專利名稱：發光細菌法快速檢測海水中bod的方法
技術領域：
本發明涉及發光細菌快速檢測海水中BOD的方法。
背景技術：
生化需氧量(BOD)反映了水體中可被生物降解的有機污染物含量，是海水水質檢測的 重要指標。目前國內外普遍采用的BOD測定方法是五閂培養法，即BODs法，但BODs法存 在操作復雜、耗時耗力、實效性差等缺點。近20年來，對淡水BOD快速測量或在線測量技 術研究取得很大進展，快速測量方法是基于利用微生物的初始氧化速率代替五FI培養法的絕 對耗氧量，以縮短測量時間，實現快速測量。上世紀90年代國外已經開發出商品化的BOD 快速測量儀，但是淡水BOD快速測量的檢測限較高，而海水中的BOD值基本在5mg/L以下， 檢測較困難，因此，國內外相繼開展了海水BOD快速測量技術的研究。

發明內容
本發明針對上述問題，提供了一種發光細菌快速檢測海水中BOD的方法。
本發明的技術方案是發光細菌法快速檢測海水中BOD的方法，具體歩驟如下
一、 發光細菌的培養
菌種采用明亮發光桿菌T3變種(戶/wto6a"m',p/ww/ww訓)，制備發光細菌新鮮菌懸
液
(1) 斜面菌種培養在新鮮斜面上接出第一代斜面，25。C士0.5t:培養24h后立即轉接第 二代斜面，25。C士0.5。C培養24h后再轉接第三代斜面，25。C士0.5。C培養24h后備用。
(2) 搖瓶菌液培養取第三代斜面菌種近一環，接種于裝有30ml細菌培養液的100ml 三角燒瓶中，25。C士0.5。C， 160r/min下培養24h備用。
(3) 將培養后的發光細菌新鮮菌懸液稀釋至每毫升108個~109個細胞，初始發光度不低 于800mV，備用。
斜面和菌液的營養基為
胰蛋白胨0.5gNaCl 3gNa2HP04 0.5g KH2P04 0.5g
酵母0.5g 甘油0.3g蒸餾水100ml 固體培養基加瓊脂1.69g
二、 BOD標準溶液的制備
各自稱取0.15g葡萄糖和谷氨酸溶解于lL的人工海水中，人工海水的配方為 NaCl 20g MgS04 3.6gMgCl2 7.2g無水CaCl2 0.7g蒸餾水 1000ml 。
配得溶液的BOD值相當于220mg/L，將溶液稀為lmg/L、 2 mg/L、 4 mg/L、 6 mg/L、 8 mg/L、10mg/L等6個梯度。
三、發光細菌發光度增加量的測定
測定時的室溫要控制在2o~25°c，同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過irc。
取若干試管，給每支管中加0.6ml歩驟一培養的發光細菌菌液，部分作為對照管的試管中放0.05ml人工海水，作為樣品管的試管中放0.05mlBOD標準溶液。20min后放入發光光度計中檢湖!j。
發光細菌發光度的增加量=樣品管-空白管
本發明的有益效果是本發明可以得到發光細菌發光度的增加量與BOD濃度的標準曲線，并且在BOD濃度范圍在0~10mg/L內時有良好的線性關系，滿足海洋中BOD值的檢測范圍，能夠實現海水BOD的快速檢測。


圖1為實施例1增加的發光度與BOD濃度的關系標準曲線。
具體實施例方式
實施例1
一、發光細菌的培養
菌種采用明亮發光桿菌T3變種(Moto6a"m'M/n;^(wp;wreww)，制備發光細菌新鮮菌懸
液
(1) 斜面菌種培養在新鮮斜面上接出第一代斜面，25。C士0.5。C培養24h后立即轉接第二代斜面，25'Ci0.5。C培養24h后再轉接第三代斜面，25。C士0.5。C培養24h后備用。
(2) 搖瓶菌液培養取第三代斜面菌種近一環，接種于裝有30ml細菌培養液的100ml三角燒瓶中，25。C士0.5。C， 160r/min下培養24h備用。
(3) 將培養后的發光細菌新鮮菌懸液稀釋至每毫升108個~109個細胞，初始發光度不低于800mV，備用。
