蜂王漿的作用機制。但迄今為止，對蜂王漿酶解后多肽的研究較少，且酶解的方法大多數通過胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等外源酶來進行，不適合蜂王漿蛋白的水解，較難篩選得到對人體真正有效的生物活性多肽。

發明內容
有鑒于此，本發明提供一種蜂王漿多肽及其用途。該蜂王漿多肽通過從蜂王幼蟲體內提取腸道酶，模擬蜂王體內酶解環境對蜂王漿進行酶解，得到的蜂王漿多肽生物活性更好，能夠用于制備A β抑制劑。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案一種蜂王漿多肽的制備方法，包括步驟1:將2 3日齡的蜂王幼蟲，用0.9%的生理鹽水洗滌后，取出所述蜂王幼蟲的腸道，加入PH值為7. 0 7. 2的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液研磨成勻漿， 在18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，收集第一次離心后的中層液體，然后在 18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，收集第二次離心后的中層液體，得到腸道酶液；步驟2 在蜂王漿中，加入pH值為7. 0 7. 2的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液，在18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，(除去不溶性成分)收集上清液，經截留分子量為8000 14000的透析袋在pH值為7. 0 7. 2的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液中冰浴透析42 72h，(每隔1 更換一次透析液)收集透析袋中透析液，得到水溶性蜂王漿蛋白液；步驟3 以mg/mL計，將步驟1所得的腸道酶液與步驟2所得的水溶性蜂王漿蛋白液按照蛋白濃度比為30 35 80 90混合，在pH值為8. 3 8. 7，溫度為；34 39°C的條件下酶解22 ^h，得到水溶性蜂王漿蛋白酶解液；步驟4:將步驟3所述的水溶性蜂王漿蛋白酶解液冰浴停止酶解反應后，在 8000 15000g，4°C條件下離心10 20min，收集上清液，用10 μ m微孔濾膜過濾后，收集濾液得到第一濾液，將所述第一濾液經3kDa的超濾膜過濾，收集濾液得到第二濾液，將所述第二濾液經IkDa的超濾膜過濾，收集截留物得到1 3kDa的蜂王漿多肽。作為優選，步驟1或步驟2中磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液的濃度為 50mmol/L。作為優選，步驟1中所述蜂王幼蟲的腸道與磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液的質量體積比以g/mL計為1 1 1 2。作為優選，步驟1中，勻漿或第一懸浮液的中層液體在20000g的條件下離心。作為優選，步驟1中，勻漿或第一懸浮液的中層液體離心20min。作為優選，步驟2中磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液與所述蜂王漿的體積比為 2 1 4 1。
作為優選，步驟2中，離心力在20000g的條件下離心20min。作為優選，步驟2中，透析時間為48h。作為優選，以mg/mL計，步驟3中，所述腸道酶液與所述水溶性蜂王漿蛋白液的蛋白濃度比為32. 5 85。優選地，步驟3中，所述腸道酶液的蛋白濃度為20 35mg/mL，所述水溶性蜂王漿蛋白液的蛋白濃度為25 45mg/mL，所述腸道酶液和所述水溶性蜂王漿蛋白液的質量比為 1 2. 3 3. 0。作為優選，步驟3中酶解溫度為37°C。作為優選，步驟3中酶解pH值為8. 5。作為優選，步驟3中酶解時間為Mh。作為優選，步驟4中，離心條件為在10000g，4°C條件下離心lOmin。本發明提供一種蜂王漿多肽的制備方法。該方法通過從蜂王幼蟲體內提取腸道酶對蜂王漿進行酶解得到，能夠模擬蜂王體內酶解環境，得到生物活性更好的蜂王漿多肽，能夠用于制備Aβ抑制劑。試驗表明，1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽能有效抑制25 μ M A β 25_35對SH-SY5Y細胞的毒性作用，對Αβ Μ_35導致的SH-SY5Y細胞損傷有明顯的保護作用(P < 0. 01)。與六^5_35模型組相比，三種不同濃度的1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽均能使細胞培養液中的LDH釋放量顯著減少(P < 0. 01)，且隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，LDH釋放量逐漸減少，表現出顯著的濃度依賴性關系。與Αβ25_35模型組相比，本組實驗中92μ g/ml 的1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽能最大程度地抑制LDH的釋放，抑制率在66%左右。25μΜ的Αβ2Μ5與不同濃度的1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h后， SH-SY5Y細胞的總體凋亡率有所下降，且隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率逐漸減小，呈一定的濃度依賴性關系。當蜂王漿蛋白多肽濃度為92μ g/ml時，早期凋亡率和晚期凋亡率從26. 39士2. 下降到6. 97士 1. 01% (P < 0. 001)，接近空白對照組的水平。由此說明，1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽對A β 2M5誘導的SH-SY5Y細胞凋亡有一定的抑制作用。