專利名稱：一種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種融合表達藤黃微球菌賦活促進因子 (resuscitation-promotingfactor， rpf)、新月柄桿菌cc3302基因以及秀麗隱桿線蟲 flr-4基因的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株的制備方法及在鈾礦浸出中的應用。
背景技術：
氧化亞鐵硫桿菌""'力Y/ iMacj7"s /erTOO"'G^s， T. f)是重要的浸礦微生物之 一，以氧化二價鐵、元素硫以及還原態硫的化合物等來獲得能量，在生長過程中產生三價 鐵、硫酸等浸出劑，因此能降低生產成本，同時，氧化亞鐵硫桿菌能自我繁殖擴增，可以 循環利用，這樣就進一步降低了消耗。因此，利用氧化亞鐵硫桿菌浸出金、銀、銅、鈾等 的研究越來越受到重視。雖然氧化亞鐵硫桿菌有著上訴優點，但其缺點同樣明顯，主要體現在生長速度緩慢， 高氟離子濃度下氧化能力降低甚至死亡，最適生長溫度為30'C，在高溫下活性迅速下降。發明內容本發明的目的是提供一種氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株力cjWWMoteciW^ /e/ToaaVa/^QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)，該菌株可以融合表達產生賦活促進因子、cc3302 和flr-4，與野生型氧化亞鐵硫桿菌相比生長速度更快，同時耐鈾和耐氟能力有所提高， 可以用于鈾礦浸出工業應用。本發明的另一個目的是提供制備具有表達能力的穿梭質粒pJRD215-PT的方法，該方 法操作簡單，能較好地解決用于氧化亞鐵硫桿菌接合轉移質粒只具有克隆功能的問題。本發明還提供一種三基因(rpf、 cc3302和flr_4)融合表達載體構建的方法，使用 柔性極高的兩段GGS鏈將這三段基因連接在一起與pJRD215-PT連接，降低了操作難度， 且由于柔性GGS鏈的存在保證了各蛋白的正確折疊。本發明還涉及氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株J 't/i^ j'o6a 7hs /erroouVa/7s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)在鈾礦浸出中的應用，可以提高對含氟鈾礦石的耐受性，縮短浸鈾周 期，提高浸出率，降低耗酸率。本發明的技術要點之一是穿梭表達載體pJRD215-PT構建。氧化亞鐵硫桿菌的轉化目前主要使用接合轉移方式，首先將構建好的重組接合質粒轉 化帶mob基因的感受態大腸桿菌(如S17-l和HB101等)，然后制備2: 2接合培養基，將 帶重組接合質粒的大腸桿菌和氧化亞鐵硫桿菌一起在接合培養基上孵育進行接合反應，收 集細菌，轉至帶相應抗生素的2: 2固體培養基上培養，挑取單克隆擴增鑒定。但是目前 應用于氧化亞鐵硫桿菌的穿梭質粒均為克隆載體，需要先用軟件預測目的基因的啟動子，將目的基因與啟動子一起擴增后克隆入穿梭質粒。這存在幾個問題，首先啟動子預測軟4牛 對啟動子的預測不準確，不同軟件預測的結果相差較大；其次，做不同的基因均需要進《亍 預測，增加了工作量和難度。本發明的一個實施例中提供了一種制備具有表達能力的穿梭質粒PJRD215-PT的方法， 該方法包括擴增引物合成，pJRD215和pQE30質粒的提取，T5啟動子和TO終止子的J廣 增，目的基因片段的回收，測序鑒定。(1) 擴增引物合成根據Qiagen公司提供的pQE30質粒序列設計PCR寡核苷酸擴增 引物。T5啟動子上游引物GGCGTCGACCTCGAGAAATCATAAAAAAT (下劃線處為內切酶Sail 位點)，下游引物TATCTAGA ACCCGGGGTACCGAGCTC (下劃線處為內切酶Xbal位點)，TO 終止子上游引物GTTCTAGATAATTAGCTGAGCTTGGACTC (下劃線處為內切酶Xbal位點)，下 游引物GGGAATTCATTCTCACCAATAAAAAACGCC (下劃線處為內切酶EcoRI位點)。(2) pJRD215和pQE30質粒的提取平板劃線培養過夜，挑取單克隆接種于液體培養 基中培養，集菌后按照全式金公司的EasyPure Plasmid MiniPr印Kit的說明書提取質米立。 將提到的質粒溶液儲存于-2(TC備用。(3) T5啟動子和T0終止子的擴增94。C預變性5分鐘；94'C變性30秒，6CTC退火 30秒，72。C延伸30秒，30個循環，72。C再延伸10分鐘。(4) 目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書回收 目的基因片段。(5) 目的DNA片段克隆入載體pJRD215和T0使用Xbal、 EcoRI酶切回收后連接， 得到的載體pJRD215-P和T5用Sall、 Xbal酶切回收后連接。轉化感受態細胞大腸桿菌 (E.coli)JM109，挑取菌落快速提取質粒進行酶切鑒定和PCR鑒定，所得到的陽性克隆子 是包含具有表達能力的穿梭質粒pJRD215-PT。測序結果表明擴增得到的T5啟動子由186個核苷酸組成，5'端至3'端序列為T5啟動子的核苷酸序列(SEQ ID No. 1)GCGAGCTCGGTACCCCGGGTTCTAGA TO終止子由123個核苷酸組成，5'端至3'端序列為TO終止子的核苷酸序列(SEQ ID No. 2)GCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATGAATTC 本發明的技術要點之二是三基因(rpf、 cc3302和f lr-4)重組穿梭表達載體 pJRD215-PT-rcf的構建。本發明所涉及的rpf基因來自藤黃微球菌，本發明的一個實施例中提供了一種藤黃微球菌rpf的核苷酸序列及其制備方法，該方法是以藤黃微球菌基因組DNA為模板，用f寺異 性寡核苷酸引物，經PCR方法得到。藤黃微球菌購于國家醫學菌種保藏管理中心，基因領!l 序結果表明rpf由669個核苷酸組成，5'端至3'端序列為藤黃微球菌rpf基因的核苷酸序列(SEQ ID No. 3)TCGGCCAGGAGCTCGTCCTGCCGCAGGCC為保證融合表達的順利進行，去掉了rpf670-672位的終止密碼子。該基因編碼的蛋白 氨基酸序列為藤黃微球菌rpf基因的氨基酸序列(SEQ ID No. 4)AAAEQAVVAEAETIVVKSGDSLWTLANEYEVEGGWTALYEANKGAVSDAAVIYVGQELVLPQA本發明涉及的RPF蛋白分子量為23.2kD，等電點為4.20，富含丙氨酸、天冬氨酸、甘 氨酸、絲氨酸、色氨酸和纈氨酸。在本發明的一個實施例中提供了一種藤黃微球菌rpf基因的制備的方法，該方法包手舌 擴增引物合成，藤黃微球菌基因組DNA的提取，目的基因的PCR擴增，目的基因片段的回 收，目的基因片段克隆入載體，序列測定。(1) 擴增引物合成根據GenBank中已經發表的藤黃微球菌的rpf基因序列設計PCR 寡核苷酸擴增引物。上游引物(B-F): ATCGGTACCATGGACACCATGACTCTC (下劃線處為內切酶Kpnl 位點)，下游弓I物(B-R): tgaaccacctgaaccacctgaaccacctgaaccaccGGCCTGCGGCAGGACGAG(下劃線處為GGS鏈)。(2) 藤黃微球菌基因組DNA的提取藤黃微球菌在腦心固體平板上劃線培養后，兆取 單克隆至2ml液體培養基中培養，離心集菌后用天根公司細菌基因組DNA抽提試劑盒說明 書提取基因組DNA。將提到的基因組DNA儲存于-20"C備用。(3) 目的基因的PCR擴增反應參數為95。C預變性5分鐘；95。C變性30秒，65。C退 火30秒，72。C延伸40秒，30個循環，72。C再延伸10分鐘。(4) 目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書回收目的基因片段。(5) 目的基因片段克隆入載體回收的PCR產物與T載體連接，轉化感受態細胞大腸桿菌(E.coli) JM109，挑取菌落快速提取質粒進行酶切鑒定，所得到的陽性克隆子是包括目的基因的大腸桿菌，用于基因的增殖和保藏。(6) 序列測定提取質粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，測定引物為M13啟動子引 物。rpf序列測定結果序列長669個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥嘌 呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-99、 C-262、 G_223、 T-85。本發明所涉及的cc3302基因來自新月柄桿菌，本發明的一個實施例中提供了一種新月 柄桿菌cc3302基因的核苷酸序列及其制備方法，該方法是以新月柄桿菌基因組DNA為豐莫 板，用特異性寡核苷酸引物，經PCR方法得到。新月柄桿菌購于DSMZ，基因測序結果表明 cc3302由477個核苷酸組成，5'端至3'端序列為新月柄桿菌cc3302基因的核苷酸序列(SEQ ID No. 5)為保證融合表達的順利進行，去掉了 cc3302的478-480位的終止密碼子，并將GTG 起始密碼子換成了ATG。該基因編碼的蛋白氨基酸序列為新月柄桿菌cc3302基因的氨基酸序列(SEQ ID No. 6)本發明涉及的RPF蛋白分子量為16.9kD，等電點為9.87，富含丙氨酸、精氨酸和甘氨酸。在本發明的一個實施例中提供了一種新月柄桿菌cc3302基因的制備的方法，該方法包 括擴增引物合成，新月柄桿菌基因組DNA的提取，目的基因的PCR擴增，目的基因片段 的回收。(1) 擴增引物合成根據GenBank中已經發表的新月柄桿菌的cc3302基因序列設計 PCR寡核苷酸擴增引物。上游引物(C-F): ggtggttcaggtggttcaggtggttcaggtggttca ATGTGGCGGTCGCCTGTG (下劃線處為 GGS 鏈)，下游引物 (C-R ): agatcctccagatcctccagatcctccagatcctccATTACGCGTCATGACTGAG (下劃線處為GGS鏈)。(2) 新月柄桿菌基因組DNA的提取新月柄桿菌在固體平板上劃線培養后挑取單克 隆至2ml液體培養基中培養，離心集菌后用天根公司細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提7取基因組DNA。將提到的基因組DNA儲存于-20。C備用。(3) 目的基因的PCR擴增反應參數為95。C預變性5分鐘；95。C變性30秒，65。C退 火30秒，72。C延伸30秒，30個循環，72。C再延伸10分鐘。(4) 目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書回收 目的基因片段。(5) 目的基因片段克隆入載體回收的PCR產物與T載體連接，轉化感受態細胞大 腸桿菌(E.coli) JM109，挑取菌落快速提取質粒進行酶切鑒定，所得到的陽性克隆子是包 括目的基因的大腸桿菌，用于基因的增殖和保藏。(6) 序列測定提取質粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，測定引物為M13啟動子引 物。cc3302序列測定結果序列長477個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥 嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-69、 C-136、 G-169、 T_103。本發明所涉及的fir-4基因來自秀麗隱桿線蟲，本發明的一個實施例中提供了一種秀 麗隱桿線蟲flr-4基因的核苷酸序列及其制備方法，該方法是以秀麗隱桿線蟲基因組DNA 為模板，用特異性寡核苷酸引物，經PCR方法得到。秀麗隱桿線蟲購于DSMZ，基因測序結 果表明flr-4由1713個核苷酸組成，5'端至3'端序列為秀麗隱桿線蟲flr-4基因的核苷酸序列(SEQ ID No. 7)GAGTCGTCTGGACCAGCAAATG線MAACTAG該基因編碼的蛋白氨基酸序列為
秀麗隱桿線蟲flr-4基因的氨基酸序列(SEQ ID No. 8)
ESSGPANEEN
本發明涉及的RPF蛋白分子量為37.38kD，等電點為6.454，富含亮氨酸、異亮氨酸和絲氨酸。
在本發明的一個實施例中提供了一種秀麗隱桿線蟲flr-4基因的制備的方法，該方、7去包括擴增引物合成，秀麗隱桿線蟲基因組DNA的提取，目的基因的PCR擴增，目的基因片段的回收。
(1) 擴增引物合成根據GenBank中已經發表的秀麗隱桿線蟲的flr_4基因序列設計PCR寡核苷酸擴增引物。上游引物 (E-F ):ggaggatctggaggatctggaggatctggaggatctATGCCAATAAATTACAAT (下劃線處為GGS鏈)，下游引物(E-R): CTGTCTAGACTAGTTTTCTTCATTTGC (下劃線處為內切酶Xbal位點)。
(2) 秀麗隱桿線蟲的洗脫及總RNA的提取采用M9緩沖液將蟲體洗下，置4匸20min，棄上清，沉淀物用M9緩沖液重懸后4°C 20 min，棄上清，用lml針筒，26-G號
