專利名稱：熱帶假絲酵母zd-3菌株及其用途及用以生產生物蛋白飼料的方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，具體地說是一種熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Cfl"&^ /ra內c^to ZD-3)及其用途及將該菌株用以生產生物蛋白飼料的方法。
技術背景棉籽餅粕是棉花加工業的主要副產品，我國年產量高達400多萬噸。它富含蛋白 質(30% 45%)，是重要的蛋白詞料資源。在國內外，棉籽餅粕可較多量地替代豆粕 安全地應用于反芻動物，尤其是在奶牛飼養中已大量地推廣應用，但是對單胃動物而 言，飼喂棉籽餅粕時，由于含有有毒物質棉酚(450 1500 mg^g)，會對動物生長、 發育和繁殖等方面產生明顯的不良影響，因而限制了其安全而有效的用作畜禽蛋白飼 料，部分地區甚至將其貶作肥料，造成飼料資源的嚴重浪費。針對這一難題，我國科 研人員(吳小月等，1989;鐘英長等，1989)首先提出了用微生物發酵脫毒的途徑， 就是將特定微生物接種到棉籽餅粕培養基中，在一定的條件下利用微生物在飼料原料 中的生長繁殖和新陳代謝，棉酚被分解利用或與蛋白質氨基酸結合形成結合棉酚，從 而達到脫毒的目的。棉酚的分子式為C3。H3Q08，化學結構是8, 8'-二醛基-1, I', 6, 6', 7, 7'-六羥基-5,5'-二異丙基-3,3'-二甲基-2，2'-聯萘。它的分子量為518.54。棉株體內棉酚的存在形式有 兩種，即結合棉酚(bound gossypol)和游離棉酚(free gossypol)。通常認為在棉花組 織中呈游離狀態存在的棉酚稱為游離棉酚，而與其他物質(蛋白質、氨基酸和磷脂) 結合的棉酚稱為結合棉酚。 一般認為，只有游離棉酚對人畜具有毒性。豬、雞、兔等 長期攝食含高劑量游離棉酚的棉籽餅會損害動物繁殖機能，導致呼吸吃力、困難，生 長速度降低以及厭食等癥狀。棉酚可引起雞蛋蛋黃變色，由淡黃色變為棕黃色。動物 中毒癥狀表現為食欲減退或厭食、日漸消瘦、四肢無力、抽搐、腹瀉、糞便顏色變淡 等癥狀。發明內容本發明的目的是提供一種熱帶假絲酵母ZD-3菌株(C"w^V/a /ra內cafc ZD-3)及其 用途，同時還提供一種將上述菌株用以生產生物蛋白飼料的方法。本發明的熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Owdito fra;^flfc ZD-3)于2008年3月1日保藏在中國典型培養物保藏中心，登記入冊編號為CCTCCNoM208024。本發明的熱帶假絲酵母ZD-3菌株(OwtMfl加; /cafcZD-3)細胞呈卵圓形，大小為 3 4x4 5pm，出芽繁殖。用麥芽汁液體培養該菌，菌體沉淀于管底。在麥芽汁瓊脂 斜面或平皿上培養24 48h，菌落呈奶油色，無光澤或稍有光澤，軟而平滑，有皺紋。 培養時間久的菌落較硬。在加蓋片的玉米粉瓊脂培養基上培養，可見大量假菌絲，包 括伸長的分枝假菌絲，上面帶有芽分生孢子。上述的熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Cfl"&^ /ra/ /cafc ZD-3)CCTCC No M208024可在 棉籽餅粕及類似物上生長，變性底物中游離棉酚含量極低，同時底物中產生大量代謝 產物蛋白酶。因此，它可用于棉籽餅粕及類似物的發酵脫毒，進而生產優質生物蛋白 詞料。上述的熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Om^/fl /ra/ /cafc ZD-3)CCTCC Nq M208024用以 生產生物蛋白飼料的方法如下用熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Om^fe /ro^cflto ZD-3)CCTCC NQ M208024對棉籽餅粕發酵脫毒，在溫度為25 35'C環境下發酵30 60 h。