25 μ M的Αβ 與不同濃度的1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽共同處理SH-SY5Y細胞24h后，ROS的產生量均有下降，且隨著各自濃度的增加，ROS的產生量呈先降低后增加的趨勢。對于1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽處理組，46 μ g/ml的劑量可以使ROS的產生量降到最低，從19. 99士O. 59降低到14. 06士O. 34(P <0. 001)。表明1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽能夠阻止Αβ2Μ5誘導的SH-SY5Y細胞內活性氧自由基(ROS)的產生。劑量濃度在一定范圍內時，隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，ROS生成量呈減小的趨勢；當蜂王漿蛋白多肽濃度繼續增大時，ROS生成量又逐漸上升。25 μ M的A β 25_35與不同濃度的1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h均能降低Bax/Bcl-2的值，且劑量濃度在11. 5 92 μ g/ml之間時，隨著濃度的增加有逐漸減小的趨勢，呈一定的劑量依賴性；濃度為46 μ g/ml時，減少到最低水平，為control組的 0.65士0.05倍(P <0.001)。當濃度為92 μ g/ml時，Bax/Bcl-2的值又有輕微增加的趨勢。 1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽使Bax/Bcl-2值降低的原因主要為蜂王漿蛋白多肽能顯著的抑制Αβ 25_35誘導SH-SY5Y細胞內Bax表達量的升高。
綜合上述試驗結果，本發明提供的1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽的制備方法對 Αβ 誘導SH-SY5Y細胞具有抑制活性，因此制得的1 3kDa的蜂王漿蛋白多肽可以用于制備A β抑制劑，及制備治療阿爾茨海默病相關藥物。


圖1示本發明制得的腸道酶液和水溶性蜂王漿蛋白液的SDS-PAGE電泳圖，其中， 泳道1和泳道2為腸道酶液，泳道3和泳道4為水溶性蜂王漿蛋白液，泳道5為marker。圖2示酶解時間對酶解效果的影響，其中，泳道1為水溶性蜂王漿蛋白液，泳道2 至 9 分別為酶解時間 2h、4h、6h、8h、10h、15h、20h、25hJ}dt 10 為 marker。圖3示圖2內泳道1至9各條帶峰面積。圖4示酶解pH值對酶解效果的影響，其中，泳道1為水溶性蜂王漿蛋白液，泳道2 至 7 分別為 pH 值 5、6、6. 5、7、7. 5、8，泳道 8 為 marker。圖5示圖4內泳道1至7各條帶峰面積。圖6示酶解液中蛋白隨pH值變化情況，其中，泳道1為水溶性蜂王漿蛋白液，泳道 2為本發明提供的腸道酶液，泳道3至7為由水溶性蜂王漿蛋白液和腸道酶液分別在pH值為8、8. 1,8. 3,8. 5,8. 7的條件下酶解后酶解液，泳道8為marker。 圖7示圖6內泳道1至7各條帶峰面積。圖8示本發明提供的腸道酶液與水溶性蜂王漿蛋白液的最佳配比，其中，泳道1、8 均為本發明提供的腸道酶液，泳道2、9為水溶性蜂王漿蛋白液，泳道3至6分別為腸道酶液與水溶性蜂王漿蛋白液體積比例是1 1、1 2、1 3、1 4，泳道10至13分別為腸道酶液與水溶性蜂王漿蛋白液體積比例是1 5、1 6、1 7、1 8，泳道7、14均為marker。圖9示在最佳酶解條件下，酶解反應前后對比圖，其中，反應體系總體積為10mL， 泳道1至8為反應前圖譜，泳道10至17為反應后圖譜；泳道1、10分別含0. 5mL腸道酶液與0. 5mL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道2、11分別含0. 5mL腸道酶液與ImL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道3、12分別含ImL腸道酶液與ImL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道4、13分別含ImL腸道酶液與2mL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道5、14分別含1. 5mL腸道酶液與1. 5mL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道6、15分別含1. 5mL腸道酶液與3mL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道7、16分別含 2mL腸道酶液與2mL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道8、17分別含2mL腸道酶液與4mL水溶性蜂王漿蛋白液泳道9、18均為marker。圖10示1 3kDa的蜂王漿多肽液相分析色譜圖，其中，實線為^Onm下的色譜圖， 虛線為214nm下的色譜圖。圖11示1 3kDa的蜂王漿多肽對Aβ 2M5誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用，其中，圖 11(a)為 Control 組，圖 11(b) % 25ymol/L ΑβΜ_35 組，圖 11(c) % 25ymol/ LA β 25_35+9· 2 μ g/mL 蜂王漿多肽組，圖 11 (d)為 25 μ mol/LA β 25_35+23 μ g/mL 蜂王漿多肽組，圖 11 (e)為 25 μ mol/L A β 25_35+46 μ g/mL 蜂王漿多肽組，圖 11 (f)為 25 μ mol/ LA β 25_35+92 μ g/mL蜂王漿多肽組。圖12示1 3kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的抑制作用， 其中，縱坐標為細胞活性(以control組為100% )，橫坐標為A β 和蜂王漿多肽的添加量，第一柱形為control組，第二柱形為A β 25_35模型組，第三至第六柱形為蜂王漿多肽處理組；第二柱形和第一柱形具有極顯著差異(P < 0.001)，第三至第六柱形與第二柱形間具有極顯著差異(P <0.01)。