專利名稱：一種從梨花粉管中分離純化線粒體的方法
技術領域：
本發明是從梨花粉管中分離純化線粒體的方法，涉及植物組織細胞勻漿和獲取完 整具有活力的線粒體，屬于生物技術領域。
技術背景線粒體是細胞的主要細胞器，是細胞的"動力工廠"，是呼吸代謝進行的主要場所， 也是細胞內能量代謝和物質轉化的中樞，在維持細胞動態平衡方面起到關鍵作用；并 且線粒體含有自身基因組結構，能夠自我復制，可編碼一些呼吸代謝過程中的重要酶 成分，是核外相對獨立的遺傳體系；此外，線粒體還和動植物細胞的程序性死亡具有 直接關系。線粒體蛋白質組及基因組的研究是認識發生在線粒體內各種生理生化反應、探索 細胞器起源和進化的重要手段。而對線粒體蛋白質組及基因組研究的前提就是將線粒 體從細胞中分離出來。目前線粒體分離純化技術要明顯落后于蛋白質組學和基因組學的研究。植物細胞 線粒體的純化主要是通過組織勻漿攪拌或細胞勻漿，再用Percoll (由乙烯吡咯垸酮包 裹的硅膠顆粒組成的細胞分離液)梯度離心獲得。而勻漿是從植物細胞中提取線粒體 的關鍵步驟。在動物細胞中，可以利用低滲的方法來破壞細胞膜從而簡易獲得完整的 線粒體。然而植物細胞具有細胞壁，必須要采用機械的方法來破壞，這就要求在破壁 與保持線粒體完整之間取得平衡，并且對細胞勻漿的強度和時間上要求特別高。目前 從植物材料中分離純化線粒體采用的常規勻漿方法，對線粒體結構破壞比較大，效率 較低，開始時往往需求幾十克甚至幾千克的新鮮植物組織材料。因此，將目前已有的 方法應用于一些數量不多的植物組織或器官如植物花粉來分離純化線粒體是不現實 的。迄今，國際上尚無從梨花粉管中分離純化出完整具有活性的線粒體的報道。這種 從微量花粉管中分離純化線粒體技術，對于研究花粉管的快速生長、以及不親和花粉 管的生長抑制技術將具有重要意義。發明內容技術問題本發明的目的是提供一種從梨花粉管中分離純化線粒體的方法，有效 得分離出結構完整、具有活力的花粉管線粒體。該方法也可用于分離純化其他植物花粉管的線粒體，為其他植物組織器官的線粒體分離純化提供參考。技術方案本發明提供一種從梨花粉管分離純化線粒體的方法，是應用花粉培養、 勻漿、以及分離純化三步法來獲取花粉管線粒體的方法，其過程是將花粉先培養，再 勻漿，然后分離純化而獲得結構完整具有活力的線粒體。 從花粉管中分離純化線粒體的方法包括下列步驟1) 花粉的采集采集當天開放的花粉，然后讓花粉充分干燥；2) 花粉培養基的制備將10。/。蔗糖(sucrose), 0.03°/。 Ca(N03)2'4H20， 30mMMES(a-磺基甲脂磺酸鈉)，20%PEG4000 (聚乙二醇4000)， 0.01%硼酸溶于蒸餾水中，用 NaOH調整溶液pH值至6.0~6.5。3) 花粉的培養取20mg干燥花粉，于20ml花粉培養基中，在黑暗條件下，25 °C， 180rpm，培養 3~3.5h，獲得培養好的花粉管。4) 線粒體提取液的配制50 mM Hepes (羥乙基哌嗪乙硫磺酸)，600 mM sorbitol (山 梨醇)，5mMEDTA (乙二胺四乙酸)，0.1% BSA(牛血清蛋白)，1%PVP40 (聚乙烯 吡咯烷酮40000) , 1 mM DTT， 5 mM KH2P04溶于蒸餾水中，用KOH調整溶液pH值 至7.4。5) 清洗液的配制50 mM Hepes (羥乙基哌嗪乙硫磺酸)，0.5 M sucrose (蔗糖)，5 mM EDTA (乙二胺四乙酸)，0.1% BSA(牛血清蛋白)，5 mM KH2P04溶于蒸餾水中，用 KOH調整溶液pH值至7.4。6) Percoll (由乙烯吡咯垸酮包裹的硅膠顆粒組成的細胞分離液)梯度的配制分別 取45%， 21%, 13.5% (v/v) Percoll溶于50 mM Hepes-KOH(pH 7.4)緩沖液中，并包 含0.5 M sucrose (庶糖)，5 mM EDTA (乙二胺四乙酸)，0.1% BSA(牛血清蛋白)，5 mM KH2P04。7) 勻漿將培養好的花粉管連同培養基一起，用細胞篩(500目/英寸)過濾，用吸 水紙從細胞篩底部將培養基吸干，然后將細胞篩置于一培養皿上，往花粉管上添加線 粒體提取液，以200 rpm速度在細胞篩上研磨，研磨過程中不斷添加線粒體提取液， 使從已經破碎的花粉管中流出的細胞質能及時的經細胞篩流入到培養皿中，避免被再 次研磨而破壞線粒體結構。