用上述的熱帶假絲酵母ZD-3菌株(C朋AWa加pz'cfl/紐ZD-3)CCTCC Nq M208024生 產生物蛋白飼料過程中，最好在棉籽餅粕中加入10~30%的豆粕、玉米粉、小麥麩中 的至少一種作為發酵底料。上述的用熱帶假絲酵母ZD-3菌株(OwWWfl /ra; z'cflfc ZD-3)CCTCC No M208024生 產生物蛋白飼料方法中，其優選的菌種制作過程如下(1) .一級種子(試管斜面種子)從原始菌種接種至試管麥芽汁固體培養基，28 32'C培養16 36小時；(2) .二級種子(試管液體種子)從一級種子接種至試管麥芽汁液體培養基，28 32。C培養16 36小時；(3) .三級種子(三角瓶液體種子)從二級種子接種至含50 150ml麥芽汁(5 10。Bx)培養基的三角瓶中，28 32。C培養16 36小時；上述的用熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Cam/Wa fropz'cato ZD-3)CCTCC No M208024生 產生物蛋白詞料方法中，其底料的配制如下(l).棉籽餅粕發酵底料的配制取豆粕、玉米粉、小麥麩之一種或幾種按任意比例混合，再按固液比1 : 0.6 0.8的比例加入水，在105 115'C溫度下蒸汽滅菌15 25min，冷卻至25 35'C;(2) .發酵棉籽餅粕發酵底料按1 10%的比例接入三級種子，底料含水量控制在45 55%，發酵室內相對濕度保持在85%以上，溫度維持在25 35。C，通風發酵30 60小時；(3) .培養物在35 45t:干燥，粉碎，混合后包裝。本發明的優點如下培養方便，生長速度快，游離棉酚脫毒效率高；發酵后變性 底物中酵母菌含量高；代謝產物蛋白酶活性高；該菌不產生有害物質，以它發酵所產 生的變性底物是新型微生態生物蛋白飼料，可顯著提高動物抗病性和飼料利用效率。本發明的熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Ow力WaZD-3)已于2008年3月1日 保藏在中國典型培養物保藏中心，登記入冊編號為CCTCCNoM208024。
具體實施方式
菌種篩選、馴化和誘變根據相關文獻，在實驗室收集有消除棉籽餅粕中游離棉酚潛力的菌株28株，點 種到醋酸棉酚無糖査氏培養基上，其中8株能夠良好生長，然后逐步增加無糖査氏培 養基醋酸棉酚的濃度，最高濃度時有3株菌生長較好。隨后將其點種到醋酸棉酚麥芽 汁培養基上逐級平板馴化選育，其中有一株生長最快，菌落最大，編號為ZD-3。將 ZD-3菌株接種到棉粕培養基上進行固體發酵，發酵結束后測定變性底物中游離棉酚 含量，該菌株比出發菌株脫毒率提高8個百分點，脫毒率高達卯％以上，游離棉酚不 超過0.1g/kg，極顯著低于國家標準(不超過1.2g/kg)。將該ZD-3菌株培養并制成菌懸液，分別進行紫外(15W紫外燈下30cm處照射 60秒)、輻射(0)6()輻照10s)和化學試劑(亞硝基胍終濃度lmg/ml， 28。C靜置60 分鐘)誘變，經誘變后將菌懸液涂布于初篩平皿，挑取形成較大菌落的菌株，復壯后 將其接種到棉粕培養基上進行固體發酵，發酵結束后測定變性底物中游離棉酚含量， 發現脫毒率并未顯著改善，且略有降低，因此確定誘變出發菌ZD-3為目標菌株。菌種鑒定(1)形態特征ZD-3菌株細胞呈卵圓形，大小為3 4x4 5 pm，出芽繁殖。用 麥芽汁液體培養該菌，菌體沉淀于管底。在麥芽汁瓊脂斜面或平皿上培養24 48h， 菌落呈奶油色，無光澤或稍有光澤，軟而平滑，有皺紋。培養時間久的菌落較硬。在 加蓋片的玉米粉瓊脂培養基上培養，可見大量假菌絲，包括伸長的分枝假菌絲，上面 帶有芽分生孢子。根據《An Introduction industrial mycology》(George Smith 1954)、 《真菌鑒定手冊》(魏景超1982)、《常見與常用真菌》(中科院微生物研究所1973)、張紀忠(19卯)主編的《微生物分類學》、J. A.巴尼特等(1991)的《酵母菌的特征 與鑒定手冊》以及該菌的生理生化實驗結果，鑒定該菌株為熱帶假絲酵母(OmA必 fro/ fcafe )， 定名為CawWcto /rap/cafc ZD國3 。