圖13示1 3kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導的SH-SY5Y細胞LDH釋放量的影響。圖14示Armexin V/PI雙染法檢測1 3kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導的 SH-SY5Y細胞的影響，其中，圖14(a)為control組，圖14(b)為Αβ模型組，圖14(c)為 A β+23 μ g/mL 1 3kDa的蜂王漿多肽，圖14 (d)為A β +46 μ g/mL 1 3kDa的蜂王漿多肽，圖14 (e)為A β +92 μ g/mL 1 3kDa的蜂王漿多肽。圖15示Armexin V/PI雙染法檢測1 3kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導的 SH-SY5Y細胞的影響結果總結。圖16示1 3kDa的蜂王漿多肽對活性氧自由基的影響。圖17示western blotting檢測1 3kDa的蜂王漿多肽對SH-SY5Y細胞內Bax 和Bcl-2蛋白表達水平的影響。圖18示1 3kDa的蜂王漿多肽對SH-SY5Y細胞內Bax/Bcl_2比值的影響，其中， 斜線柱形代表Bax/Bcl-2的值，白色柱形代表Bax的表達量，黑色柱形代表Bcl_2的表達
Mo
具體實施例方式本發明公開了一種蜂王漿多肽的制備方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容， 適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供的蜂王漿多肽中各項試劑均可由市場購得。蜂王漿和蜂王幼蟲均購自北京市門頭溝區軍莊鎮孟悟村養蜂專業戶，經50次試驗表明，蜂王漿中蛋白含量無顯著差異，從蜂王幼蟲體內提取的腸道酶的蛋白含量也無顯著差異。SH-SY5Y細胞(北京師范大學資源學院資源生態與中藥資源研究所細胞庫)。Prestained Protein Ladder (美國 Fermentas)，D-MEM/F12培養基(美國Gibco公司)、胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)、 胰酶(美國R&D)、青霉素/鏈霉素(美國Gibco公司)，A β 25_35(純度98. 4 %，杭州中肽生化有限公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(ΜΤΤ，美國Amresco公司)，Cellstar細胞培養板(德國Greiner公司)，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Armexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術有限公司)， 2，，7，-二氯熒光素雙乙酸鹽(DCFH-DA，美國 Sigma 公司)，Polyvinylidene Fluoride Membrane (PVDF膜)(美國Roche)，小鼠抗人Bcl_2多抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、小鼠抗人β -actin多克隆抗體、HRP標記羊抗小鼠IgG多克隆抗體、HRP標記小鼠抗兔IgG多克隆抗體、ECL顯色試劑(Santa Cruz公司)，其他試劑為國產分析純。下面結合實施例，進一步闡述本發明實施例1取新鮮2 3日齡的蜂王幼蟲，用等滲的冰冷的0. 9%生理鹽水洗滌干凈后過濾，逐個解剖并收集蟲體的全部腸道。加入與蟲體腸道質量體積比(g/mL)為1 1的pH值為7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋之后，用電動勻漿器在冰浴條件下研磨成勻漿。在 20000 Xg,4°C下離心20min，離心后懸浮液分為三層，即漂浮物上層(脂類成分)、懸浮溶液中層、沉淀下層，回收中層。將中層再次在20000Xg，4°C下離心20min，取中層由此得到黃色透明的腸道酶液，保存在-20°C冰箱中。取部分腸道酶液，用BCA法檢測蛋白濃度，得腸道酶液的蛋白濃度為31. 9mg/mL。 SDS-PAGE電泳檢測結果，見圖1。將1倍體積的蜂王漿與2倍體積的pH值為7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液混合，制備蜂王漿稀釋溶液。將上述蜂王漿稀釋溶液在20000Xg，4°C下離心20min，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH值為7的50mmol/L 的磷酸鹽緩沖液中冰浴下透析48h，每隔1 更換一次透析液。取透析袋中液體，即為高純度的水溶性蜂王漿蛋白，保存在-20°C冰箱中。取部分水溶性蜂王漿蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，得水溶性蜂王漿蛋白的蛋白濃度為42. 7mg/mL。SDS-PAGE電泳檢測結果，見圖1。腸道酶與蜂王漿酶解條件的確定對酶解的PH值、酶解時間進行摸索，結果見圖2 至圖9。確定最佳酶解條件為在pH值為8. 3 8. 7，溫度為34 39°C的條件下酶解22 26h。按照IOmL反應體系中添加4mL蛋白濃度為42. 7mg/mL的水溶性蜂王漿蛋白、2mL 蛋白濃度為31. 9mg/mL的腸道酶液和4mL緩沖液的比例關系，配制2000mL的反應體系。并將體系的PH值調整到8. 5，37°C下經行Mh的反應。反應24h后，冰浴、停止反應。反應液在10000 X g，4°C下離心lOmin，除去不溶性成分，得到1900mL上清液。用10 μ m微孔濾膜過濾，收集濾液，再依次用分子量大小為3kDa和IkDa的膜過濾系統過濾，得到200mL l-3kDa 的濾液。將濾液冷凍干燥，再用蒸餾水溶解，0. 22 μ m的薄膜過濾，得到酶解后l_3kDa的蜂王漿多肽。