(6#)針頭抽吸沉淀物15 20次以剪切基因組DNA，然后直接從針筒中將樣品轉移到無菌1.5-ml離心管中，加入lOOpl氯仿/異戊醇(24: l)或氯仿，劇烈振蕩混勻30s，臺式離心機上，12000 rpm，室溫離心5 min，將上清液小心轉移到RNase-free 1.5-ml離心管里，加入等體積的異丙醇，室溫下放置5min，將上述溶液全部轉移到套放于2ml收集管內的UNIQ-10柱中，室溫放置2min， 8000 rpm室溫離心1 min，小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，加入450 ul RPE Solution, 10000 rpm室溫離心30 S，重復一次，小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，10000室溫離心15 S，小心取出柱子，放入無菌RNase-free的1.5-ml離心管里，在柱內膜的中央小心加入50 ul DEPC-H20， 55°C放置2 min， 10000 rpm室溫離心1 min。收集管內的溶液為RNA樣品，置-2(TC保存。
9(3) 線蟲RNA的反轉錄使用TaKaRa的PrimeScript RT隱PCR Kit,首先用PrimeScript RTase將RNA合成cDNA，再取反應液的一部分作為模板，由TaKaRa Ex TaqTMHS進行PCR擴增。將RNA反轉錄成cDNA的弓|物使用Random 6 mers、 Oligo dT Primer下游引物。反轉錄體系為dNTP Mixture (10 mM each) 1 ul， Oligo dT Primer (2.5 pM) 1 ul，Template RNA8 ul，變性退火反應條件為65°C 5 min。反轉錄反應體系為變性、退火后反應液10 ul， 5xPrimeScript Buffer4 ul，脂ase Inhibitor(40 U/pl)0.5 ul.， PrimeScript RTase
(for 2 Step) 0.5 ul， RNase Free dH205 ul，總體積20 ul。反應條件為42°C30 min， 95 °C5min。
(4) 目的基因的PCR擴增反應參數為95t:預變性5分鐘；95。C變性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸30秒，30個循環，72。C再延伸10分鐘。
(5) 目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書回收目的基因片段。
(6) 目的基因片段克隆入載體回收的PCR產物與T載體連接，轉化感受態細胞大腸桿菌(E.coli) JM109，挑取菌落快速提取質粒進行酶切鑒定，所得到的陽性克隆子是包括目的基因的大腸桿菌，用于基因的增殖和保藏。
(7) 序列測定提取質粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，測定引物為M13啟動子引物。fir-4序列測定結果序列長1713個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-530、 C-333、 G_352、 T-498。
本發明的一個實施例中提供了一種構建融合穿梭表達載體pJRD215-PT-rcf的方法。該方法包括(1)以C-F和E-R為引物，以cc3302和flr-4為模板擴增得到PCR產物cc3302-flr-4; (2)以rpf和cc3302-flr-4為模板，以B-F和E-R為引物擴增得到rpf-cc3302-flr-4; (3)回收rpf-cc3302-fir-4片段并克隆至pMD18-T載體；(4)重組穿梭表達載體pJRD215-PT-rcf的構建。
其步驟如下
(1) cc3302-flr-4的PCR擴增以含有cc3302基因的T載體質粒和含有flr-4基因的T載體質粒為模板，以C-F和E-R為引物，反應參數為95"C預變性5分鐘；95°。變性30秒，68。C退火30秒，72。C延伸60秒，30個循環，72。C再延伸10分鐘。
(2) PCR產物克隆至T載體回收cc3302-flr-4基因片段，并克隆于pMD18-T載體，將該重組載體(pMD18-T-cs)轉入大腸桿菌JM109中。
(3) rpf-cc3302-flr-4的PCR擴增以含有rpf基因的T載體質粒和含有pMD18-T-cs基因的T載體質粒為模板，以B-F和E-R為引物擴增得到rpf-cc3302-flr-4。
(4) PCR產物克隆至T載體回收rpf-cc3302-flr-4基因片段，并克隆于pMD18-T載體，將該重組載體(pMD18-T-rcf)轉入大腸桿菌JM109中。
(5) 重組穿梭表達載體pJRD215-PT-rcf的構建a. 穿梭表達質粒的線性化及回收提取穿梭表達質粒pJRD215-PT，用Kpnl和Xbal 雙酶切成線性，
b. pMD18-T-rcf的線性化及rpf-cc3302-flr-4的回收提取pMD18-T-rcf載體，用 Kpnl和Xbal雙酶切成線性，用0. 8%低熔點瓊脂糖膠電泳后回收rpf-cc3302-f lr-4片段， 回收按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書進行，回收的片段置-20。C保存備 用；
c. 連接回收的pJRD215-PT片段和rpf-cc3302-fir-4片段在.T4DNA連接酶的作用下 16°。過夜，以得到重組穿梭表達載體pJRD215-PT-rcf;
d. 轉化用CaCl2法制作感受態大腸桿菌S17-l，提取pJRD215-PT-rcf質粒，取100W 感受態大腸桿菌S17-1，加入1WpJRD215-PT-rcf質粒，按照分子克隆試驗指南的方法進 行轉化，挑取陽性克隆子S17-1 (pJRD215-PT-rcf)。
rpf-cc3302-flr-4的測序結果表明其由2931個核苷酸組成，5'端至3，端序列為
rpf-cc3302-f lr-4核苷酸序列(SEQ ID No. 9)
TCGGCCAGGAGCTCGTCCTGCCGCAGGCCggtggttcaggtggttcaggtggttcaggtggUcaATGTGGCGGTCGCCTGATGATTATTACTACGACGAGTCGTCTGGACCAGCAMTGMGA嵐CTAG 該基因編碼的蛋白氨基酸序列為
rpf-cc3302-flr-4編碼的氨基酸序列(SEQ ID No. 10)
麗YYDESSGPANEEN
本發明涉及的rpf-cc3302-flr-4蛋白分子量為106. 27kD，等電點為5. 89。
本發明的技術要點之三是氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株力ci力't力io6sci^iAs /erroojriofe/is QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)的構建。
12氧化亞鐵硫桿菌的性狀改良目前主要運用物理、化學方法誘變，.但是這些方法都有著 一個很大的缺陷，就是不能定向產生突變菌株且產生突變菌株的效率太低。運用基因工程 手段則可以定向對氧化亞鐵硫桿菌進行改造，并且改造效率大大提高。
本發明的 一 個實施例中提供了 一種氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株 JcJ'力'z^io/^w7J"s /erroo"V朋s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)的構建方法。該方、法是用 pJRD215-PT載體在氧化亞鐵硫桿菌QEY-6中融合表達rpf、 cc3302和fir-4基因，包括
(1)氧化亞鐵硫桿菌QEY-6和大腸桿菌S17-l (pJRD215-PT-rcf)的培養；(2)接合轉移；
(3)陽性克隆篩選。
其步驟如下
(1) 氧化亞鐵硫桿菌QEY-6和大腸桿菌S17-1 (pJRD215-PT-rcf)的培養氧化亞鐵 硫桿菌用9K液體培養基培養，大腸桿菌用LB液體培養基培養；
(2) 接合轉移大腸桿菌培養至對數生長末期，離心集菌后用接合培養基基礎鹽液 洗滌3次，用該溶液稀釋至2X107mL，氧化亞鐵硫桿菌QEY-6培養至穩定期，100Xg的 速度離心去除鐵離子沉淀，離心集菌后再用接合培養基基礎鹽液洗滌3次，用該溶液稀釋 至2X107mL，將二者按l: l的比例混合，將O. lmL混合細菌轉至已鋪在接合培養基上的 0.45Mm的濾膜上，30。C培養60小時，將濾膜轉至3mL2: 2固體培養基的基礎鹽液中，鋪 在加入了 30(^g/mL卡拉霉素的2: 2選擇培養基平板上，3(TC培養；
(3) 陽性克隆篩選挑取單克隆用加有300化/mL卡拉霉素的2: 2液體培養基進行 擴增，培養至穩定期，100Xg的速度離心去除鐵離子沉淀，離心集菌后按照全式金公司的 EasyPure Plasmid MiniPr印Kit的說明書提取質粒，酶切鑒定。得到的陽性克隆即氧化 亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株Jcj'o^/w'o6acj7J"s /erroowVa/ s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf )。
本發明的技術要點之四是氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株^^0&Cj7JiAS
/erroojnW朋s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)在鈾礦浸出中的應用。
在本發明的一個實施例中提供了氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株^"'力'"io6sciJ勿s /errooxio^7s QEY-6 (pJRD215_PT-rcf)在鈾礦浸出中的應用的方法，并且進行了室內模 擬試驗，結果表明本發明涉及的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株與野生菌株相比具有更高 耐鈾、耐氟能力，能較顯著地提高浸出率，縮短浸出周期，降低酸耗。這些都可以作為例 證說明本發明涉及的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株在氟含量較高鈾礦浸出中的用途。
一種基因工程菌株，氧化亞鐵硫桿菌^cjVit力j'oZ^ci^t/s /krroao'c/a/7s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏日期2009年7月20日， 保藏編號CCTCC M 209155。


附圖1: pQE30質粒的T5啟動子和T0終止子的PCR擴增結果
泳道l為T5啟動子PCR產物；泳道2為T0終止子PCR產物；泳道3為分子量標準附圖2: pJRD215-PT測序圖普及比對結果
附圖3:藤黃微球菌rpf基因PCR結果
泳道1為100-5000Marker;泳道2為rpf基因PCR產物
附圖4:新月柄桿菌cc3302基因PCR結果
泳道1為100-5000Marker;泳道2為cc3302基因PCR產物
附圖5:秀麗隱桿線蟲flr-4基因PCR結果
泳道1為100-6000Marker;泳道2為fir-4基因PCR產物
附圖6: rpf-cc3302-flr-4片段的PCR擴增結果
泳道1為rpf-cc3302-f lr-4片段的PCR產物；泳道2為100-5000Marker 附圖7:重組穿梭表達載體pJRD215-PT-rcf酶切鑒定結果
泳道1為重組穿梭表達載體pJRD215-PT-rcf用Kpnl和Xbal雙酶切的結果；泳道2為 500-15000Marker
附圖8:氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株Jw'力't/ j'o/^w'WtAS /erroowV朋s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)提取質粒酶切鑒定結果
泳道1為500-15000Marker ;泳道2為氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株 」ci力Y力"Z acj'"iAS /erroo;aV朋s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)提取質粒用Kpnl和Xbal雙 酶切鑒定結果
附圖9:氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株/errooo'c/朋s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)與野生氧化亞鐵硫桿菌耐鈾能力比較
附圖10:氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株^ci力Y/ io6acj7hs /erroo^V朋s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)與野生氧化亞鐵硫桿菌耐熱能力比較
附圖11:細菌柱浸工藝流程圖
附圖12:不同浸出組浸出率比較
附圖13:不同浸出組耗酸率比較
具體實施方法
下面結合附圖及實施例對本發明做進一步說明。
實施例1.具有表達能力的穿梭質粒pJRD215-PT的構建
(1) 擴增引物合成根據Qiagen公司提供的pQE30質粒序列設計PCR寡核苷酸擴增 引物。T5啟動子上游引物GGCGTCGACCTCGAGAAATCATAAAAAAT (下劃線處為內切酶Sail 位點)，下游引物TATCTAGA ACCCGGGGTACCGAGCTC (下劃線處為內切酶Xbal位點)。引物 由上海生工生物工程有限公司合成，經ULTRAPAGE純化。
(2) pJRD215和pQE30質粒的提取平板劃線培養過夜，挑取單克隆接種于液體培養 基中培養，集菌6mL后按照全式金公司的EasyPure Plasmid MiniPrep Kit的說明書提取質粒。將提到的質粒溶液儲存于-2(TC備用。