(2)培養特征該菌株固體發酵棉籽餅粕的最適溫度為25 35°C;發酵時間30 60 h;底物水分含量45 55%;自然pH值；棉籽餅粕中可加入適量的豆粕或玉米粉和小麥麩，配制發酵底料。 固體發酵生產工藝-(1) . 一級種子(試管斜面種子)從原始菌種接種至試管麥芽汁固體培養基，28 32'C培養16 36小時；(2) .二級種子(試管液體種子)從一級種子接種至試管麥芽汁液體培養基，28 32。C培養16 36小時；(3) .三級種子(三角瓶液體種子)從二級種子接種至含50 150ml麥芽汁(5 10。Bx)培養基的三角瓶中，28 32。C培養16 36小時；(4) .棉籽餅粕發酵底料的配制棉籽餅粕原料經粉碎過篩后加入適量的豆粕或玉 米粉和小麥麩，再按固液比l : 0.6 0.8的比例加入水，0.056 MPa, 112.6。C蒸汽滅菌 20min，冷卻；(5) .發酵棉籽餅粕發酵底料按1 10%的比例接入三級種子，底料含水量控制在 45 55%，發酵室內相對濕度保持在85%以上，溫度維持在25 35r，通風發酵30 60小時；(6) .培養物在35 45"C干燥，粉碎，混合后包裝。 實施例l:棉籽餅粕底料固體發酵(1) . 一級種子(試管斜面種子)從原始菌種接種至試管麥芽汁固體培養基，30°C 培養24小時；(2) .二級種子(試管液體種子)從一級種子接種至試管麥芽汁液體培養基，30°C 培養20-24小時；(3) .三級種子(三角瓶液體種子)從二級種子接種至含5 。Bx麥芽汁培養基的三 角瓶中，3(TC培養20~24小時；(4) .棉籽餅粕發酵底料的配制棉籽餅粕原料經粉碎過篩后加入20。/。的豆粕，再 按固液比1 : 0.8的比例加入水，0.056MPa， U2.6X:蒸汽滅菌20min，冷卻至室溫；(5) .發酵棉籽餅粕發酵底料按5%的比例接入三級種子，底料含水量控制在50%， 發酵室內相對濕度保持在85%以上，溫度維持在3(TC，通風發酵48小時；(6) .培養物在45t;干燥，粉碎，過孔徑0.6mm篩，混合后包裝。(7) .游離棉酚測定小于0.1g/kg。(8) .酵母菌記數大于2.8X 1013cell/g。(9) .蛋白酶活性測定中性大于130u/g;堿性大于50u/g;酸性大于25 u/g 游離棉酚測定按國標GB13086-91"飼料中游離棉酚的測定方法"測定。 酵母菌記數采用平板計數法，中華人民共和國國家標準GB4789.15-84，食品衛生微生物檢驗——霉菌和酵母計數。蛋白酶活性測定方法為福林法，中華人民共和國專業標準ZBX66030-87。蛋 白酶活力測定包括堿性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶的測定。在4(TC下每分鐘水 解酪蛋白產生l嗎酪氨酸，定義為l個蛋白酶活力單位。實施例2:與實施例l的不同之處在于發酵底料的配制，其它步驟相同。 棉籽餅粕發酵底料的配制棉籽餅粕原料經粉碎過孔徑0.5mm篩后加入20%的豆粕、5%的玉米、5%的小麥麩，再按固液比1 : 0.8的比例加入水，0.05MPa, 112.6°C蒸汽滅菌20min，冷卻至室溫。 實施例3:與實施例l、 2的不同之處在于發酵底料的配制，其它步驟相同。 棉籽餅粕發酵底料的配制棉籽餅粕原料經粉碎過孔徑0.4mm篩后加入10%的豆粕、10%的玉米、10%的小麥麩，再按固液比1 : 0.8的比例加入水，0.045MPa， 112.6°C蒸汽滅菌20min，冷卻至室溫。 實施例4:與實施例l不同之處在于在底物接種專利菌種熱帶假絲酵母ZD-3的同時，再接種普通釀酒酵母，進行二元復合發酵。普通釀酒酵母一、二、三級種子的制作方法及接種量與熱帶假絲酵母ZD-3相同，其它操作步驟與實施例1相同。
權利要求
1.一種熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Candida tropicalis ZD-3)，其特征為CCTCC N0M208024。