經BCA方法檢測后，得到酶解后蜂王漿蛋白多肽的蛋白濃度為2. 30mg/mL。實施例2取新鮮2 3日齡的蜂王幼蟲，用等滲的冰冷的0. 9%生理鹽水洗滌干凈后過濾， 逐個解剖并收集蟲體的全部腸道。加入與蟲體腸道質量體積比(g/mL)為1 1的pH值為 7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液之后，用電動勻漿器在冰浴條件下研磨成勻漿。在18000 X g， 4°C下離心30min，離心后懸浮液分為三層，即漂浮物上層(脂類成分)、懸浮溶液中層、沉淀下層，回收中層。將中層再次在18000Xg，4°C下離心30min，取中層由此得到黃色透明的腸道酶液，保存在-20°C冰箱中。取部分腸道酶液，用BCA法檢測蛋白濃度，得腸道酶液的蛋白濃度為35mg/mL。將1倍體積的蜂王漿與4倍體積的pH = 7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液混合，制備蜂王漿稀釋溶液。將上述蜂王漿稀釋溶液在18000Xg，4°C下離心30min，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH值為7的50mmol/L 的磷酸鹽緩沖液中冰浴下透析42h，每隔1 更換一次透析液。取透析袋中液體，即為高純度的水溶性蜂王漿蛋白，保存在-20°C冰箱中。取部分水溶性蜂王漿蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，得水溶性蜂王漿蛋白的蛋白濃度為26. 8mg/mL。腸道酶與蜂王漿酶解條件的確定對酶解的PH值、酶解時間進行摸索，結果見圖2 至圖9。確定最佳酶解條件為在pH值為8. 3 8. 7，溫度為34 39°C的條件下酶解22 26h。按照IOmL反應體系中添加6mL蛋白濃度為26. 8mg/mL的水溶性蜂王漿蛋白、2mL 蛋白濃度為35mg/mL的腸道酶液和2mL緩沖液的比例關系，配制2000mL的反應體系。并將體系的PH值調整到8. 3，39°C下經行^h的反應。反應2 后，冰浴、停止反應。反應液在 8000父8，41下離心201^11，除去不溶性成分，得到1860mL上清液。用IOym微孔濾膜過濾， 收集濾液，再依次用分子量大小為3kDa和IkDa的膜過濾系統過濾，得到180mL l-3kDa的濾液。將濾液冷凍干燥，再用蒸餾水溶解，0. 22 μ m的薄膜過濾，得到酶解后l_3kDa的蜂王漿多肽。經BCA方法檢測后，得到酶解后蜂王漿蛋白多肽的蛋白濃度為2. 10mg/mL。實施例3取新鮮2 3日齡的蜂王幼蟲，用等滲的冰冷的0. 9%生理鹽水洗滌干凈后過濾， 逐個解剖并收集蟲體的全部腸道。加入與蟲體腸道質量體積比(g/mL)為1 1.5的pH值為7. 2的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋之后，用電動勻漿器在冰浴條件下研磨成勻漿。在 25000 Xg,4°C下離心2%iin，離心后懸浮液分為三層，即漂浮物上層(脂類成分)、懸浮溶液中層、沉淀下層，回收中層。將中層再次在25000Xg，4°C下離心2%iin，取中層由此得到黃色透明的腸道酶液，保存在-20°C冰箱中。取部分腸道酶液，用BCA法檢測蛋白濃度，得腸道酶液的蛋白濃度為25. 5mg/mL。將1倍體積的蜂王漿與3倍體積的pH = 7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液混合，制備蜂王漿稀釋溶液。將上述蜂王漿稀釋溶液在25000Xg，4°C下離心2%iin，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH = 7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液中冰浴下透析72h，每隔1 更換一次透析液。取透析袋中液體，即為高純度的水溶性蜂王漿蛋白，保存在-20°C冰箱中。取部分水溶性蜂王漿蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，得水溶性蜂王漿蛋白的蛋白濃度為32. 5mg/mL。腸道酶與蜂王漿酶解條件的確定對酶解的PH值、酶解時間進行摸索，結果見圖2 至圖9。確定最佳酶解條件為在pH值為8. 3 8. 7，溫度為34 39°C的條件下酶解22 26h。按照IOmL反應體系中添加4mL蛋白濃度為32. 5mg/mL的水溶性蜂王漿蛋白、
1.7mL蛋白濃度為25. 5mg/mL的腸道酶液和4. 3mL緩沖液的比例關系，配制2000mL的反應體系。并將體系的PH值調整到8.7，34°C下經行22h的反應。反應2 后，冰浴、停止反應。反應液在15000Xg，4°C下離心Hmin，除去不溶性成分，得到1930mL上清液。用10 μ m 微孔濾膜過濾，收集濾液，再依次用分子量大小為3kDa和IkDa的膜過濾系統過濾，得到 220mL l_3kDa的濾液。將濾液冷凍干燥，再用蒸餾水溶解，0. 22 μ m的薄膜過濾，得到酶解后l_3kDa的蜂王漿多肽。經BCA方法檢測后，得到酶解后蜂王漿蛋白多肽的蛋白濃度為
2.56mg/mL。實施例4取新鮮2 3日齡的蜂王幼蟲，用等滲的冰冷的0. 9%生理鹽水洗滌干凈后過濾， 逐個解剖并收集蟲體的全部腸道。加入與蟲體腸道質量體積比(g/mL)為1 2的pH值為7. 2的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋之后，用電動勻漿器在冰浴條件下研磨成勻漿。在 25000Xg，4°C下離心Mmin，離心后懸浮液分為三層，即漂浮物上層(脂類成分)、懸浮溶液中層、沉淀下層，回收中層。將中層再次在25000Xg，4°C下離心2%iin，取中層由此得到黃色透明的腸道酶液，保存在-20°C冰箱中。取部分腸道酶液，用BCA法檢測蛋白濃度，得腸道酶液的蛋白濃度為20. ^iig/mL。將1倍體積的蜂王漿與3倍體積的pH = 7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液混合，制備蜂王漿稀釋溶液。