(3) T5啟動子和T0終止子的擴增反應體系為H204(mi，緩沖液5W， dNTP2W,上 游引物1W，下游引物1J4， LA TaqO. 5W， pQE30模板0. 5W，反應條件為94。C預變性5 分鐘；94。C變性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸30秒，30個循環，72。C再延伸IO分鐘， 結果見圖l。
(4) 目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書 回收目的基因片段，首先制作1.5%瓊脂糖回收膠，目的基因片段電泳，然后切下含目的基 因條帶的瓊脂糖膠塊，每lOOmg膠塊加入300WBuffer QG， 5(TC水浴10分鐘至膠塊完全 溶解，加入異丙醇(每100mg膠塊加入10014異丙醇)，將上訴液體加入到QIAquick spin column中，離心1分鐘，倒掉離心后液體，QIAquick spin column中力口入500MlBuffer QG， 離心1分鐘，倒掉離心后液體，加入750WBuffer PE，室溫放置5分鐘后離心1分鐘，倒 掉離心后液體，再離心1分鐘徹底去除Buffer PE，將QIAquick spin column放置在一個 新的1. 5mL離心管中，往QIAquick spin column中加入5(MBuffer EB，離心1分鐘，收 集離心液，儲存于-2(TC。
(5) 目的DNA片段克隆入載體pJRD215和TO使用Xbal、 EcoRI酶切回收后連接， 連接體系為T4DNA連接酶1W，連接緩沖液l14， pJRD215載體2f4， T0片段6W，總體積 IOW， 16。C連接過夜，取連接產物10W加入到感受態細胞大腸桿菌(E.coli)JM109 (全式 金產品)中，冰上放置30分鐘，42。C熱休克45秒，再置冰上2分鐘，加入SOC培養基500W， 37°C， 180rpm培養l小時，鋪卡拉霉素陽性平板，培養過夜，挑取菌落快速提取質粒進行 PCR鑒定，陽性克隆進行測序鑒定。上訴方法得到的載體pJRD215-P和T5用Sa11、 Xbal 酶切回收后連接。連接方法同上。再用同樣的轉化方法轉化感受態細胞大腸桿菌 (E.coli)JM109，挑取菌落快速提取質粒進行PCR鑒定和測序鑒定，所得到的陽性克隆子 是包含具有表達能力的穿梭質粒pJRD215-PT。
(6) 序列測定提取質粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，序列測定由北京擎科生 物工程有限公司完成，測序引物為M13啟動子引物。
測定結果見圖2，序列完全正確，成功插入了T5啟動子和T0終止子。 實施例2.藤黃微球菌rpf基因的PCR擴增
(1) 擴增引物合成根據GenBank中己經發表的藤黃微球菌的rpf基因序列設計PCR 寡核苷酸擴增引物。上游引物(B-F): ATCGGTACCATGGACACCATGACTCTC (下劃線處為內切 酶 Kpnl 位 點 ) ， 下 游 引 物 ( B-R ) : tgaaccacctgaaccacctgaaccacctgaaccaccGGCCTGCGGCAGGACGAG (下戈機處為GGS鏈)。弓| 物由上海生工生物工程有限公司合成，經ULTRAPAGE純化。
(2) 藤黃微球菌基因組DNA的提取藤黃微球菌在腦心固體平板上劃線培養后挑取 單克隆至2ml液體培養基中培養，離心集菌后用天根公司細菌基因組DNA抽提試劑盒說明 書提取基因組DNA。首先將向菌體沉淀中加入200 ix 1緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮，
15向管中加入20 Ul蛋白酶K溶液，混勻，向管中加入20 iil蛋白酶K溶液，混勻，簡 短離心以去除管蓋內壁的水珠。加220 ul無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，簡短離心以 去除管蓋內壁的水珠。將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放 入收集管中)，12,000 rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附 柱CB3中加入500 Pl緩沖液GD， 12,000 rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放 入收集管中。向吸附柱CB3中加入700 ul漂洗液PW， 12,000 rpm離心30秒，倒掉廢 液，吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500 ul漂洗液PW， 12,000 rpm 離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。將吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中 殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50-200 ul洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm離心2分鐘，將溶液收集 到離心管中。提到的基因組DNA儲存于-2(TC備用。
(3) 目的基因的PCR擴增反應體系為H2040W，緩沖液5Pl， dNTP2W，上游引物1W， 下游引物1W， LATaqO. 5Hl， pQE30模板0.5W，反應參數為95。C預變性5分鐘；95。C變 性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸40秒，30個循環，72。C再延伸IO分鐘，結果見圖3。
(4) 目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書回收 目的基因片段。首先制作1.0%瓊脂糖回收膠，目的基因片段電泳，然后切下含目的基因條 帶的瓊脂糖膠塊，每100mg膠塊加入300WBuffer QG， 5(TC水浴10分鐘至膠塊完全溶解， 加入異丙醇(每100mg膠塊加入異丙醇)，將上訴液體加入到QIAquick spin column 中，離心1分鐘，倒掉離心后液體，QIAquick spin column中加入500riBuffer QG，離 心1分鐘，倒掉離心后液體，加入750WBuffer PE，室溫放置5分鐘后離心1分鐘，倒掉 離心后液體，再離心1分鐘徹底去除Buffer PE，將QIAquick spin column放置在一個新 的1. 5mL離心管中，往QIAquick spin column中加入5(MBuffer EB，離心1分鐘，收集 離心液，儲存于-2(TC。
(5) 目的基因片段克隆入載體回收的PCR產物與pMD18-T載體連接，該載體購 自大連寶生物工程有限公司。反應體系為PCR產物5W， pMD18-T載體1^1， 10XT4DNA 連接酶緩沖液1W，去離子水2W，總體積為10W。 16"C連接過夜。取連接產物10W加入 到感受態細胞大腸桿菌(E.coli)JM109 (全式金產品)中，冰上放置30分鐘，42。C熱休克 45秒，再置冰上2分鐘，加入SOC培養基500W， 37°C， 180rpm培養1小時，取200W 菌液加入40W120mg/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及1M異丙基硫代 半乳糖苷(IPTG)混勻后涂含氨芐青霉素LB平板，培養過夜，挑取白色菌落快速提取質 粒進行PCR鑒定，陽性克隆進行測序鑒定。
(6) 序列測定提取質粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，測定引物為M13啟動子引 物。rpf序列測定結果序列長669個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥嘌 呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-99、 C-262、 G-223、 T-85。
16實施例3.新月柄桿菌cc3302基因的PCR擴增
(1) 擴增引物合成根據GenBank中已經發表的新月柄桿菌的cc3302基因序列設計 PCR寡核苷酸擴增引物。上游引物(C-F): ggtggttcaggtggttcaggtggttcaggtggttca ATGTGGCGGTCGCCTGTG (下劃線處為 GGS 鏈)，下游引物 (C-R ): agatcctccagatcctccagatcctccagatcctccATTACGCGTCATGACTGAG (下劃線處為GGS鏈)。引 物由上海生工生物工程有限公司合成，經ULTRAPAGE純化。
(2) 新月柄桿菌基因組DNA的提取新月柄桿菌在固體平板上劃線培養后挑取單克 隆至2ml液體培養基中培養，離心集菌后用天根公司細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提 取基因組DNA。首先將向菌體沉淀中加入200 ixl緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮，向管 中加入20 ul蛋白酶K溶液，混勻，向管中加入20 ill蛋白酶K溶液，混勻，簡短離 心以去除管蓋內壁的水珠。加220 iil無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，簡短離心以去除 管蓋內壁的水珠。將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收 集管中)，12, 000 rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3 中加入500 ul緩沖液GD， 12,000 rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集 管中。向吸附柱CB3中加入700 ul漂洗液PW， 12,000 rpm離心30秒，倒掉廢液，吸 附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500 漂洗液PW， 12,000 rpm離心30 秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。將吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm 離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘 余的漂洗液。將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50-200 Pl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm離心2分鐘，將溶液收集 到離心管中。目的基因的PCR擴增反應參數為95。C預變性5分鐘；95。C變性30秒，65 'C退火30秒，72C延伸30秒，30個循環，72。C再延伸10分鐘。提到的基因組DNA儲存 于-2(TC備用。
(3) 目的基因的PCR擴增反應體系為H2040W，緩沖液5Pl， dNTP2W，上游引物1W， 下游引物l14， LATaqO. 5W， pQE30模板0. 5W，反應參數為95。C予頁變性5分鐘；95。C變 性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸40秒，30個循環，72'C再延伸IO分鐘，結果見圖4。
(4) 目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書回收 目的基因片段。首先制作1.0%瓊脂糖回收膠，目的基因片段電泳，然后切下含目的基因條 帶的瓊脂糖膠塊，每100mg膠塊加入300WBuffer QG， 50'C水浴10分鐘至膠塊完全溶解， 加入異丙醇(每100mg膠塊加入異丙醇)，將上訴液體加入到QIAquick spin column 中，離心1分鐘，倒掉離心后液體，QIAquick spin column中加入500HlBuffer QG，離 心1分鐘，倒掉離心后液體，加入75(MBuffer PE，室溫放置5分鐘后離心1分鐘，倒掉 離心后液體，再離心1分鐘徹底去除Buffer PE，將QIAquick spin column放置在一個新 的1. 5mL離心管中，往QIAquick spin column中加入5CmiBuffer EB，離心1分鐘，收集 離心液，儲存于-2(TC。(4) 目的基因片段克隆入載體回收的PCR產物與pMD18-T載體連接，該載體購 自大連寶生物工程有限公司。反應體系為PCR產物5W， pMD18-T載體lW， 10XT4DNA 連接酶緩沖液1W，去離子水2W，總體積為10W。 16'C連接過夜。取連接產物10W加入 到感受態細胞大腸桿菌(E.coli)JM109 (全式金產品)中，冰上放置30分鐘，42t:熱休克 45秒，再置冰上2分鐘，加入SOC培養基500W， 37°C， 180rpm培養1小時，取200W 菌液加入4014120mg/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及扭IO. 1M異丙基硫代 半乳糖苷(IPTG)混勻后涂含氨芐青霉素LB平板，培養過夜，挑取白色菌落快速提取質 粒進行PCR鑒定，陽性克隆進行測序鑒定。
(5) 序列測定提取質粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，測定引物為M13啟動子引 物。cc3302序列測定結果序列長477個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥 嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-69、 C-136、 G_169、 T_103。