以上操作均在0 4 °C條件下進行。8) 分離將上述得到的液體轉入30ml離心管中，振蕩4秒后迅速離心(2000 g， 5 min， 4 。C)，將上清液轉入另一離心管中，繼續離心30 min (18 000 g， 4 。C),得沉 淀，即為粗線粒體組分。9) 純化將上述得到的沉淀懸浮于lml清洗液中，將Percoll梯度液按45%，21%， 13.5%順序1:1:1從下往上加入離心管中，將粗線粒體組分置于Percoll梯度頂部，于80 000g， 4 。C，離心45min，離心后線粒體在45%和21% Percoll之間，為乳白色。10) Percoll的去除:將純化的線粒體溶液用20倍體積的清洗液稀釋后，在4 。C, 20000g離心45 min，獲得純線粒體，用少量清洗液懸浮后，備用。 有益效果為了滿足從微量植物材料中分離純化出完整具有活力的線粒體的需要，我們發明 了一種新的勻漿技術(圖l)，并將這種技術運用到梨花粉管線粒體的分離和純化。在 這一技術中，我們只用了20mg花粉，經新鮮離體培養三小時后，就能分離純化出足 夠量、用于蛋白質組學研究的線粒體，使利用少量的花粉管材料分離純化出線粒體成 為可能。這種從微量花粉管中分離純化線粒體技術，對于研究花粉管的快速生長、以 及不親和花粉管的生長抑制技術將具有重要意義。1) 首次從薔薇科果樹梨花粉管中分離純化出完整、具有活力的線粒體，可以用于 線粒體蛋白質組學的研究，尤其是梨花粉生理生化特性的基礎性研究；比如，花粉快 速生長的能量提供及不親和花粉管的生長抑制；2) 應用本發明的方法提取的完整、具有活力的線粒體，可進一步用于線粒體DNA 提取，進行基因組研究，對探索細胞器的起源和進化具有重要意義；3) 本發明是基于對梨花粉及花粉管生理生化及細胞信號轉導等特性研究的工作基 礎。多種生理代謝均與線粒體有關，如植物中重要的信號分子活性氧的產生，植物細 胞程序性死亡的調控等。總之，本方法具有堅實的理論依據，科學性強，方法較簡便， 易于操作和實際應用。 '4) 用這種花粉管線粒體提取純化的方法，通過發明新的研磨方法，可以高效的獲 得完整、有活力的線粒體；應用該方法獲取的花粉管線粒體，非常適合于作為花粉及 花粉管的生理生化、細胞信號轉導特性等方面研究的實驗材料。


圖1梨花粉管線粒體分離純化流程圖。 圖2花粉管勻漿工具實物圖。圖3分離純化得到線粒體電鏡圖。得到線粒體雜質較少，線粒體結構完整。Bar=lpm。 圖4離體線粒體膜電位檢測。利用Rhodamine 123標記線粒體膜電位進行標記，熒光強度大小的改 變與膜電位大小改變相對應。利用流式細胞儀對線粒體熒光強度進行檢測a沒有利用Rhodamine 123標記的線粒體的基本沒有熒光強度；b在沒有呼吸底物的情況下，用Rhodamine 123對線粒體 進行標記，線粒體具有一定熒光強度，但線粒體熒光強度情況不一致；c在有呼吸底物琥珀酸存 在的條件下，用Rhodamine 123標記的線粒體熒光升高，這說明分離出來的線粒體具有活力。 圖5蛋白質免疫印記法檢測線粒體內蛋白一一細胞色素c。結果顯示,在線粒體組分里，能夠檢測 到線粒體內特有的蛋白質組分，而胞質組分里卻檢測不到。圖中，Cyt指細胞質組分，Mic指線粒 體組分。
具體實施方式
眾所周知，分離純化花粉管線粒體是開展線粒體蛋白質組學和基因組學實驗研究的前提，而迄今，由于提取效率的低下，要獲得足夠的線粒體用于線粒體蛋白質組學 的研究，往往需要幾十克到幾千克的植物材料，原有方法不能滿足從體積較小、質量 較輕的花粉管中分離和純化線粒體的需要。目前在國際上，還沒有從薔薇科植物花粉 管中分離純化出線粒體的報道。我們應用本發明的方法，獲取了完整的、具有活力的 梨花粉管線粒體，利用蛋白質免疫印記的方法，在線粒體組分成功檢測到線粒體內特 有蛋白質的陽性條帶，為開展和深入研究花粉管線粒體蛋白質組學和基因組學奠定基 礎。這種從微量花粉管中分離純化線粒體技術，對于研究花粉管的快速生長、以及不 親和花粉管的生長抑制技術將具有重要意義。