將上述蜂王漿稀釋溶液在25000Xg，4°C下離心2%iin，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH = 7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液中冰浴下透析56h，每隔1 更換一次透析液。取透析袋中液體，即為高純度的水溶性蜂王漿蛋白，保存在-20°C冰箱中。取部分水溶性蜂王漿蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，得水溶性蜂王漿蛋白的蛋白濃度為32. 5mg/mL。腸道酶與蜂王漿酶解條件的確定對酶解的PH值、酶解時間進行摸索，結果見圖2 至圖9。確定最佳酶解條件為在pH值為8. 3 8. 7，溫度為34 39°C的條件下酶解22 26h。按照IOmL反應體系中添加4mL蛋白濃度為32. 5mg/mL的水溶性蜂王漿蛋白、 2. 5mL蛋白濃度為20. 2mg/mL的腸道酶液和3. 5mL緩沖液的比例關系，配制2000mL的反應體系。并將體系的PH值調整到8.7，34°C下經行22h的反應。反應2 后，冰浴、停止反應。反應液在15000Xg，4°C下離心Hmin，除去不溶性成分，得到1930mL上清液。用10 μ m 微孔濾膜過濾，收集濾液，再依次用分子量大小為3kDa和IkDa的膜過濾系統過濾，得到 220mL l-3kDa的濾液。將濾液冷凍干燥，再用蒸餾水溶解，0. 22 μ m的薄膜過濾，得到酶解后l_3kDa的蜂王漿多肽。經BCA方法檢測后，得到酶解后蜂王漿蛋白多肽的蛋白濃度為 2. 42mg/mL。實施例5各取ImL實施例1至4制得的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽旋轉揮干，用0. 06 % TFA的水溶解到lmL，12000rpm離心lOmin，取上清。梯度洗脫條件如下平衡緩沖液 (A) 0. 06% TFA，洗脫緩沖液(B) 0. 05% TFA 的乙腈；梯度0 ~ 100% B over 6column volumes (CV)；流速:lmL/min ；進樣體積:500 μ L ；檢測波長:280nm/214nm。檢測結果如圖 10所示。實施例6D-MEM/F12基本培養基將D-MEM/F12培養基溶于三蒸水中，混合均勻，用NaHCO3 將培養基的PH值調為7. 2，經0. 22 μ M的微孔濾膜過濾，分裝后，4°C保存。D-MEM/F12完全培養基在D-MEM/F12基本培養基中添加10%的胎牛血清，1 %的各10萬μ/L的青霉素/鏈霉素，混合均勻，4°C保存。在超凈臺上，將Img 4 0251完全溶于擬8111滅菌三蒸水，配制成1讓01/1的母液，-20°C保存，用前37°C老化72h，分裝后-20°C保存待用。SH-SY5Y細胞用含體積分數為10%的FBS，1 %青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養基，于37°C，5%的(X)2培養箱中培養，每2天進行1次傳代。取對數生長期細胞經行實驗。 將細胞分為3組。正常對照組完全培養基培養Mh后換為無血清DMEM/F12培養基；ΑβΜ_35 模型組加入25 μ mol/L的Αβ 25_35 ；蜂王漿蛋白多肽保護組實施例1至4制得的l_3kDa 的蜂王漿蛋白多肽(不同濃度)預孵育4h后，加入25μπι01/1&Αβ25_35。MTT測定細胞存活率取對數生長期SH-SY5Y細胞，以3X104cellS/ml的密度， 200μ Ι/well接種到96孔培養板，37°C，5 %的CO2培養箱中培養，24h后吸棄舊培養基，正常對照組和A β 25_35模型組分別加入100 μ 1無血清DMEM/F12培養基，蜂王漿蛋白多肽保護組加入100 μ 1含實施例1至4制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽(不同濃度)的無血清 DMEM/F12培養基。預孵育4h后，正常對照組換加100 μ 1無血清DMEM/F12培養基，A β 25_35 模型組換加100 μ 1 25 μ mol/L的A β 25_35的無血清DMEM/F12培養基，蜂王漿蛋白多肽保護組換加100 μ 1同時含25 μ mol/LA β 25_35和不同濃度實施例1至4制得的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養基。分別設置6個復孔。藥物作用24h后，每孔加入5mg/ ml的MTT (pH= 7. OPBS配制)11 μ l，4h后，棄培養基，加入DMSO 150 μ Ι/well，黑暗下輕輕震蕩lOmin，酶標儀492nm和630nm下讀吸光度(OD)值。細胞存活率(％)=(實驗組0D492_63Q-blank 組 0D492_63Q)/(control 組 0D492-63Q-blank組0D492_63Q) X100%。倒置顯微鏡觀察結果見圖11。MTT比色法結果見圖12。由倒置顯微鏡的結果顯示control組的SH-SY5Y細胞均勻分布生長，生長良好， 胞體豐滿，透光率好，突觸明顯且伸展良好，大部分細胞呈梭形、三角形或多邊形，細胞培養液澄清透明。25μΜ Αβ25_35處理的24h后，SH-SY5Y細胞分布不均勻，聚集成簇生長，細胞形態不均一，胞體收縮，透光率下降，突觸減少或消失，細胞圓形化嚴重；細胞有懸浮且細胞培養液有渾濁現象。不同濃度梯度的l_3kDa的RJP處理組與25 μ M A β 25_35模型組相比， 隨著RJP濃度的逐漸增大，細胞聚集成簇的現象逐漸減弱，生長逐漸均勻分布，胞體逐漸飽滿，透光率逐漸增強，突觸逐漸變多變長，細胞圓形化現象減弱，細胞培養液渾濁現象也變弱，總體細胞狀態有明顯改善。由MTT比色法檢測的結果顯示25 μ M A β 25_35處理SH-SY5Y細胞24h后，能導致細胞的MTT代謝率明顯下降。說明25μΜΑβ2Μ5能顯著地降低細胞線粒體的活力，從而對細胞造成顯著地損傷，形成對細胞明顯的毒性。