專利名稱：非活化碳-碳雙鍵還原酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，具體地，涉及一種非活化碳-碳雙鍵還原酶及其編碼基因與應用。
背景技術：
新基因和新酶資源是工業生物技術發展的驅動力。系統深入地發掘具有生物催化潛力的酶基因，不僅能為新穎的生物催化劑的研制提供主效基因來源，還有助于通過酶工程(如定向進化)改良酶的催化性能，加速實現酶催化的工業應用。生物催化劑包括酶和完整細胞，碳_碳雙鍵還原酶屬于新型生物催化用酶，主要應用于醫藥等精細化學品的合成。含吸電子基團(如酮、醛、酸、酸酐、酯、內酯、硝基等)的α，β碳-碳雙鍵稱為活化的碳_碳雙鍵，反之則為非活化的碳_碳雙鍵。12-氧-植物二烯酸還原酶 (12-oxo-phytodienoic acid reductase, 0PR)是茉莉酸生物合成中的一個關鍵酶，它催化 12-氧-植物二烯酸五元環上活化的碳-碳雙鍵的還原。目前，盡管對擬南芥、水稻等幾個物種的OPR進行了生化和遺傳方面的研究，也有研究發現異源表達的番茄OPR能夠催化活化的碳_碳雙鍵發生還原反應，表現出一定的生物催化應用潛力。但是，對于OPR還原非活化的碳_碳雙鍵的催化活性研究還未見報道。以完整細胞作為生物催化劑對非活化碳_碳雙鍵的還原反應研究，則有一例。詹喜等(有機溶劑中固定化酵母細胞催化香葉醇還原生物轉化的研究.浙江大學學報-農業與生命科學版2006，32 (4) :391-395.)通過篩選不同的酵母菌株對香葉醇非活化碳-碳雙鍵的還原活性，發現Baker' s酵母還原香葉醇非活化碳_碳雙鍵的催化活力最強，但至今仍并不清楚究竟是細胞內的哪一種酶在發揮作用。通常情況下，天然酶在細胞內的含量極其微小，因而作為生物催化劑的應用潛力受到局限。而通過基因重組和異源表達技術產生的酶量可能超出該酶在出發細胞內含量的數千倍以上，這一點對規模化制備酶催化劑尤為重要。本專利涉及的利用重組菌高表達 12-氧-植物二烯酸還原酶并將其應用于非活化碳_碳雙鍵還原反應的研究尚未見文獻報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種非活化碳_碳雙鍵還原酶及其編碼基因與應用。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR，(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；(b)將(a)中的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失或添加且具有酶EaCffR活性的由(a)衍生的蛋白質。所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaCPR的編碼基因EaOPR基因。所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO=I 所示。
所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaCffR的編碼基因為如下(a)-(d)中任一所述的基因(a)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1155位；(b)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1152位；(c)在嚴格條件下與(a)或(b)的基因雜交且編碼所述蛋白的基因，所述嚴格條件為用0. IX SSPE或0. 1XSSC，0. 1% SDS的溶液，在DNA或RNA雜交實驗中65°C下雜交并洗膜；(d)與(a)或(b)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。擴增上述所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaCffR的編碼基因全長或其任一片段的引物。含有上述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR的編碼基因的表達載體。含有上述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR的編碼基因的細胞系。含有上述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR的編碼基因的宿主菌。所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR在還原非活化碳-碳雙鍵催化活性中的應用。 所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR編碼基因在還原非活化碳-碳雙鍵催化活性中的應用。本發明所提供的非活化碳_碳雙鍵還原酶，名稱為EaOPR，來源于小檗科植物粗毛淫羊藿(Epimedium acuminatum Franch)，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的由1)衍生的蛋白質。為了使1)中的EaCffR便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽序列。表1.標簽的序列
權利要求
1.非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR，(a)其氨基酸序列如SEQID NO 2所示；(b)將(a)中的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失或添加且具有酶 EaCffR活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述的非活化碳_碳雙鍵還原酶EaOPR的編碼基因EaOPR基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaCffR的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
4.根據權利要求2所述的基因，其特征在于該編碼基因為如下(a)-(d)中任一所述的基因(a)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1155位；(b)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1152位；(c)在嚴格條件下與(a)或(b)的基因雜交且編碼所述蛋白的基因，所述嚴格條件為用 0. IX SSPE或0. 1XSSC，0. 1% SDS的溶液，在DNA或RNA雜交實驗中65°C下雜交并洗膜；(d)與(a)或(b)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
5.根據權利要求2所述的基因，其特征在于擴增所述EaCffR基因全長或其任一片段的引物。
6.含有權利要求2或3或4或5所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR的編碼基因的表達載體。
7.含有權利要求2或3或4或5所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR的編碼基因的細胞系。
8.含有權利要求2或3或4或5所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR的編碼基因的宿主菌。
9.權利要求1所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaCffR在還原非活化碳-碳雙鍵催化活性中的應用。
10.權利要求2或3或4或5所述的非活化碳-碳雙鍵還原酶EaOPR編碼基因在還原非活化碳_碳雙鍵催化活性中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種非活化碳-碳雙鍵還原酶基因的克隆、表達及用于還原香葉醇的非活化碳-碳雙鍵。該酶是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的由1)衍生的蛋白質。將該蛋白的編碼基因導入大腸桿菌后構成的重組大腸桿菌。實驗證明本發明提供的重組大腸桿菌所產蛋白具有還原非活化碳-碳雙鍵的催化活性，通過氣相色譜與質譜聯用(GC-MS)檢測證實，上述蛋白將香葉醇的非活化碳-碳雙鍵還原從而生成香茅醇。
文檔編號C12N5/10GK102260652SQ20111017746
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者曾英, 袁田田, 趙沛基, 陳倩倩 申請人:中國科學院昆明植物研究所