斜面和菌液的營養基為
胰蛋白胨0.5gNaCl 3gNa2HP04 0.5g KH2P04 0.5g
酵母0.5g 甘油0.3g蒸餾水100ml固體培養基加瓊脂1.69g二、 BOD標準溶液的制備
各自稱取0.15g葡萄糖和谷氨酸溶解于lL的人工海水中，人工海水的配方為NaCl 20gMgS04 3.6gMgCl2 7.2g無水CaCl2 0.7g蒸餾水 1000ml 。
配得溶液的BOD值相當于220mg/L，將溶液稀為lmg/L、 2 mg/L、 4 mg/L、 6 mg/L、 8 mg/L、10mg/L等6個梯度。
三、 發光細菌發光度增加量的測定
測定時的室溫要控制在2o 25°c，同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過irc。
在試管架上按下列方式排列測試管 一側放對照管，另一側放樣品管(從低載荷率到高載荷率依次排列)，每管3個重復，具體擺放位置見表l。
表l.試管在試管架上的排列
對照管樣品管
空白l空白2空白3樣l樣l樣l樣2樣2樣2…樣n樣n樣n
給每支管中加0.6ml的菌液，對照管中放0.05ml人工海水，樣品管中放0.05m舊OD標準溶液。20min后放入發光光度計中檢測，作出標準曲線，見圖l。發光細菌發光度的增加量-樣品管-空白管。
權利要求
1、發光細菌法快速檢測海水中BOD的方法，其特征在于，該方法具體步驟如下一、發光細菌的培養菌種采用明亮發光桿菌T3變種(Photobacterium phosphoreum)，制備發光細菌新鮮菌懸液(1)斜面菌種培養在新鮮斜面上接出第一代斜面，25℃±0.5℃培養24h后立即轉接第二代斜面，25℃±0.5℃培養24h后再轉接第三代斜面，25℃±0.5℃培養24h后備用；(2)搖瓶菌液培養取第三代斜面菌種近一環，接種于裝有30ml細菌培養液的100ml三角燒瓶中，25℃±0.5℃，160r/min下培養24h備用；(3)將培養后的發光細菌新鮮菌懸液稀釋至每毫升108個～109個細胞，初始發光度不低于800mV，備用；斜面和菌液的營養基為胰蛋白胨0.5g NaCl 3g Na2HPO4 0.5g KH2PO4 0.5g酵母0.5g 甘油0.3g 蒸餾水100ml 固體培養基加瓊脂1.69g二、BOD標準溶液的制備各自稱取0.15g葡萄糖和谷氨酸溶解于1L的人工海水中，人工海水的配方為NaCl 20gMgSO43.6gMgCl27.2g無水CaCl20.7g蒸餾水 1000ml。配得溶液的BOD值相當于220mg/L，將溶液稀為1mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L等6個梯度；三、發光細菌發光度增加量的測定測定時的室溫要控制在20～25℃，同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過±1℃。取若干試管，給每支管中加0.6ml步驟一培養的發光細菌菌液，部分作為對照管的試管中放0.05ml人工海水，作為樣品管的試管中放0.05mlBOD標準溶液，20min后放入發光光度計中檢測。發光細菌發光度的增加量＝樣品管-空白管。
全文摘要
本發明涉及發光細菌法快速檢測海水中BOD的方法，本發明通過發光細菌作為檢驗海水BOD的受試生物，同時利用人工海水、葡萄糖、谷氨酸配制BOD標準溶液，解決了以往海水BOD檢測中由于檢測限過高，給結果帶來的影響。
文檔編號C12N1/20GK101551335SQ20091001042
公開日2009年10月7日 申請日期2009年2月20日 優先權日2009年2月20日
發明者劉長安, 張世宇 申請人:國家海洋環境監測中心