四種濃度的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽與 25μΜΑβΜ_Μ共同作用24h后，都能使細胞MTT的代謝率顯著提高，與Αβ模型組差異明顯 (P < 0. 01),92 μ g/ml的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽效果最好。由此說明，隨著l_3kDa蜂王漿蛋白多肽的濃度的增加，MTT的代謝率逐漸提高，呈現顯著的濃度依賴性關系；l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽能有效抑制25 μ M A β 25_35對SH-SY5Y細胞的毒性作用，對A β 25_35導致的 SH-SY5Y細胞損傷有明顯的保護作用(P < 0. 01)。 乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)釋放的檢測取對數生長期的 SH-SY5Y細胞，調整細胞密度為3X104cells/ml,200y Ι/well接種到96孔培養板，37°C， 5%的(X)2培養箱中培養，24h后吸棄舊培養基，正常對照組和A β 25_35模型組每孔分別加入 100 μ 1無血清DMEM/F12培養基，蜂王漿蛋白多肽保護組加入100 μ 1含不同濃度實施例1 至4制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養基。4h后，正常對照組換加 10(^1無血清01^11/^12培養基^^51模型組換加10(^1 25 4 11101/1的六^51的無血清 DMEM/F12培養基，蜂王漿蛋白多肽保護組換加100 μ 1同時含25 μ mol/LA β Μ_35和不同濃度實施例1至4制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養基。分別設置4個復孔。藥物作用24h后吸取上清，每孔取0.02ml立即經行LDH濃度檢測。按照LDH試劑盒操作步驟做空白管、標準管、測定管和對照管，并分別添加相應溶液并混勻，室溫放置3min， 440nm蒸餾水調零，Icm光徑測定各管的吸光度。按照如下公式計算培養液中LDH活力
培養液中LDH活力(U/L) =x標準濃度(2mmol/L) X樣品測試前稀釋倍數X 1000。結果見圖13。由圖可知control組的細胞培養液中釋放的LDH量很低，兩組實驗中LDH活性分別為 22. 87 士 3. 76U/L 和 38. 17 士 6. 52U/L。25 μ M Αβ 25_35 處理 SH-SY5Y 細胞 24h 后，培養液中釋放的LDH量顯著增加(P < 0. 001)，說明25 μ M A β 25_35對SH-SY5Y細胞的膜結構造成了一定的損傷，使細胞質中的部分LDH透過損傷的細胞膜釋放到培養液中。與々025_35模型組相比，三種不同濃度的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽均能使細胞培養液中的LDH釋放量顯著減少(P < 0. 01)，且隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，LDH釋放量逐漸減少，表現出顯著的濃度依賴性關系。與Αβ25_Μ模型組相比，本組實驗中92μ g/ml的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽能最大程度地抑制LDH的釋放，抑制率在66%左右。Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測細胞凋亡率取對數生長期的 SH-SY5Y細胞，調整細胞密度為8. 5X104cells/ml,2ml/well接種到6孔培養板，37°C，5% 的(X)2培養箱中培養Mh，24h后吸棄舊培養基，正常對照組和A β 25_35模型組每孔分別加入 2ml無血清DMEM/F12培養基，蜂王漿蛋白多肽保護組加入2ml含不同濃度實施例1至4制得的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養基。4h后，正常對照組換加2ml無血清DMEM/F12培養基，A β 25_35模型組換加^il 25 μ mol/L的A β 25_35的無血清DMEM/F12 培養基，蜂王漿蛋白多肽保護組換加2ml同時含25 μ mol/L A β 2M5和不同濃度實施例1至 4制得的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養基。藥物作用24h后，吸出培養基于EP管中保存，用不含EDTA的胰酶消化30s，后用Iml含2%血清的冷PBS輕輕吹打， 然后和上一步吸出的培養基混勻，4°C下lOOOr/min離心lOmin，棄上清。加入Iml含2%血清的冷PBS，輕輕震蕩使細胞重懸，4°C下1000r/m離心lOmin，棄上清。重復上一步一次， 再將細胞重懸于500 μ 1稀釋好的IXbinding buffer中，轉移到流式上樣管，加入25 μ 1 Annexin V-FITC (終濃度為0. 5 μ g/ml)。常溫避光15min或4°C避光30min，加入5 μ 1碘化丙啶(Propidium iodide，PI，終濃度 0. 5-1. 0 μ g/ml)，混勻，用 FACS Calibar 流式細胞儀 (美國Becton Dickinson)，選擇激發波長488nm，發射波長530nm檢測。采用Cell-Quest 數據處理軟件，獲取10000個細胞分析。結果見圖14，結果總結見圖15。由圖可知control組細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率較小，只占細胞總數的
5.32士0.98% -6. 88士0.37%。25 μ M 的 Aβ 處理 24h 后，SH-SY5Y 細胞出現明顯的凋亡，早期凋亡率和晚期凋亡率占細胞數的26. 39士2. 24% -36. 71 士 1. 47%，表現在流式圖上為第四象限和第一象限細胞數明顯增多(Ρ<0.001)。25μΜ的Αβ2Μ5與不同濃度的 l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h后，SH-SY5Y細胞的總體凋亡率有所下降，且隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率逐漸減小，呈一定的濃度依賴性關系。 當蜂王漿蛋白多肽濃度為92μ g/ml時，早期凋亡率和晚期凋亡率從26. 39 士 2. 下降到
