專利名稱：一種與綿羊眼肌性狀相關的snp及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域中一種利用單核苷酸多態性預測綿羊眼肌性狀的方法。
背景技術：
根據一個物種已知的基因序列設計簡并引物是獲得另一個物種未知基因的一種 發法。獲得基因后可以利用生物信息學手段對新基因進行功能預測，并通過半定量RT-PCR 和熒光定量PCR對該基因進行組織表達分析，通過多態性分析進行驗證。鈣蛋白酶抑制 蛋白(Calpastatin，CAST)基因在小鼠、人、兔和牛等物種存在不同的轉錄本，而且不同 的轉錄本在不同組織中的表達存在差異(Emori et al. ,1987, Proc Natl Acad Sci USA 84(11) 3590-3594 ；Killefer andKoohmaraie, 1994, J Anim Sci 72(3) 606-614 ；Takano et al. ,2000, JBiochem 128(1) :83_92)。Zhu等人發現CAST在睪丸組織中存在一新的亞 型，克隆了新基因，并推測可能與精子的發生與關(Zhu, H. et al.，2002，Acta Pharmacol Sin 23(5) :450_454)。單核苷酸多態性標記(singlenucleotide polymorphism, SNP)是 1996 年被美 國MIT的Ε. Lander提出的，被稱為“第二代DNA遺傳標記〃。其基本原理是對于一個經 PCR擴增后具有固定長度的DNA片斷，其分子構象是由堿基序列所決定的，因此單個堿基的 改變能夠引起DNA分子單鏈或等位基因間形成的錯配異源雙鏈在變性條件下存在微小的 構象差別，這些不同的構象體在電泳或高效液相檢測中因移動性的差異而得以區分。SNP的 檢測可以通過PCR-SSCP、PCR-RFLP、測序及SNP芯片等多種技術實現。目前知道牛的CAST基因存在四種轉錄本，但在羊上CAST基因的研究較少，而且 GenBank上的序列不能清楚知道它屬于CAST基因的那種轉錄本。有關羊CAST基因SNP的 檢測及功能驗證研究還是一個空白，對于羊的標記輔助選擇及育種帶來很大的障礙。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種綿羊單核苷酸多態性標記，自SEQID No 1所示序列 的5’端起第73位堿基為G或者A。本發明還提供上述的綿羊單核苷酸多態性標記在綿羊眼肌性狀預測中的應用。本發明的目的是提供利用單核苷酸多態性檢測綿羊眼肌性狀的引物，其序列如 SEQ ID No 2 和 SEQ ID No 3 所示。本發明提供的綿羊單核苷酸多態性標記在綿羊眼肌性狀預測中的應用，具體是用 上述的引物對綿羊的總DNA進行PCR擴增，然后再對PCR擴增產物進行單核苷酸多態性檢 測，確定自序列表中SEQID No 1的5’端起第73位堿基為G還是A，具有G等位基因的個體 會有較大的眼肌面積和眼肌寬度，也即GG、GA基因型的個體的眼肌面積和寬度顯著性的大 于AA基因型。所述單核苷酸多態性檢測的方法為DNA測序、聚合酶鏈式反應_限制性酶切位點 長度多態性、聚合酶鏈式反應_單鏈構象多態性或等位基因特異的寡核苷酸雜交。優選為聚合酶鏈式反應-限制性酶切位點長度多態性。其中限制性內切酶選用Nsi I。本發明還提供含有SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所述引物的用于單核苷酸多態性 預測綿羊眼肌性狀的試劑盒。該試劑盒還包括PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、滅菌雙 蒸水。該試劑盒還可包括限制性內切酶Nsi I及其緩沖液。本發明利用綿羊的CAST基因的SNP突變位點進行基因型快速分型。不同的綿羊群 體存在這些多態位點上的基因型頻率和基因頻率存在顯著差異。利用一般線性模型對CAST 基因的CAST-Sl的g. G73A的SNP位點與綿羊的生產性狀進行關聯分析，表明CAST-S 1的 g. G73A突變與眼肌厚度和眼肌面積存在關聯，其中GG型和AG型的眼肌厚度極顯著高于AA 型(P<0.01) ；GG型和AG型的眼肌面積顯著高于AA型(P < 0. 05)。該多態位點的檢出， 不僅為分子育種提供了新的素材，同時為綿羊眼肌性狀的標記輔助選擇提供科學依據。