實施例4.秀麗隱桿線蟲f lr-4基因的PCR擴增
(1) 擴增引物合成根據GenBank中已經發表的秀麗隱桿線蟲的fir-4基因序列設 計PCR寡核苷酸擴增引物。上游弓l.物 (E-F ): ggaggatctgg觀gatctggaggatctggaggatctATGCCAATAAATTACAAT (下劃線處為GGS鏈)，下 游引物(E-R): CTGTCTAGACTAGTTTTCTTCATTTGC (下劃線處為內切酶Xbal位點)。
(2) 秀麗隱桿線蟲的洗脫及總RNA的提取采用M9緩沖液將蟲體洗下，置4"C20 min，棄上清，沉淀物用M9緩沖液重懸后4°C 20 min，棄上清，用lml針筒，26-G號
(6#)針頭抽吸沉淀物15 20次以剪切基因組DNA，然后直接從針筒中將樣品轉移到無 菌1.5-ml離心管中，加入100^1氯仿/異戊醇(24 : l)或氯仿，劇烈振蕩混勻30 s，臺式離 心機上，12000 rpm，室溫離心5 min，將上清液小心轉移到RNase-free 1.5-ml離心管里， 加入等體積的異丙醇，室溫下放置5min，將上述溶液全部轉移到套放于2 ml收集管內的 UNIQ-10柱中，室溫放置2min， 8000 rpm室溫離心1 min，小心取出柱子，棄去收集管 中的廢液，將柱子放回收集管中，加入450 ul RPE Solution, 10000 rpm室溫離心30 S， 重復一次，小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，10000室溫離心 15 S，小心取出柱子，放入無菌RNase-free的1.5-ml離心管里，在柱內膜的中央小心加 入50 ul DEPC-H20， 55°C放置2 min， 10000 rpm室溫離心1 min。收集管內的溶液為RNA 樣品，置-2(TC保存。
(3) 線蟲認A的反轉錄使用TaKaRa的PrimeScript RT-PCR Kit,首先用 PrimeScript RTase將RNA合成cDNA，再取反應液的一部分作為模板，由TaKaRa Ex T叫 TMHS進行PCR擴增。將RNA反轉錄成cDNA的引物使用Random 6 mers、01igo dT Primer 下游引物。反轉錄體系為dNTP Mixture (10 mM each) 1 ul， Oligo dT Primer (2.5 pM) 1 ul， Template RNA8 ul，變性退火反應條件為65°C 5 min。反轉錄反應體系為變性、退火后反 應液10 ul， 5xPrimeScriptTM Buffer4 ul，腦ase Inhibitor(40 U/pl)0.5 ul， PrimeScript RTase
(for 2 Step) 0.5 ul， RNase Free dH205 ul，總體積20 ul。反應條件為42°C30 min， 95°C5min。
(4) 目的基因的PCR擴增反應體系為H2040W，緩沖液5Pl， dNTP214，上游引物l以， 下游引物1W， LATaqO. 5W， pQE30模板0.5W，反應參數為95。C預變性5分鐘；95。C變 性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸30秒，30個循環，72。C再延伸IO分鐘，結果見圖5。
(5) 目的基因片段的回收按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書回收 目的基因片段。首先制作1.0%瓊脂糖回收膠，目的基因片段電泳，然后切下含目的基因條 帶的瓊脂糖膠塊，每lOOmg膠塊加入300WBuffer QG， 5(TC水浴10分鐘至膠塊完全溶解， 加入異丙醇(每100mg膠塊加入100)4異丙醇)，將上訴液體加入到QIAquick spin column 中，離心1分鐘，倒掉離心后液體，QIAquick spin column中加入500WBuffer QG，離 心1分鐘，倒掉離心后液體，加入750WBuffer PE，室溫放置5分鐘后離心1分鐘，倒掉 離心后液體，再離心1分鐘徹底去除Buffer PE，將QIAquick spin column放置在一個新 的1.5raL離心管中，往QIAquick spin column中加入50^1Buffer EB，離心1分鐘，收集 離心液，儲存于-2(TC。
(6) 目的基屈片段克隆入載體回收的PCR產物與pMD18-T載體連接，該載體購 自大連寶生物工程有限公司。反應體系為PCR產物5ri， pMD18-T載體lri， 10XT4DNA 連接酶緩沖液1W，去離子水3W，總體積為IOW。 16'C連接過夜。取連接產物10W加入 到感受態細胞大腸桿菌(E.coli)JM109 (全式金產品)中，冰上放置30分鐘，42。C熱休克 45秒，再置冰上2分鐘，加入SOC培養基50(￥1， 37。C， 180rpm培養1小時，取200W 菌液加入40W120mg/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及#10. 1M異丙基硫代 半乳糖苷(IPTG)混勻后涂含氨芐青霉素LB平板，培養過夜，挑取白色菌落快速提取質 粒進行PCR鑒定，陽性克隆進行測序鑒定。
(7) 序列測定提取質粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，測定引物為M13啟動子引 物。flr-4序列測定結果序列長270個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥 嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-106、 C-40、 G-58、 T-66。
實施例5.融合穿梭表達載體pJRD215-PT-rcf的構建方法
(1) cc3302-flr-4的PCR擴增以含有cc3302基因的T載體質粒和含有flr-4基因的 T載體質粒為模板，以C-F和D-R為引物，反應體系為H2040W，緩沖液5ri， dNTP2W， 上游引物1W，下游引物1W， LATaq0.5W，兩種模板各0.5W，反應參數為95"預變性 5分鐘；95。C變性30秒，68。C退火30秒，72'C延伸60秒，30個循環，72。C再延伸10分鐘。
(2) PCR產物克隆至T載體按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書 回收目的基因片段。首先制作0.8%瓊脂糖回收膠，目的基因片段電泳，然后切下含目的基 因條帶的瓊脂糖膠塊，每lOOmg膠塊加入300WBuffer QG， 5(TC水浴10分鐘至膠塊完全 溶解，加入異丙醇(每100mg膠塊加入異丙醇)，將上訴液體加入到QIAquick spin column中，離心1分鐘，倒掉離心后液體，QIAquick spin column中力口入5Q0l^lBuffer QG，
19離心1分鐘，倒掉離心后液體，加入750WBuffer PE，室溫放置5分鐘后離心1分鐘，倒 掉離心后液體，再離心1分鐘徹底去除Buffer PE，將QIAquick spin col咖n放置在一個 新的1.5mL離心管中，往QIAquick spin column中加入50WBuffer EB，離心1分鐘，收 集離心液。回收的PCR產物與pMD18-T載體連接，該載體購自大連寶生物工程有限公司。 反應體系為PCR產物5W， pMD18-T載體1RL， 10XT4DNA連接酶緩沖液1W，去離子水 314，總體積為l(mi。 16'C連接過夜。取連接產物加入到感受態細胞大腸桿菌 (E. coli) JM109 (全式金產品)中，冰上放置30分鐘，42"C熱休克45秒，再置冰上2分 鐘，加入SOC培養基500W， 37°C， 180rpm培養1小時，取200^1菌液加入40W120mg/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及扭IO. 1M異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混勻后 涂含氨芐青霉素LB平板，培養過夜，挑取白色菌落快速提取質粒進行PCR鑒定，陽性克 隆進行測序鑒定，測序正確的即pMD18-T-cs。
(3) rpf-cc3302-flr-4的PCR擴增以含有rpf基因的T載體質粒和含有pMD18-T-cs 基因的T載體質粒為模板，以B-F和E-R為引物擴增得到rpf-cc3302-flr-4。反應體系為 H2040W，緩沖液5^1， dNTP2W，上游引物1W，下游引物1W， LA TaqO. 5W，兩種模板 各0.5W，反應參數為95。C預變性5分鐘；95。C變性30秒，68。C退火30秒，72'C延伸90 秒，30個循環，72"C再延伸10分鐘，結果見圖6。
(4) PCR產物克隆至T載體按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書 回收目的基因片段。首先制作0.8%瓊脂糖回收膠，目的基因片段電泳，然后切下含目的基 因條帶的瓊脂糖膠塊，每lOOmg膠塊加入300WBuffer QG， 50'C水浴10分鐘至膠塊完全 溶解，加入異丙醇(每100mg膠塊加入異丙醇)，將上訴液體加入到QIAquick spin column中，離心1分鐘，倒掉離心后液體，QIAquick spin column中力口入500M"lBuffer QG， 離心1分鐘，倒掉離心后液體，加入750WBuffer PE，室溫放置5分鐘后離心1分鐘，倒 掉離心后液體，再離心1分鐘徹底去除Buffer PE，將QIAquick spin column放置在一個 新的1. 5mL離心管中，往QIAquick spin column中加入50WBuffer EB，離心1分鐘，收 集離心液。回收的PCR產物與pMD18-T載體連接，該載體購自大連寶生物工程有限公司。 反應體系為PCR產物5W， pMD18-T載體lW， 10XT4DNA連接酶緩沖液114，去離子水 3W，總體積為IOW。 16'C連接過夜。取連接產物10W加入到感受態細胞大腸桿菌 (E. coli) JM109 (全式金產品)中，冰上放置30分鐘，42。C熱休克45秒，再置冰上2分 鐘，加入SOC培養基500Hl， 37°C， 180rpm培養1小時，取200W菌液加入40W120mg/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及1M異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混勻后 涂含氨芐青霉素LB平板，培養過夜，挑取白色菌落快速提取質粒進行PCR鑒定，陽性克 隆進行測序鑒定，測序正確的即pMD18-T-rcf。
(5) 表達質粒的線性化及回收用全式金EasyPure Plasmid MiniPr印Kit提取穿 梭表達質粒pJRD215-PT。具體方法為取1-4 ml過夜培養的細菌10， OOOXg離心1分鐘， 盡量吸盡上清，加入250 u 1無色溶液RB (含RNase A)，震蕩懸浮細菌沉淀，加入250 p 1藍色溶液LB，溫和地上下翻轉混合4-6次，使菌體充分裂解，形成藍色透亮的溶液，加入 350 u 1黃色溶液NB，輕輕混合5-6次，15， 000Xg離心5分鐘，小心吸取上清加入吸附 柱中，15， 000Xg離心l分鐘，棄流出液，加入650 ul溶液WB， 15， 000Xg離心l分 鐘，棄流出液，15， 000Xg離心l分鐘，徹底去除殘留的WB，將吸附柱置于一干凈的離 心管中，在柱的中央加入30-50 ul EB，室溫靜置1分鐘，10， 000Xg離心l分鐘，、冼 脫DNA,洗脫出的DNA用Kpnl和Xbal雙酶切成線性。
(6) pMD18-T-rcf的線性化及rpf-cc3302-flr_4的回收提取pMD18-T-rcf載體， 方法同上，用Kpnl和Xbal雙酶切成線性，用0.8%低熔點瓊脂糖膠電泳后回收 rpf-cc3302-flr-4片段，回收按照Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit說明書進 行，回收的片段置-2(TC保存備用；
(7) 連接回收的pJRD215-PT片段和rpf-cc3302-fir-4片段在T4DNA連接酶的l乍 用下16。C過夜，反應體系為rpf-cc3302-flr-4片段5)4， pJRD215-PT片段2nl， 10XT4DNA 連接酶緩沖液l"l，去離子水2ri，總體積為IOW。以得到重組穿梭表達載體 pJRD215-PT-rcf。
(8) 轉化用CaC12法制作感受態大腸桿菌S17-1，提取pJRD215-PT-rcf質粒，取 100W感受態大腸桿菌S17-1，加入1WpJRD215-PT-rcf質粒，按照分子克隆試驗指南的 方法進行轉化，挑取克隆進行酶切鑒定，鑒定正確的即S17-1 (pJRD215-PT-rcf)，酶切鑒 定結果見圖7。
實施例6.氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株Jcic/"力yo6acj77i/s /e/rooaVa/^ QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)的構建
(1) 氧化亞鐵硫桿菌QEY-6和大腸桿菌S17-1 (pJRD215-PT-rcf)的培養氧化亞f失 硫桿菌用9K液體培養基培養，大腸桿菌用LB液體培養基培養；