6.97士 1.01% (P <0.001)，接近空白對照組的水平。由此說明，l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽對A β 25_35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡有一定的抑制作用。活性氧自由基(ROS)的產生量用DCFH-DA探針方法測定取對數生長期的 SH-SY5Y細胞，調整細胞密度為8. 5X104cells/ml,2ml/well接種到6孔培養板，37°C，5% 的(X)2培養箱中培養，24h后吸棄舊培養基，正常對照組和A β 25_35模型組每孔分別加入2ml無血清DMEM/F12培養基，蜂王漿蛋白多肽保護組加入2ml含不同濃度實施例1至4制得的 l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養基。4h后，正常對照組換加2ml無血清 DMEM/F12培養基，A β 25_35模型組換加2ml 25 μ mol/L的A β 25_35的無血清DMEM/F12培養基， 蜂王漿蛋白多肽保護組換加2ml同時含25 μ mol/L Αβ 25_35和不同濃度實施例1至4制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養基。藥物處理24h后，吸棄舊培養基， 用無血清培養基洗一遍，每孔加2ml 1 1000配制的含DCFH-DA (終濃度20 μ mol/L)的無血清培養基，370C，5%的CO2培養箱中20min，每隔5min輕輕搖晃一下。無血清培養基洗三遍后，胰酶消化30s，用含2%血清的PBS吹打細胞重懸。使用FACS Vantage SE流式細胞儀(美國Becton Dickinson)，選擇激發波長488nm，發射波長525nm檢測。結果見圖16由圖可知，25μΜ的Αβ25_35處理24h可以使SH-SY5Y細胞中的ROS顯著升高(P
<0.001)，熒光強度從6. 27士0.60升高到19. 99士0.59。25 μ M的Αβ 25_35與不同濃度的 l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽共同處理SH-SY5Y細胞24h后，ROS的產生量均有下降，且隨著各自濃度的增加，ROS的產生量呈先降低后增加的趨勢。對于l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽處理組，46μ g/ml的劑量可以使ROS的產生量降到最低，從19. 99 士0. 59降低到14. 06 士0. 34 (P
<0. 001)。表明l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽能夠阻止A β 25_35誘導的SH-SY5Y細胞內活性氧自由基(ROS)的產生。劑量濃度在一定范圍內時，隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，ROS生成量呈減小的趨勢；當蜂王漿蛋白多肽濃度繼續增大時，ROS生成量又逐漸上升。western blotting檢測Bcl_2和Bax的表達量選用一抗為鼠源的Bcl_2和Bax 抗體，用western blotting的方法檢測SH-SY5Y不同處理組中Bcl_2和Bax的表達量。取對數生長期的SH-SY5Y細胞，調整細胞密度為8. 5 X 104cells/ml，2ml/Well接種到6孔培養板，37°C，5%的CO2培養箱中培養，24h后吸棄舊培養基，正常對照組和Αβ 25_35模型組每孔分別加入2ml無血清DMEM/F12培養基，蜂王漿蛋白多肽保護組加入2ml含不同濃度實施例 1至4制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養基。4h后，正常對照組換加 2ml無血清DMEM/F12培養基，A β 25_35模型組換加2ml25 μ mol/L的A β 25_35的無血清DMEM/ F12培養基，蜂王漿蛋白多肽保護組換加2ml同時含25ymol/L A β 25_35和不同濃度實施例 1至4制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養基。藥物處理24h后，冷的 PBS 洗兩遍，收取細胞，并用 lysis buffer (10%甘油，50mM pH = 6. 8 的 Tris-HCl，2% β-巰基乙醇，0· 02%溴酚藍，2%或5%的SDS)在100°C下裂解lOmin，冰浴5min，vortex 混勻輕甩后，上樣或-80 0C凍存備用。選用15% 的 SDS-PAGE 分離膠，10 μ 1/ 孔上樣，按 100V 20min, 160V 1. 5h 的方法電泳分離。0. 5%的脫脂奶粉封閉2h，相應濃度的一抗4°C反應過夜，二抗常溫下反應1. 5h。 ECL發過檢測系統檢測Bcl-2和Bax的表達量，UMAXl 120掃描儀掃描，ImageJ軟件定量分析。結果見圖17、圖18。 由圖可知，25 μ M的A β 25_35處理24h后，SH-SY5Y細胞中Bax/Bcl_2的值顯著提高， 變為 control 組的 2. 24士0. 18 倍(P < 0. 001)，而 25 μ M 的 A β 25_35 與不同濃度的 l_3kDa 的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h均能降低Bax/Bcl-2的值，且劑量濃度在11. 5-92 μ g/ml 之間時，隨著濃度的增加有逐漸減小的趨勢，呈一定的劑量依賴性；濃度為46 μ g/ml時，減少到最低水平，為control組的0. 65士0. 05倍(P < 0. 001)。當濃度為92 μ g/ml時，Bax/ Bcl-2的值又有輕微增加的趨勢。