2、 —種熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Cfl"&Wa加p/cfl/" ZD-3)CCTCC No M208024的 用途，其特征在于用于棉籽餅粕發酵脫毒，消除游離棉酚，生產生物蛋白飼料。
3、 —種用熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Ow^ifl加;w'c"fe ZD-3)CCTCC NQ M208024 生產生物蛋白飼料的方法，其特征在于用熱帶假絲酵母ZD-3菌株(C"m//^加內cafo ZD-3)CCTCC Nq M208024對棉籽餅粕發酵脫毒，在溫度為25 35。C環境下發酵30 60 h。
4、 根據權利要求3所述的用熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Cfl"AW" /ra/^ato ZD-3)CCTCC NQ M208024生產生物蛋白飼料方法，其特征在于棉籽餅粕中加入 /<^^%的豆粕、玉米粉、小麥麩中的至少一種或幾種作為發酵底料。
5、 根據權利要求3或4所述的用熱帶假絲酵母ZD-3菌株(O mfefe /rap/cato ZD-3)CCTCCNoM208024生產生物蛋白飼料方法，其特征在于菌種的制作如下(1) .一級種子(試管斜面種子)從原始菌種接種至試管麥芽汁固體培養基，28 32。C培養16 36小時；(2) .二級種子(試管液體種子)從一級種子接種至試管麥芽汁液體培養基，28 32T:培養16 36小時；(3) .三級種子(三角瓶液體種子)從二級種子接種至含50 150ml麥芽汁(5 10。Bx)培養基的三角瓶中，28 32。C培養16 36小時；
6、 根據權利要求3或4所述的用熱帶假絲酵母ZD-3菌株(OmAVfe /ra內cflto ZD-3)CCTCC No M208024生產生物蛋白飼料方法，其特征在于底料的配制如下(1) .棉籽餅粕發酵底料的配制取豆粕、玉米粉、小麥麩之一種可幾種按任意比 例混合，再按固液比1 : 0.6 0.8的比例加入水，在105 115i:溫度下蒸汽滅菌15 25min，冷卻至25 35。C;(2) .發酵棉籽餅粕發酵底料按1 10%的比例接入三級種子，底料含水量控制在 45 55%，發酵室內相對濕度保持在85%以上，溫度維持在25 35。C,通風發酵30 60小時；(3) .培養物在35 45'C干燥，粉碎，混合后包裝。
7、 根據權利要求5所述的用熱帶假絲酵母ZD-3菌株(CflmMa /rap/cafcZD-3)CCTCCNoM208024生產生物蛋白飼料方法，其特征在于底料的配制如下(1) .棉籽餅粕發酵底料的配制取豆粕、玉米粉、小麥麩之一種或幾種按任意比 例混合，再按固液比1 : 0.6 0.8的比例加入水，在105 115。C溫度下蒸汽滅菌15 25min，冷卻至2545。C;(2) .發酵棉籽餅粕發酵底料按1 10%的比例接入三級種子，底料含水量控制在 45 55%，發酵室內相對濕度保持在85%以上，溫度維持在25 35。C，通風發酵30 60小時；(3) .培養物在35 45"C干燥，粉碎，混合后包裝。
全文摘要
本發明公開了一種熱帶假絲酵母ZD-3菌株(Candida tropicalis ZD-3)及其用途及用以生產生物蛋白飼料的方法，本發明的熱帶假絲酵母ZD-3菌株保藏在中國典型培養物保藏中心，登記入冊編號為CCTCC N₀ M208024，可用于棉籽餅粕及類似物的發酵脫毒，進而生產優質生物蛋白飼料。本發明的優點如下培養方便，生長速度快，游離棉酚脫毒效率高；發酵后變性底物中酵母菌含量高；代謝產物蛋白酶活性高；該菌不產生有害物質，以它發酵所產生的變性底物是新型微生態生物蛋白飼料，可顯著提高動物抗病性和飼料利用效率。
文檔編號C12N1/14GK101270336SQ20081007287
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月9日 優先權日2008年5月9日
發明者余東游, 張文舉, 潘曉亮, 許梓榮 申請人:石河子大學