(2) 接合轉移大腸桿菌培養至對數生長末期，離心集菌后用接合培養基基礎鹽液 洗滌3次，用該溶液稀釋至2X1010/mL，氧化亞鐵硫桿菌QEY-6培養至穩定期，100 Xg 的速度離心去除鐵離子沉淀，離心集菌后再用接合培養基基礎鹽液洗滌3次，用該溶液稀 釋至2X1010/mL，將二者按l: l的比例混合，將O. lmL混合細菌轉至已鋪在接合培養基 上的0. 45,的濾膜上，3(TC培養60小時，將濾膜轉至3mL2: 2固體培養基的基礎鹽液中， 鋪在加入了 300Mg/mL卡拉霉素的2: 2選擇培養基平板上，3(TC培養；
(3) 陽性克隆篩選挑取單克隆用加有3CK^g/mL卡拉霉素的2: 2液體培養基進行 擴增，培養至穩定期，100Xg的速度離心去除鐵離子沉淀，離心集菌后按照全式金公司的 EasyPure Plasmid MiniPr印Kit的說明書提取質粒，酶切鑒定。得到的陽性克隆即氧4七 亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株Acidithiobacillus ferrooxidans QEY-6 (pJRD215-PT-rcf )。 酶切鑒定結果見圖8。 -
實施例7.氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株/errooyjVs/7s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)在鈾礦浸出中的應用
21(1)氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株力c^/j't力j'o6sci"〃s /erroonV朋s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)耐氟性能研究
將基因工程菌QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)和野生菌QEY-6按照10%接種量接種到含不 同氟離子濃度(50-100 mg/L)的9K培養基中，30°C， 200rpm培養，用重鉻酸鉀容量、 去測 定亞鐵量的方法檢測溶液中亞鐵離子濃度變化，以亞鐵離子濃度變為零作為氧化亞鐵i^桿 菌生長完成的時間，具體方法為用移液槍準確移取lmL待測溶液置于150mL三角燒并瓦 中，加入25mL硫酸-磷酸混合溶液，加49mL蒸餾水，滴加2滴二苯胺磺酸鈉，用適當濃 度的重鉻酸鉀溶液滴定至溶液呈穩定的紫紅色即為終點。
試驗結果基因工程菌QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)在含60-80mg/L的培養基中4天可 以完成生長，在含90mg/L的培養基中6天可以完成生長，在100mg/L時生長時間為7天。 而野生菌QEY-6在含50mg/L的培養基中需要10天。說明經過基因工程改造后氧化亞鐵^！ 桿菌的耐鈾性能大大提高。
(2) 氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株A^Wi^^'o/73Cj7J"s /ezroo"V朋s QEY—6 (pJRD215-PT-rcf)耐鈾性能研究
將基因工程菌QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)和野生菌QEY-6按照10%接種量接種到含不 同金屬鈾離子濃度(600mg/L， 700mg/L， 800mg/L， 900mg/L)的9K培養基中，30°C， 200rpm培養，用重鉻酸鉀容量法測定亞鐵量的方法檢測溶液中亞鐵離子濃度變化，以亞 鐵離子濃度變為零作為氧化亞鐵硫桿菌生長完成的時間，具體方法為用移液槍準確移取 lmL待測溶液置于150mL三角燒瓶中，加入25mL硫酸-磷酸混合溶液，加49mL蒸t留7乂， 滴加2滴二苯胺磺酸鈉，用適當濃度的重鉻酸鉀溶液滴定至溶液呈穩定的紫紅色即為^"點。
試驗結果基因工程菌QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)在含600mg/L的培養基中2天可以 完成生長，而野生菌QEY-6需要10天。而在700 mg/L、 800 mg/L、 900 mg/L的培養基中， 基因工程菌QEY-6 (pJRD215-PT-rcs)的培養時間均為4天，野生菌QEY-6則分別需要14、 17和30天。說明經過基因工程改造后氧化亞鐵硫桿菌的耐鈾性能大大提高。
(3) 氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株/erroowW朋s QEY-6 (pJRD215-PT-rcf)在鈾礦浸出中的應用
a. 試驗柱以及恒流泵準備
浸出柱OlOOmmXlOOOmm有機玻璃柱。
離子交換柱①50mmX1000mm有機玻璃柱，離子交換樹脂為D263。 恒流泵HL-1。
b. 礦石的加工與處理
① 礦石破碎用PE-50型顎式破碎機將礦石破碎到較合適的粒度。
② 礦石過篩用孔徑為10mm和7mm的篩子將破碎的礦石過篩，取粒徑為7-10mm 的礦石。
③ 礦樣縮分將礦樣烘干自然冷卻后混勻，運用錐堆四分法將礦樣縮分到實驗所需的重量的1.5倍，為22.5kg。
④ 礦石分析取備用樣測定礦石品位，為0.134%,氟含量為2.05%。
⑤ 稱取礦樣稱取15kg制備好的礦樣裝柱。在裝柱的過程中由下向上依次加入30mm 鵝卵石、30mm石英沙、礦石。
c.試驗工藝流程
布液方式恒流泵控制噴淋。布液制度間歇式噴淋噴停比為2: 1;液固比3: 1;
布液強度15L/ (m2.h)。見圖11。設置野生氧化硫桿菌浸出、氧化亞鐵硫桿菌基因 工程菌菌株Jcit/i^ io6sciW"s /erroo"V朋sQEY-6 (pJRD215-PT-rcf )浸出和酸浸三組。 細菌浸鈾包括酸預浸和菌浸兩個階段，其中酸預浸時間為16天。酸預浸階段淋浸礦石戶萬 產生的酸化液和菌浸
階段淋浸礦石所產生的菌浸液，經離子交換柱吸附鈾后，產生的吸附尾液用于培養細 菌,培養的菌液再用于淋浸礦石。酸浸液起始pH值為0.75。菌浸液起始pH值為1.8，控制 流出液pH值為2.0左右，菌浸液三價鐵濃度為5g/L。
d.試驗結果試驗結果見表l。
表1不同浸出組浸出參數
浸出方式總耗酸率(％)液固比溶浸周期(天)累計液計浸出率(％)
酸浸5.033: 13887. 5
野生菌浸出4. 653: 138(酸化時間8天)89. 6
工程菌浸出4. 013: 138(酸化時間8天)93.4
浸出率結果見圖12。耗酸率見圖13。
由以上結果可見，工程菌的鈾浸出率可達93.4%，與酸浸相比高出5.9個百分點比野 生菌也高出3.8個百分點。工程菌的總耗酸率為4.01%，比酸浸降低1.02%，比野生菌的 耗酸率相比也降低了 0.64%。如果以87%作為浸出終點，那么，酸浸需要35天，野生氧化 亞鐵硫桿菌需要33天，基因工程菌株只需要22天。
23SEQUENCE LISTING No. 1
<110>南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室
〈120〉 一種生長速度快且耐鈾和耐熱能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用 <130> T5啟動子的核苷酸序列 <160> 1
<170> Patentln version 3. 3
<210〉 1
〈211〉 123
〈212〉 腿
<213> plasmid
<400> 1
tctagataat tagctgagct tggactcctg ttgatagatc cagtaatgac ctcagaactc 60 catctggatt tgttcagaac gctcggttgc cgccgggcgt tttttattgg tgagaatgaa 120 ttc 123
SEQUENCE LISTING No. 2
<110〉南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室
<120> —種生長速度快且耐鈾和耐熱能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用 〈130〉 TO終止子的核苷酸序列 〈160〉 1
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
<211> 123
<212〉 誰
<213> plasmid
〈400〉 1
tctagataat tagctgagct tggactcctg ttgatagatc cagtaatgac ctcagaactc 60 catctggatt tgttcagaac gctcggttgc cgccgggcgt tttttattgg tgagaatgaa 120 Uc 123
SEQUENCE LISTING No. 3
〈110〉南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室〈120〉 一種生長速度快且耐鈾和耐熱能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用
<130〉藤黃微球菌rpf基因的核苷酸序列
〈160〉1
<170〉Patentln version 3.3
〈210〉1
〈211〉669
〈212〉DNA
<213〉Micrococcus luteus
〈400〉1
atggacacca tgactctcttcaccacttccgccacccgctcccgccgtgccaccgcctcg60
atcgtcgcgg gcatgaccctcgccggcgccgccgccgtgggcttctccgccccggcccag120
gccgccaccg tggacacctgggaccgcctcgCCg￡LgtgCgagtccaacggC￡LCCtgggaC180
ettcaacaccg gcaacggcttctacggcggcgtgcagttcaccctgtcctcctggc鄉cc240
gtcggcggcg a^ggct8cccgcaccaggcctcga^ggccgagcagatcaagcgcgccgsg300
atcctccagg acctgc鄉g ctggggcgcgtggccgctgtgctcgc兆aagctgggcctg360
acccaggctg scgcggacgccggtgacgtggscgccaccgaggccgccccggtcgccgtg420
gagcgcacgg ccaccgtgcagcgccagtccgccgcggacg郷ctgccgcCg兆C3ggCC480
gctgccgcgg agcaggccgtcgtcgccgaggccg8gaxx3tcgtcgtcaagtccggtgac540
tccctctgga cgctcgccaa cgagtacgaggtggagggtggctggaccgccctctacgag600
gccaacaagg gcgccgtctccgacgccgccgtgatctacgtcggccaggagctcgtcctg660
ccgcaggcc669
SEQUENCE LISTING No. 4
<110>南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室 <120> —種生長速度快且耐鈾和耐熱能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用
<130>藤黃微球菌rpf基因的氨基酸序列
<160>1
<170>Patentln version 3. 3
<210>1
<211>223
<212>PRT
〈213〉Micrococcus luteus
<400>1
Met Asp Thr Met Thr Leu Phe Thr Thr Ser Ala Thr Arg Ser Arg Arg
15 10 15
Ala Thr Ala Ser lie Val Ala Gly Met Thr Leu Ala Gly Ala Ala Ala20
Ser Ala Pro Ala
Val Gly Phe 35
Arg Leu Ala Glu Cys Glu 50
Asn Gly Phe Tyr Gly 65
Val Gly Gly Glu
25
Ala Ala Thr Val
Gin 40
Asn Gly Thr Trp
Ser 55
Val Gin Phe Thr
Gly 70
Tyr Pro His Gin
Lys Arg Leu Cys
Gly 85
lie Leu Gin Asp
Ala Glu 100
Gin Lys Leu Gly
Ser 115
Asp Ala Thr Glu
Leu 105 Thr
Asp Val 130
Thr Val Gin Arg Gin 145
Ala Ala Ala Glu
Ala 135
Ala Ala Asp Glu
Lys Ser
Gly Gly
Ala Ala 210
Gly
Trp 195 Val
Gin 165 Ser
Ser 150
Ala Val Val Ala
Asp 45 lie
30 Thr
Trp
Asp
Asn Thr Gly
Leu 75 Ser
Asp 60
Ser Ser Trp Gin
Ala 90
Gin Gly Trp Gly
Lys Trp
Gin Ala Asp
Ala Glu Gin 95 Trp
Ala
80
lie
Pro
Leu 120
Ala Pro Val Ala
Val 140 Ala
Ala 125 Glu
Ala 110
Asp Ala Gly
Ala 155
Ala Glu Thr lie
Arg Thr Ala Ala Glu Gin
Asp 180
Thr Ala Leu lie Tyr Val
Leu Trp Thr
Trp
Tyr
Gly 215
Glu 170
Ala Asn Glu Tyr
Leu 185
Ala Asn Lys Gly
Val 175 Val
Ala 160 Val