25 μ M的A β 25_35處理24h后，SH-SY5Y細胞中Bax蛋白的表達量顯著地增加，變為 control 組的 1. 69士0. 14 倍(P < 0. 001)，而 25 μ M 的 A β 25_35 與不同濃度的 l_3kDa 的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h均能降低Bax的表達量，且劑量濃度在11. 5-92 μ g/ml之間時， 隨著濃度的增加Bax的表達量有逐漸減小的趨勢，呈一定的劑量依賴性；濃度為46 μ g/ml 時，減少到最低水平，為control組的0. 38士0. 04倍(P < 0. 001)。當濃度為92 μ g/ml時， Bax的表達量又有輕微增加的趨勢。Bcl-2蛋白的表達量呈不 規則的變化，且control組與 Αβ 25_35模型組、Αβ 25_35模型組與不同濃度的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽處理組之間差異均不顯著(P>0.05)。表明l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽能夠阻止Αβ25_35誘導的SH-SY5Y細胞內Bax/Bcl-2值的升高，在某一濃度范圍內均呈一定的濃度依賴性關系。l_3kDa的RJP的最適濃度為46 μ g/ml。l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽使Bax/Bcl-2值降低的原因主要為蜂王漿蛋白多肽能顯著的抑制Αβ 25_35誘導SH-SY5Y細胞內Bax表達量的升高。上述全部數據采用SPSS13. 0統計軟件經行統計分析，數據用叉±S表示，組間比較用單因素方差分析(One-way AN0VA)檢驗，P < 0. 05時認為差異顯著。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種蜂王漿多肽的制備方法，其特征在于，包括步驟1 將2 3日齡的蜂王幼蟲腸道，加入PH值為7. 0 7. 2的磷酸鹽緩沖溶液或 Tris-HCl緩沖溶液研磨成勻漿，在18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，收集第一次離心后的中層液體，然后在18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，收集第二次離心后的中層液體，得到腸道酶液；步驟2 在蜂王漿中，加入pH值為7. 0 7. 2的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液，在 18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，收集上清液，經截留分子量為8000 14000的透析袋在PH值為7. 0 7. 2的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液中冰浴透析42 72h， 收集透析袋中透析液，得到水溶性蜂王漿蛋白液；步驟3 以mg/mL計，將步驟1所得的腸道酶液與步驟2所得的水溶性蜂王漿蛋白液按照蛋白濃度比為30 35 80 90混合，在pH值為8. 3 8. 7，溫度為；34 39°C的條件下酶解22 ^h，得到水溶性蜂王漿蛋白酶解液；步驟4 將步驟3所述的水溶性蜂王漿蛋白酶解液冰浴停止酶解反應后，在8000 15000g，4°C條件下離心10 20min，收集上清液，用10 μ m微孔濾膜過濾后，收集濾液得到第一濾液，將所述第一濾液經3kDa的超濾膜過濾，收集濾液得到第二濾液，將所述第二濾液經IkDa的超濾膜過濾，收集截留物得到1 3kDa的蜂王漿多肽。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1或步驟2中磷酸鹽緩沖液或 Tris-HCl緩沖溶液的濃度為50mmol/L。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1中所述蜂王幼蟲的腸道與磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液的質量體積比以g/mL計為1 1 1 2。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2中磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液與所述蜂王漿的體積比為2 1 4 1。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，以mg/mL計，步驟3中，所述腸道酶液與所述水溶性蜂王漿蛋白液的蛋白濃度比為32. 5 85。
6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3中酶解溫度為37°C。
7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3中酶解pH值為8.5。
8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3中酶解時間為Mh。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種蜂王漿多肽的制備方法。本方法通過從蜂王幼蟲體內提取腸道酶，模擬蜂王體內酶解環境對蜂王漿進行酶解得到1～3kDa的蜂王漿多肽，制得的蜂王漿多肽能夠用于制備Aβ抑制劑。
文檔編號C12P21/06GK102251005SQ20111018738
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月5日 優先權日2011年7月5日
發明者馮成強, 孫平, 李虎臣, 顏慧 申請人:北京師大科技園科技發展有限責任公司, 北京師范大學