圖1為CAST-Sl擴增片段的SSCP結果。圖2為CAST-Sl擴增片段的測序峰圖。圖3為CAST-Sl擴增片段的RFLP結果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1(1)用眼科手術剪將約0.3g肌肉組織塊充分剪碎，置于1.5ml離心管中，干燥 20mino(2)在上述離心管中加入500 μ 1組織DNA提取液。(3)在上述離心管中加入RNA酶溶液至終濃度為20μ g/ml，充分混勻，37°C消化 1 2小時。(4)在上述離心管中加入蛋白酶K至終濃度為150yg/ml，充分混勻，55°C消化 12 24小時。(5)在上述離心管中加入等體積的Tris飽和酚，緩慢顛倒離心管10分鐘使溶液的 兩相充分混勻4°C，12000rpm離心10分鐘，然后轉移上清液至一個干凈的離心管中。重復一次。(6)再加入用等體積的Tris飽和酚氯仿異戊醇(25 24 1)，混勻，4°C， 12000rpm離心10分鐘。(7)取出上清液，轉移入新的離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)， 4°C, 12000rpm 離心 10 分鐘。(8)取上清，加入1/10體積的3M NaAc (pH5. 2)和2倍體積的冰凍無水乙醇沉淀 DNA。(9)將DNA沉淀挑出，置于新的干凈的1. 5ml離心管中，用90%乙醇洗滌兩次。(10)將DNA自然晾干后，加入適量TE或滅菌雙蒸水進行溶解，-20°C保存。
共檢測樣本336個，小尾寒羊純種個體36個，杜泊羊*湖羊雜交個體229個，陶賽 特羊*湖羊雜交個體71個。其中小尾寒羊純種個體用于PCR-SSCP分析，檢測多態位點；兩 個雜種羊群體用于PCR-RFLP多態性大規模檢測。實施例21、PCR 擴增PCR-SSCP的PCR引物如下表所示。表1 5對特異性引物序列、退火溫度及目的片段長度
引物引物序列片段長度 (bp)退火溫度 fC)CAST-Sl5'-CTCTTGGACTTTTGAACTGTA-3 ‘ 5 ’-CCACGTGAGTATTCTAAGCA-3 ‘31051.9CAST-S25 '-CTCACGTGGCTTGATCTCTG-3 ‘ 5 '-CAAGTTGTGGGATATCAGACC-3 ‘27854.2CAST-S35 '-GAACTAGGGAGGGTCTGATA-3 ‘ 5'-CCCATTAGACAGTATCAGTGATA-3'26554.0CAST-S45'-GTACTACCTACAGACACATAGTT-3' 5'-GTACTACCTACAGACACATAGTT-3'36850.4CAST-S55'-CATGCATATGCCTGAGAT-3'25555.0
_5,-CACATCTGTCAATGTCAA-3’_PCR反應擴增體系為25 μ 1，其中IOX含Mg2+的PCR緩沖液2. 5 μ 1，dNTPs 2μ 1 (各 2. 5mmol/L)，上游引物和下游引物各 0. 4μ l(20ymol/L)，0. 3μ ITaq 酶(5U/y 1), 模板DNA (cDNA) 2 μ 1，超純水補齊至25 μ 1。PCR反應條件為預變性94°C 3min后；進入如下循環94°C變性30sec，各對引物 退火溫度見上表，退火30seC，72°C延伸60sec，35個循環后；72°C延伸IOmin ；4°C保存。取 6 μ 1的PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳，檢測PCR產物的質量。結果表明，所設計的5對引物的PCR產物為特異性擴增，片段長度與預期大小一 致，沒有非特異擴增條帶，因此PCR產物可以直接進行SSCP分析。2、對PCR產物進行SSCP分析。(1)實驗之前，將電泳板用蒸餾水洗凈涼干后放入膠框內。(2)將現配的12% (或者其它濃度)的聚丙烯酰胺倒入玻璃板內，插入梳子。(3)待膠凝固后，拔掉梳子，立刻用蒸餾水沖洗點樣孔，然后用吸水紙將孔內的水 吸干凈，將玻璃板放入電泳槽上，倒入適量的IXTBE電泳緩沖液。(4) 300V, 60mA 預電泳 IOmin 左右。(5)取2 μ IPCR產物，加入8 μ 1變性緩沖液，瞬時離心后于98°C變性10分鐘。(6)取出離心管，立即置于冰上至少5分鐘后點樣，首先，200V電泳20min。(7)4°C，150V左右電泳過夜，時間大約10個小時。