Glu
Glu 200
Gin Glu Leu Val
Glu 190
Val Ser Asp
Leu 220
Ala 205
Pro Gin Ala
SEQUENCE LISTING No. 5
<110>南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室
<120> —種生長速度快且耐鈾和耐熱能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用 <130>新月柄桿菌cc3302基因的核苷酸序列 <160> 1
<170〉 Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 477 〈212〉 DNA
<213> Caulobacter crescentus
26<400> 1
8tgtggCggtcgcctgtgcgatcactgcgcggcgagctcgaccgtcgtggcccgctttgc60
ctggstcagggccttgcgctggggcttggscagttggcgctcggcttcgcgttggacttc120
cacgcggcactggccgaacgacatatccagggtgttgttgcgcagcttcgcgcggc卿g180
cgtctcgccagcttgctggscgcgggccttg犯c犯ggcggcctgggcggggttcgscag240
gttcaggtceigacactgcaatgctcacgcgcgggtcgctctcggaggcgttggcggcttg300
cgtcaggcccaggaccggcaCggCggCg8ggctcagggtggcgatcggtggtcaggctcat360
gatgaacttggtatccctctggctgggcgctgttcgctgcgccgatgaat420
attggatacattcgggttctcgcgaagtctcgttacacctcagtcatgacgcgt犯t477
SEQUENCE LISTING No, 6
<110>南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室 <120〉 一種生長速度快且耐鈾和耐熱能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用
<130>新月柄桿菌cc3302基因的氨基酸序列
<160〉1
〈170〉Pateirtlnversion 3. 3
<210>1
<211>159
<212>PRT
〈213〉Caulobacter crescentus
〈400〉1
Met TrpArgSerProVal Arg SerLeuArgGlyGluLeuAspArgArg
151015
Gly ProLeuCysLeuAsp Gin GlyLeuAlaLeuGlyLeuGlyGinLeu
202530
Ala LeuGlyPheAlaLeu Asp PheHisAlaAlaLeuAlaGluArgHis
354045
lie GinGlyValValAla Gin LeuArgAlaAlaGluArgLeuAlaSer
505560
Leu LeuAspAlaGlyLeu Glu GinGlyGlyLeuGlyGlyValArgGin
65707580
Val GinValArgHisCys Asn AlaHisAlaArgValAlaLeuGlyGly
859095
Val GlyGlyLeuArgGin Ala GinAspArgHisGlyGlyGluAlaGin
100105110
Gly GlyAspGlyGlyGin Ala HisAspGluLeuAlaHisLeuLysTyr115 120 125
Pro Ser Gly Trp Ala Leu Phe Ala Ala Pro Met Asn lie Gly Tyr lie
130 135 140
Arg Val Leu Ala Lys Ser Arg Tyr Thr Ser Val Met Thr Arg Asn 145 150 155
SEQUENCE LISTING No. 7
<110〉南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室
<120〉 一種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用 <130>秀麗隱桿線蟲fir-4基因的核苷酸序列 〈160> 1
<170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211〉 1713 〈212〉 DNA
<213〉 Caenorhabditis elegans <400〉 1
atgccaata3aaatgcggttgagttaaagttaagctcccagcttttgC3a60
tggctggatcaacgattacctctgggtgatcctatgagaattccatctettgattcttat120
aaatatattcaagatttaggUtggaacggtttgcaagttttccaacggc180
aLaLcacatttgt taacaatattcaatcattgg￡LCeLC6Lg3gt240
tttcgaacaggCtgg￡LC￡LCatttttatacgaatttcgccatttgcataaa300
gtga^ceiaatgataataatcgtttttaggaatctatgcagactccaatcaa360
tgtctgaatatttaccacgtgggtCtgtg￡Laggatctgttagtgaaagaa420
肌gatactgccattaagtattt^tggagactgtcg犯gccctagactat480
cttcacaatttgagtccaccagtcattcatcgtgac3tcaaagcagccaacttactgatc540
3Cgtcgaacgtttgggctcgtacgtgatct600
ggattcggtatagcgetttgcctctga^atcactttageittttcgsgcgsctcttttatac660
gtggctcctgaggttctgagcagtgcgcttggtcc鄉aaaccgaaatgcctatgagct3720
ccggcsigacatttgggctctgggatgtacgttcattgaaaacgtccacca780
cactttga_gtatttcgggcattctacttggatatgcgaag840
gga^gtactgccttacacttccgaagtcttggttccttcttcttcaaac900
tgtgttcagatctggtgtttattaaatctccggagcatcgac c aaac ac c960
cacaagcttcctcgatgatgactcggaaa^gcgaagaag肌1020
gtcatcctattagtaatagcgttc犯cggcaatttcaca/t1080
aatcactcaa3gttgg￡LCg3gctggaacttgcctacccattgaaagtalg1140gagtatgc3gaaccgaagagcaataatatt1200
ttgtggc卿cgggtactacctctcaaggatattatactttttgaacatt1260
ctcacacgatccatatgctatctcctgctctttttatcattgggcatcacggcacttggc1320
tctttcttgctaatttcttactttgttgtcCg3tttgt3Cgctatctgattgcaatcaac1380
tgca^ctgtgatcttatgcagcctxagtatttgatcatttcggggattttg由gtgctg1440
a^tgtttgcgctcttgttcagttgctgtatggttgctcttggagaatacaa atttcggatg1500
gca^cc犯3ctttggatggttctaaattctacttaccccgcccccaaaa gtcagcagtc1560
ctatgcggcat犯ctgt糾aactggte肌gaagatgccaaagacax;tgctcagaacatg■1620
tacatctaacaccctctgtcatgatgattattactacgac1680
gagtcgtctggaccagcaaatag1713
SEQUENCE LISTING No. 8
〈110〉南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室
〈120〉 一種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用 <130>秀麗隱桿線蟲flr-4基因的氨基酸序列 <160〉 1
<170> Patentln version 3. 3 <210> 1 〈211〉 570 <212> PRT
<213> Caenorhabditis eleg肌s 〈400〉 1
lie Asn Tyr Asn Arg Asn Ala
Met Pro 1
Gin Leu
5
Trp Leu Asp Gin
Leu Gin 20
Ser lie Asp Ser
Val Glu Leu Lys Leu Ser Ser 10 15 Leu Pro Leu Gly Asp Pro Met
Arg lie Pro 35
Phe Gly Thr Val
Arg 25
Lys Tyr lie Gin
Gly Arg 50
Thr Val Lys Lys Val 65
Glu Thr Lys Val
Tyr 40
Lys Phe Ser
Cys 55
Leu Thr lie Phe
Asp 30
Asp Leu Gly Lys 45
Asn Thr Phe Glu
Asp 70
Asn Arg Leu Asp
His Leu His Lys 100
Ser 85
Val Thr Asn Asp
Asn Gly 60
Asn His Trp Thr Gin 75
Phe Leu Tyr Glu
Asn 105
Thr 90
Asn Arg lie Val
Asn 110
Phe 95 Phe
Ser
80
Arg
Leu
29Gly lie Tyr Ala A印Ser Asn Gin Met Tyr lie Met Ser Glu
125 Thr
Tyr 115
Gly Ser Veil Lys
Pro Arg 130
Asp Thr Ala lie Lys 145
Leu His Asn Leu
Asp 135 Leu
Gin 120
Leu Leu Val
Leu
Tyr 150
Pro Pro Val lie
Ser 165
Thr Ser Asn Asp
Lys Glu 140
Met Glu Thr Val Glu Ala Leu 155
Arg Asp lie Lys
Asn Leu Leu lie 180
Asp Leu Ala Val
Leu Val Arg 195
Thr Leu Asp Phe
Ser 185 Gly
His 170 lie
Phe
Glu lie 210
Val Leu Ser Ser Ala 225
Pro Ala Asp lie
Lys Arg Lys Val
Pro
Trp 245 His
Leu 230 Ala
Arg 215 Gly
Leu
Asp 200
Ala Thr Leu Pro Gly Asn
Lys Leu Gly lie
Ala
Tyr Leu
Gly Glu
Asp Tyr 160 Ala Ala 175
Phe Gly
Asn 190
lie Ala Ser
Gly
Phe Glu Tyr
Gly Cys
Leu Tyr 220
Arg Asn Ala Tyr 235
Phe lie Glu Met
Ala 205
Val Ala Pro Glu
Pro 260
Leu Gly Tyr Ala
Thr 250
Gly His lie Asp
Leu 275
Ser Glu Val Leu
Phe 265
Ser Glu Asp Gly
Glu Leu 240 Leu Leu 255
lie Pro
Tyr Thr 290
lie Val Asp Leu Val 305
His Lys Leu Arg
Phe 310 Gin
lie 325
Thr Asp lie Ser
Lys 280
Pro Ser Ser Ser Asn 300
Lys Ser Pro Glu His 315
Lys Lys lie Leu Asp
Glu 270
Val Leu Pro
Val 295 lie
lie Lys Lys
Lys 285
Cys Val Gin Lys
Arg Asp
Ser Glu Glu Glu 340
Thr Ala lie Ser
lie 330
Pro lie Ser Asn
Asp Ser Ser 355
Ala Gly Thr Cys
His 345
Asn His Ser Asn
Gly Arg 370
Val Arg Lys Glu Leu 385
Met Gin lie Phe Val 405Lys 390 Ala
Leu 375 Lys
Ser
His 360
Pro lie Glu
Asp 365 Glu
Pro
Asp
Ser 350 Arg
Tyr
Ser Met 380
Arg Ser Lys Pro Lys Ser Asn 395
Gly Tyr Tyr Leu Ser Arg lie 410
Asn Thr 320 Ser Glu 335
Asn Thr
Lys Val
Ala Ala
Asn lie 400 Leu Tyr 415Phe Leu Asn lie Leu Thr Arg Ser lie Cys Tyr Leu Leu Leu Phe Leu
420 425 430