(8)取出凝膠，用蒸餾水沖洗后，迅速倒掉蒸餾水。(9)用20%乙醇固定2次，每次15分，每次固定之后用蒸餾水沖洗干凈。(10)用蒸餾水漂洗后，加入的硝酸氧化3分鐘，之后凝膠用蒸餾水漂洗兩遍 (硝酸需要回收)。(11)向凝膠中加入0. 硝酸銀溶液，室溫下置于搖床上染色30分鐘或20分鐘 (硝酸銀需要回收)。(12)凝膠用蒸餾水漂洗，然后加入顯色液進行顯色。(13)待條帶清晰后，倒掉顯色液，加入4%乙酸浸沒膠面，終止顯色。(14)判斷帶型后，用凝膠呈像系統照相留做分析統計用。(15)對帶型特殊的個體，克隆測序確定突變位點。由于片段長度大小不一樣，根據片段大小調整凝膠的濃度。CAST-S4采用8%聚丙 烯酰胺凝膠，CAST-Sl、CAST-S2、CAST-S3和CAST-S5采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。通過對 SSCP電泳圖進行分析，發現引物CAST-S2、CAST-S3、CAST-S4和CAST-S5的擴增片段沒有多 態性，引物CAST-Sl的擴增片段有多態性(圖1)，擴增片段中可能存在幾個突變位點，但是 由于帶型比較復雜，所以采用克隆測序的方法，最終確定突變位點。通過PCR-SSCP確定可 能存在突變的個體，進行克隆測序。克隆測序發現CAST-Sl擴增產物(參見圖2)中存在4 個突變位點，其中在擴增產物的73位點處存在A-G的突變(圖2A)，105-106位點處存在CA 的缺失(圖2B)，210位點處存在G-A的突變(圖2C)，219位點處存在G-A的突變(圖2D)。實施例3根據實施例2所述的方法對杜泊羊X湖羊的229個子一代，陶賽特羊X湖羊的 71個子一代的總DNA進行PCR擴增。由于Nsi I酶可以識別73位點處的突變，用Nsi I酶 對PCR進行酶切后分型(圖3)。酶切反應的總體系為20μ 1，其中含10μ 1 PCR產物，2 μ 110 X Buffer (限制性內 切酶特異性緩沖液)，4 5U限制性內切酶，高壓滅菌雙蒸水補至20 μ 1。混合后按照酶的 說明書在37°C下酶切4小時左右。酶切產物用2. 0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，5V/cm電泳， 紫外燈下觀察，并拍照。采用SASv8. 02 (Statistical Analysis System)中的線性模型軟件對數據進行分 析SNPs多態位點的不同基因型與生產性狀的關聯性。根據影響生產性狀的因素，分析時采 用了以下固定模型Yijklmn = μ +Breedi+Agej+Genotypek+Littei^+SeXm+Farmn+ei jklmn其中yijklmn_個體生產性狀記錄；μ-生產性狀的群體均值；Breedi-父本的品 種效應；Agej-年齡效應；Genotypek-候選基因的基因型效應；Litter1-胎產羔數效應； Sexm-性別效應；Farmn-場效應；eijklnm-隨機誤差效應。CAST基因在CAST-Sl的g.G73A位點處的基因頻率和基因型頻率見表2。結果表 明。在杜泊羊X湖羊和陶賽特羊X湖羊兩個子代群體中均檢測到三種基因型GG、AG和 AA0經適合性χ 2檢驗表明，杜泊羊X湖羊和陶賽特羊X湖羊兩個子代群體在該位點均處 在Hardy-Weinberg非平衡狀態(P < 0. 01)。CAST基因的該多態位點在群體中的雜合度、 有效等位基因數和多態信息含量參見表3。該位點處，杜泊羊X湖羊和陶賽特羊X湖羊兩 個群體均屬于中度多態(0. 25 < PIC < 0. 5)。
表2CAST-S1的g. G73A位點處兩個綿羊群體的基因型和等位基因頻率
群體數量基因頻率基因型頻率X2cG AGGAGAA杜泊羊*湖羊2290.4978 0.50220.08730.82100.091794.3717(20/229)(188/229)(21/229)陶賽特羊*湖710.5282 0.47180.14080.77460.084521.8090羊(10/71)(55/71)(6/71)注df= 2，X0.052 = 5 . 9，X0.012 = 9. 21表3CAST-S1的g. G73A位點處雜合度、有效等位基因數和多態信息含量
群體純合度雜合度有效等位基因數多態信息含量杜泊羊*湖羊0.50000.50002.00000.3750
陶賽特羊*湖羊0.50160.49841.9930.3742注PIC > 0. 5為高度多態，0. 25 < PIC < 0. 5為中度多態，PIC < 0. 25為低度多態。采用線性模型分析基因型與生產性狀的關聯性。CAST-Sl的g. G73A突變三種基 因型GG、AG、AA與2個綿羊群體生長性狀的關聯效應如表4所示。結果表明CAST_S1的 g. G73A位點的3種基因型之間眼肌厚度差異極顯著(P < 0. 01), GG型和AG型極顯著高于 AA型，GG型和AG型差異不顯著，說明具有G等位基因的個體會有較大的眼肌寬度；同時3 種基因型眼肌面積差異顯著(P < 0. 05)，GG型和AG型顯著高于AA型(P < 0. 05)，GG型和 AG型差異不顯著(P > 0. 05)，說明具有G等位基因的個體會有較大的眼肌面積。表4CAST-S1的g. G73A位點不同基因型與生產性狀的關聯分析