Ser Leu Gly lie Thr Ala Leu Gly Ser Phe Leu Leu lie Ser Tyr Phe
435 440 445
Val Val Arg Phe Val Arg Tyr Leu lie Ala lie Asn Cys Asn Cys Asp
450 455 460
Leu Met Gin Pro Gin Tyr Leu lie lie Ser Gly lie Leu lie Val Leu 465 470 475 480
Met Phe Ala Leu Leu Phe Ser Cys Cys Met Val Ala Leu Gly Glu Tyr
485 490 495
Lys Phe Arg Met Ala Asn Gin Thr Leu Asp Gly Ser Lys Phe Tyr Leu
500 505 510
Pro Arg Pro Gin Lys Ser Ala Val Leu Cys Gly lie Thr Val lie Thr
515 520 525
Gly Lys Glu Asp Ala Lys Asp Thr Ala Gin Asn Met Glu Glu Glu lie
530 535 540
His Leu Thr Pro Ser Val Arg Arg Asn His Asp Asp Tyr Tyr Tyr Asp 545 550 555 560
Glu Ser Ser Gly Pro Ala Asn Glu Glu Asn 565 570
SEQUENCE LISTING No. 9
〈110〉南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室
<120〉 一種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用 <130〉 rpf-cc3302-fir-4核苷酸序列 <160> 1
〈170〉 Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 2931
<212> ■
<213> plasmid
〈400〉 1
atggacacca tgactctctt caccacttcc gccacccgct cccgccgtgc caccgcctcg 60 atcgtcgcgg gcatgaccct cgccggcgcc gccgccgtgg gcttctccgc cccggcccag 120 gccgccaccg tggacacctg ggaccgcctc gccgagtgcg agtccaacgg cacctgggac 180 atcaacaccg gcaacggctt ctacggcggc gtgcagttca ccctgtcctc ctggcaggcc 240
31gtcggcggcgaaggctacccgcaccaggcctcg犯ggccgagcagatceLagcgcgccgag ■300
atcctccaggacctgc鄉gctggggcgcgtggccgctgtgctcgcagaagctgggcctg360
acccaggctgacgcggacgccggtg已cgtggacgccaccgaggccgccccggtcgccgtg420
gagcgcacggccaccgtgcagcgccagtccgccgcggscg鄉ctgccgccgagcaggcc480
gctgccgcggagcaggccgtcgtcgccgaggccgagaccatcgtcgtcaagtccggtgac540
tccctctggacgctcgccaacgagtscgaggtgg兆ggtggctggaccgccctctacgag600
gcc肌c犯gggcgccgtctccgacgccgccgtgatctacgtCggCCELggeigctcgtcctg660
ccgcaggccggtggttc郷tggttc鄉tggttc郷tggttcaatgtggcggtcgcct720
gtgcgatcactgcgcggcgagctcgaccgtcgtagcccgctttgcctggatcagggcctt780
gcgctggggcttggacagttggcgctcggcttcgcgttggacttccacgcgg匿tggcc840
gaacgacatatccagggtgttgttgcgcagcttcgcgcggcagagcgtctcgccggcttg900
ctggacgcgggccttg犯ragggcggcctgggcggggttcggtcaga_cac960
tgcaatgctcacgcgcgggtcgctctcggaggcgttggcggcttgcgtcaggCCC￡LggaC1020
cggcacggcggcgaggctcagggtggcgeLCggtggtc郷C"tC3tg￡Ltgaacttgcgcat1080
cctctggctgggcgctgttcgctgcgccgatgaatattggatacattcgg1140
gttctcgcgaagtctcgttacacctcagtcatg￡LCgCgt￡L"ggtggttc1200
ggtggttcaggtggttcaattacaatcga^atgcggttga1260
agctcccagcttttgcaatggctgg已tcaacgattacctctgggtgatcc1320
ccatctattg3ttCtta_t3￡Latatattc aa朋ggtgtgeitttgg犯cggtt1380
tgcaagttttccaacggcaacacaLtttgagacagtgaaaaaagttgattt1440
cacagagtgatcgaacaggctggacacatttttatacgaa1500
tttcgccatttgc3taa3gtaataatcgaatcgtgsacttttt3gg33tC1560
tatgcagactc c aat c aaatgtatataatgtctgaatatttaccacgtgggtctgtgaag1620
gatctgttagtgaaaga肌cgctegg卿eLgatactgccattaagtatttaatggsgact1680
gtcg肌gccctagactatcttcacaatttgagtccaccagtcattcatcgtgacatcaaa1740
gcagccaacttactgatcacgtcgaacgat3gca^taaaattgggctcgta1800
cgtgatctagctgttgacggattcggtatagcgattgcctctgaaatcactttagatttt1860
cgagcgactcttttatacgtggctcctgsggttctgagcagtgcgcttggtccaggaaac1920
cgaaatgcctatgagctaccggcagacatttgggctctgg,gatgta_cgttcattgaaatg1980
ttattaaaacgtccaccacactttgeigtatttcgggcatattgatgaaattccaaaagtt2040
ctacttggatatgcga卿gtga卿tgggaaagtactgccttacacttccgaagtcttg2100
gttccttcttcttcaaactgattgttgstctggtgtttattaaatctccg2160
gagcatcgacc aaac ac c c aca^gcttcgaattcaaattacgatgatgac2220
tcggaaagcg8agaagaaaca^tatcagtcatcctattagtaatagcaaC8cagacagt2280
tcaacggc犯tttcacataatcactcaaatgatcga犯agttggacgagctggsacttgc2340
ctacccattggtatgcagctgtgagg咖gagcttaaaaa2400
ccg犯gagcaataatattatgc^atttttgtggcaagcgggtactacctctcaaggata2460
ttatactttttgaacattctcacacgatccatatgctatctcctgctctttttatcattg2520ggcatcacggcacttggctctttcttgctaatttcttactttgttgtccgatttgtacgc2580
tatctgattgcaatcaactgcaactgtgatcttatgcagcctcagtatttgatcatttcg2640
gggatUtgettsgtgctgatgtttgcgctcttgttcagttgctgtatggttgctcttgga2700
ttcggatggcaaaccaaactttggatggttcttaccccgc2760
cccca犯agtcagcagtcct3tgCggC3tactggtaaaga^2820
gacactgctc3g^catggacatctaacaccctctgtcagaaggaaccat2880
gatgattattgtcgtctggacc3gc犯atgg2931
SEQUENCE LISTING No. 10
<110〉南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室
<120> —種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用 <130〉 rpf-cc3302-flr-4編碼的氨基酸序列 <160〉 1
<170〉 Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 976
<212> PRT
<213〉 plasmid
<400> 1
Met Asp Thr Met Thr Leu Phe Thr Thr Ser Ala Thr Arg Ser Arg Arg
15 10 15
Ala Thr Ala Ser lie Val Ala Gly Met Thr Leu Ala Gly Ala Ala Ala
20 25 30
Val Gly Phe Ser Ala Pro Ala Gin Ala Ala Thr Val Asp Thr Trp Asp
35 40 45
Arg Leu Ala Glu Cys Glu Ser Asn Gly Thr Trp Asp lie Asn Thr Gly
50 55 60
Asn Gly Phe Tyr Gly Gly Val Gin Phe Thr Leu Ser Ser Trp Gin Ala 65 70 75 80
Val Gly Gly Glu Gly Tyr Pro His Gin Ala Ser Lys Ala Glu Gin lie
85 90 95
Lys Arg Ala Glu lie Leu Gin Asp Leu Gin Gly Trp Gly Ala Trp Pro
100 105 110
Leu Cys Ser Gin Lys Leu Gly Leu Thr Gin Ala Asp Ala Asp Ala Gly
115 120 125
Asp Val Asp Ala Thr Glu Ala Ala Pro Val Ala Val Glu Arg Thr Ala
33Thr 145
130
Val Gin Arg Gin
Ser 150
135
Ala Ala Asp Glu
Ala 155
140
Ala Ala Glu
Gin Ala 160
Ala Ala Ala Glu Gin Ala Val Val Ala Glu Ala Glu Thr lie
170
Ala Asn Glu Tyr
Lys Ser Gly Gly
Gin 165 Ser
Gly
Asp 180
Thr Ala Leu
Leu Trp Thr
Trp 195
Val lie Tyr Val
Ala Ala 210
Ser Gly Gly Ser
Gly 225
Val Arg Ser Leu
Gly 230 Gly
Trp
Tyr
Gly 215 Gly
Leu 185
Ala Asn Lys Gly
Glu 200
Gin Glu Leu Val
Ala 205 Pro
Glu 190 Val
Gin
Ser Gly Gly
Gly
Glu Leu Asp
Arg 245
Ala Leu Gly Leu
Ser 235 Arg
Leu 220
Met Trp Arg
Val Val 175
Val Glu Ser Asp Ala Gly
Asp Gin Gly Leu 260
His Ala Ala Leu
Arg 250
Gin Leu Ala Leu
Leu Asp Phe 275 Leu
Gly 265
Glu Arg His lie
Ser Pro 240
Ser Pro Leu Cys Leu 255
Phe Ala
Ala
Gin 290
Glu Gin Gly Gly
Leu 305
Cys Asn Ala His
Arg Ala Ala Gly
Ala 280
Arg Leu Ala Gly
Gly 270
Gly Val Val
Glu 295
Gly Gly Val Arg
Gin 285
Leu Asp Ala Gly
Leu 310
Arg Val Ala Leu
Ala 325
Arg His Gly Gly
Gin 315 Gly
Leu 300
Val Gin Val
Gin Ala Gin Asp 340
Asp Glu Leu Ala
Gin Ala His 355
Ala Ala Pro Met
Leu
Phe 370
Arg Tyr Thr Ser
Ser 385
Gly Gly Ser Gly
Val 390 Ser
Asn 375 Met
His 360 lie
Glu 345 Leu
Gly Arg
Met Pro lie
Gly 330
Ala Gin Gly Lys Tyr Pro Tyr
Val Gly Gly
lie
Gly
Gly
Ser 365 Val
Asp 350 Gly
Leu