性狀基因型P值GG (30)AG (243 )AA (27)屁寬(cm)22.4367土 0.5097329.1914 ±6.9272221.2556±0.487610.8368背膘厚(mm)2.86667±0.184042.59259 ±0.066072.77778±0.187450.5668眼肌厚度(mm)22.4333 ±0.8451 IA21.8066 ±0.29524A19.8148 士0.83553B0.0073眼肌寬度(mm)117.000 土3.25718112.527土1.14569110.815士4.352370.6037眼肌面積(mm2)2460.73±147.480a2333.76±50.960a2057.93±166.228b0.0355出生重(kg)4.16667±0.172564.11193 士0.068733.96667±0.187040.4030 注以上數值為最小二乘均值士標準誤；在同一行中標有不同字母A和B的數據 間差異顯著水平P < 0. 01 ；標有不同字母a和b的數據間差異顯著水平P < 0. 05。
權利要求
一種綿羊單核苷酸多態性標記，其特征在于，自SEQ ID No 1所示序列的5’端起第73位堿基為G或者A。
2.權利要求1所述的單核苷酸多態性標記在綿羊眼肌性狀預測中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，用序列如SEQIDNo 2和SEQ ID No 3所 示的引物對綿羊的總DNA進行PCR擴增，然后再對PCR擴增產物進行單核苷酸多態性檢測， 確定自序列表中SEQ ID No 1的5’端起第73位堿基為G還是A，具有G等位基因的個體有 較大的眼肌面積和眼肌寬度。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述單核苷酸多態性檢測的方法選自DNA 測序、聚合酶鏈式反應-限制性酶切位點長度多態性、聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性或 等位基因特異的寡核苷酸雜交。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述單核苷酸多態性檢測的方法為聚合 酶鏈式反應_限制性酶切位點長度多態性。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的聚合酶鏈式反應_限制性酶切位點 長度多態性所用的內切酶為Nsi I。
7.用于檢測權利要求1所述的單核苷酸多態性標記的試劑盒，其特征在于，包括序列 如SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示的引物。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、 dNTPs、滅菌雙蒸水。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括限制性內切酶NsiI及其緩沖液。
全文摘要
本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種利用單核苷酸多態性預測綿羊眼肌性狀的方法。用SEQ ID No 2和SEQ ID No3所述的引物對綿羊的總DNA進行PCR擴增，然后再對PCR擴增產物進行單核苷酸多態性檢測，確定自序列表中SEQ ID No 1的5’端第73位堿基為G還是A，具有G等位基因的個體有較大的眼肌面積和眼肌寬度。該多態位點的檢出，不僅為分子育種提供了新的素材，同時為綿羊眼肌性狀的標記輔助選擇提供科學依據。
文檔編號C12Q1/68GK101974514SQ20101027741
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月10日 優先權日2010年9月10日
發明者張莉, 張菊, 杜立新, 路國彬, 魏彩虹 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所