Thr Arg Asn
Gly Ser 400
Gly Ser Met Pro lie Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Val 405 410 415
Glu Leu Lys Leu Ser Ser Gin Leu Leu Gin Trp Leu Asp Gin Arg Leu
Gly 395 Tyr
Arg 380
Gly Ser Gly
Arg His 320 Leu Arg 335
Gly Gly Trp Ala Ala Lys
34420
Asp Pro Met Arg
Pro Leu Gly 435
Asp Leu Gly Lys
lie
Asn 465 Asn
Gin 450
Gly Asn—Thr Phe
Gly 455 Thr
lie 440 Arg
Val
425
Pro Ser lie Asp
Phe Gly Thr
His Tr。 Thr
Trp
Phe Leu Tyr
Arg lie Val 515 Ser
Glu 470
Ser Glu Thr
Gin 485
Phe Arg His Leu
Lys Lys
Gly Lys
430
Ser Tyr Lys Tyr 445
Cys Lys Phe Ser
Val 460
Asp Leu Thr lie
Val 475
Ser Asn Arg Leu
Glu 500
Asn Phe Leu Gly
Val 490
Lys Val Thr Asn
His 505
Tyr Ala Asp Ser
Asp 495 Asn
Phe 480 Thr
Asn
lie
Met 530
Glu Thr Leu
Glu Tyr Leu
Lys 545
Val Glu Ala Leu
Tyr Gly
lie 520
Arg Gly Ser Val
Asp 510
Gin Met Tyr
Pro 535
Asp Thr Ala lie
Asn 525
Asp Leu Leu Val
Glu 550
Tyr Leu His Asn
Lys 540
Tyr Leu Met Glu
Arg Asp lie Lys Gly
Asp 565
Ala Ala Asn Leu
Lys 555
Ser Pro Pro Val
Leu
Lys 580
Asn Phe Gly Leu
Leu 570
lie Thr Ser Asn
Ala 595
Ala lie Ala Ser
Leu 585
Arg Asp Leu Ala
lie 575 Ser
Thr 560 His
lie
lie 610
Tyr Val Ala Pro
Val 600
lie Thr Leu Asp
Asp 590
Asp Gly Phe
Leu 625
Arg Asn Ala Tyr
Glu 615
Val Leu Ser Ser
Val 605
Arg Ala Thr Leu
Glu 645 Leu
Glu 630
Leu Pro Ala Asp
Phe 620
Leu Gly 'Pro Gly
Ala 635
Trp Ala Leu Gly
Phe lie Glu Met 660
His lie Asp Glu lie Pro 675
Lys Val Leu Pro
Leu Lys Arg
L>ys Lys
lie 650
Pro His Phe Glu
Pro 665
Leu Leu Gly Tyr
Cys 655 Phe
Asn 640 Thr
Gly
Asp
Gly 690 Asn
Val 680
Thr Ser Glu Val
Tyr 670
Lys Ser Glu
Cys Val Gin Arg
Lys 710 Thr
Tyr 695
lie Val Asp Leu
Val 715 lie
Leu 700 Phe
Ala 685
Val Pro Ser Ser
lie Lys Ser
Ser 705
Glu His Arg Pro Asn Thr His Lys Leu Arg lie Gin lie Lys Lys
Lys Lys
Pro 720 lie725
Ser Glu Ser Glu
Leu Asp Asp Asp 740
Ser Asn Thr Asp
lie Ser Asn 755 Asp
Ser
Asn 770
Met Glu Tyr Ala
Ser 785
Pro Lys Ser Asn
Arg Lys Val Tyr
Gly 775
Val Arg Lys Glu
730 735
Glu Glu Thr Asp lie Ser His 745 750
Ser Ser Thr Ala lie Ser His Asn
760 765
Arg Ala Gly Thr Cys Leu Pro lie
Ala 790
lie Met Gin lie
Asn 805
Leu Tyr Phe Leu
Leu Ser Arg lie 820
Leu Phe Leu Ser
Tyr Leu Leu 835 lie
Asn 825 Gly
Leu
lie 865 Gly
Leu 850
Asn Cys Asn
Ser Tyr Phe
Tyr Cys
Val 855
Leu Met Gin Pro
Asp 870
Leu Met Phe Ala
lie Leu lie Val 885
Glu Tyr Lys Phe
Val Ala Leu Gly 900
Phe Tyr Leu Pro
Gly Gly
Ser
Lys 915
Thr Val lie Thr
Arg 905 Pro
lie 930
Met Glu Glu Glu
Asn 945
Asp Asp Tyr Tyr
Gly 935
His Leu Thr Pro
Tyr 965
lie 950
Asp Glu Ser Ser
Gly 970
Leu 795 Val
Cys 780
Lys Lys Arg Ser
Leu 840
Val Arg Phe Val
Phe Val Ala Ser Gly Tyr 810 815 lie Leu Thr Arg Ser lie 830
lie Thr Ala Leu Gly Ser 845
Tyr Leu lie
Gin 875 Leu
Leu 890
Met Ala Asn
Arg 860
Tyr Leu lie lie
Phe
Arg 920
Lys Glu Asp Ala
Ser Cys Cys 895
Gin Thr Leu 910
Gin Lys Ser Ala Val Leu 925
Asp Thr Ala
Ser 955 Pro
Lys 940
Val Arg Arg Asn
Ala
Asn Glu Glu 975
Pro
His
Glu
Lys 800 Tyr
Cys
Phe
Ala
Ser 880 Met
Asp
Cys
Gin
His 960 Asn
3權利要求
1、一種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法，其特征在于用pJRD215-PT載體在氧化亞鐵硫桿菌QEY-6中融合表達rpf、cc3302和flr-4基因，包括(1)氧化亞鐵硫桿菌QEY-6和大腸桿菌S17-1(pJRD215-PT-rcf)的培養；(2)接合轉移；(3)陽性克隆篩選。
2、 一種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法， 其特征在于該方法包括下列步驟A、 pQE30的T5啟動子和TO終止子的擴增，并與pJRD215 —起構建穿梭表達載體 pJRD215-PT:以pQE30質粒為模板，根據T5啟動子、TO終止子和穿梭質粒pJRD215上的 克隆位點設計引物，回收PCR片段與酶切后的pJRD215連接得到pJRD2l5-PT并轉化大腸 桿菌JM109;B、 藤黃微球菌rpf基因、新月柄桿菌cc3302基因和秀麗隱桿線蟲flr-4基因的擴增 并克隆至T載體:根據藤黃微球菌rpf基因、新月柄桿菌cc3302基因和秀麗隱桿線蟲flr-4 基因和pJRD215-PT的酶切位點設計引物擴增片段，回收PCR產物，并分別克隆至pMD18-T 載體，將這些重組載體分別轉化大腸桿菌JM109;C、 重組穿梭表達載體pJRD215-PT-rcs的構建提取pMD18-T-rpf 、 pMD18-T-cc3302 和pMD18-T-flr-4，以pMD18-T-cc3302和pMD18-T- fir-4為模板，擴增cc3302- fir-4 融合基因，回收擴增片段后與pMD18-T連接得到pMD18-T-cf，再以pMD18-T-cf和 pMD18-T-rpf為模板擴增得到rpf-cc3302-f lr-4融合基因片段，并克隆于pMD18-T載體， 最后亞克隆至pJRD215-PT載體得到pJRD215-PT-rcf ，轉化至大腸桿菌S17-l;D、 融合表達rpf、 cc3302和flr-4基因的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株的構建培 養氧化亞鐵硫桿菌QEY-6和大腸桿菌S17-l (pJRD215-PT-rcf)，用接合轉移的方法將 pJRD215-PT-rcf轉入氧化亞鐵硫桿菌QEY~6，得到氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株 力d^.。力腦7/i/s /"arr。。x油/L5 QEY—6 (pJRD215—PT-rcf )。
3、 根據權利要求1所述的一種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基 因工程菌株制備方法，其特征在于A、根據穿梭質粒pJRD215上的克隆位點設計T5啟動子和T0終止子引物，T5啟動子 上游引物GGCGTCGACCTCGAGAAATCATMAAAAT (下劃線處為內切酶Sail位點)，下游引物 TATCTAGA ACCCGGGGTACCGAGCTC (下劃線處為內切酶Xbal位點)，TO終止子上游引物 GTTCTAGATAATTAGCTGAGCTTGGACTC (下劃線處為內切酶Xbal位點)，-下游引物GGGMTTCATTCTCACCMTMAAAACGCC (下劃線處為內切酶EcoRI位點)；B、根據藤黃微球菌rpf基因、新月柄桿菌cc3302基因和秀麗隱桿線蟲f lr-4基因和 pJRD215-PT的酶切位點設計引物，rpf上游引物(B-F): ATCGGTACCATGGACACCATGACTCTC(下劃線處為內切酶Kpnl 位點)，下游引物 (B-R ): tgaaccacctgaaccacctgaaccacctgaaccaccGGCCTGCGGCAGGACGAG (下劃線處為.GGS鏈)， cc3302上游引物(C-F): ggtggttcaggtggttcaggtggttcaggtggttcaATGTGGCGGTCGCCTGTG(下劃線處為 GGS 鏈)，下游引物 (C-R): agatcctccagatcctccagatcctccagatcctccATTACGCGTCATGACTGAG (下劃線處為GGS鏈)， fir-4上游引物(E-F): ggaggatctggaggatctggaggatctggaggatctATGCCMTAMTTACMT(下 戈!i線處為GGS鏈)，下游引物(E-R): CTGTCTAGACTAGTTTTCTTCATTTGC (下免J線處為內切酶 Xbal位點)。
4、 根據權利要求1所述的一種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基 因工程菌株制備方法，其特征在于穿梭表達載體pJRD215-PT的構建方法為擴增引物 合成，pJRD215和pQE30質粒的提取，T5啟動子和TO終止子的擴增，目的基因片段的回 收，測序鑒定。
5、 根據權利要求1所述的一種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法，其特征在于:氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株在鈾礦浸出中的應用， 具體為(1) 氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株爿cjWjWo力acj77"s /erra^oV/朋s QEY-6 (PJRD215-PT-rcf)耐氟性能研究；(2) 氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌菌株y4cjVit^'o6ad7irAs /ferroo"Va/ s呢Y-6 (pJRD215-PT-rcf)耐鈾性能研究。
全文摘要
本發明公開了一種生長速度快且耐鈾和耐氟能力強的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株制備方法和應用，該菌株為Acidithiobacillus ferrooxidans QEY-6(pJRD215-PT-rcf)，CCTCCM 209155。首先是pQE30的T5啟動子和T0終止子的擴增，并與pJRD215一起構建穿梭表達載體pJRD215-PT；其次是藤黃微球菌rpf基因、新月柄桿菌cc3302基因和秀麗隱桿線蟲flr-4基因的擴增并克隆至T載體；第三是重組穿梭表達載體pJRD215-PT-rcf的構建；第四是融合表達rpf、cc3302和flr-4基因的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌株的構建。本發明操作簡單，重復性好，可以提高對含氟鈾礦石的耐受性，縮短浸鈾周期，提高浸出率，降低耗酸率。
文檔編號C12N15/74GK101659961SQ200910044069
公開日2010年3月3日 申請日期2009年8月10日 優先權日2009年8月10日
發明者丁德馨, 劼 劉, 劉玉龍, 李廣悅, 王有團, 王永東, 南 胡 申請人:南華大學