本實施例就以梨花粉作為材料，采用本發明方法從用20 mg花粉培養3 h后的花 粉管中獲得了 500嗎完整的、具有活力的線粒體，利用蛋白質免疫印記的方法，在線 粒體組分成功檢測到線粒體內特有蛋白質一細胞色素c的陽性條帶(圖5)。實驗過程 如下1. 花粉采集在梨樹開花期采集成熟的梨花粉，風干后-2(TC冰凍低溫下保存。2. 培養基的制備將10。/o蔗糖(sucrose), 0.03% Ca(N03)2'4H20， 30mMMES(a-磺基 甲脂磺酸鈉)，20% PEG 4000 (聚乙二醇4000)， 0.01%硼酸溶于蒸餾水中，用 NaOH調整溶液pH值至6.0~6.5。3. 花粉的培養取保存的花粉20mg，先在常溫下解凍2h，用上述培養基培養花粉， 在25'C、黑暗條件，180rpm，在搖床上培養3h ，獲得培養好的花粉管(圖2)。4. 線粒體提取液的配制50 mM Hepes (羥乙基哌嗪乙硫磺酸)，600 mM sorbitol (山 梨醇)，5mMEDTA (乙二胺四乙酸)，0.P/oBSA(牛血清蛋白)，1。/。PVP40(聚乙 烯吡咯烷酮40000) ， 1 mMDTT,5mMKH2P04溶于蒸餾水中，用KOH調整溶液 pH值至7.4。5. 清洗液的配制50mMHepes (羥乙基哌嗪乙硫磺酸)，0.5 M sucrose (蔗糖)，5 mM EDTA (乙二胺四乙酸)，0.1% BSA(牛血清蛋白)，5 mM KH2P04溶于蒸餾水中， 用KOH調整溶液pH值至7.4。6. Percoll (由乙烯吡咯烷酮包裹的硅膠顆粒組成的細胞分離液)梯度的配制分別取 45%， 21%, 13.5% (v/v) Percoll溶于50 mM Hepes-KOH(pH 7.4)緩沖液中，緩沖 液中并含有0.5 M sucrose (蔗糖)，5 mM EDTA (乙二胺四乙酸)，0.1。/。BSA(牛血 清蛋白)，5mMKH2P04。7. 花粉管線粒體分離過程1)勻漿將步驟3培養好的花粉管連同培養基一起，用細胞篩(500目/英寸)過 濾，然后直接加入線粒體提取液，在細胞篩上研磨。研磨過程中不斷添加線粒體提取 液，使從已經破碎的花粉管流出的細胞質能夠及時的經過細胞篩流入到培養皿中，避免被再次研磨而破壞線粒體結構。以上操作均在0 4 °C條件下進行。2) 分離將上述得到的液體轉入30 ml離心管中，振蕩4秒后迅速離心(2000 g， 5 mi、n， 4 °C)，將上清液轉入另一離心管中，繼續離心30 min (18 000 g， 4 °C)，得 沉淀，即為粗線粒體組分。3) 純化將上述得到的沉淀懸浮于1 ml清洗液中，將Percoll (由乙烯吡咯垸 酮包裹的硅膠顆粒組成的細胞分離液)梯度液按45%， 21%， 13.5%順序1:1:1從下往 上加入離心管中，將粗線粒體組分置于Percoll梯度頂部，于80 000 g， 4 'C，水平離 心45 min，離心后線粒體在45%和21% Percoll之間，為乳白色。4) Percoll的去除將純化的線粒體溶液用20倍體積的清洗液稀釋后，在4 °C, 20000 g離心45min，獲得了 500 pg完整的、具有活力的線粒體。用少量清洗液懸浮后，備 用。5) 蛋白質免疫印記將上述得到的線粒體溶液，于一70 'C反復凍溶后，將樣品于 SDS-PAGE上進行電泳，然后轉膜，先后結合一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗，最后 用DAB顯色法顯色。結果成功檢測到線粒體內特有蛋白質一細胞色素c的陽性條帶(圖 5)。
權利要求
1. 一種從梨花粉管中分離純化線粒體的方法，包含下列步驟1)花粉的采集采集當天開放的花粉，風干；2)花粉的培養培養基的制備將10％蔗糖，0.03％Ca(NO3)2·4H2O，30mMα-磺基甲脂磺酸鈉，20％聚乙二醇4000，0.01％硼酸溶于蒸餾水中，用NaOH調整溶液pH值至6.0～6.5；取20mg干燥花粉，于20ml花粉于培養基中，在黑暗條件下，25℃，180rpm，培養3～3.5h，獲得培養好的花粉管；3)線粒體提取液的配制50mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes，600mM山梨醇，5mM乙二胺四乙酸，0.1％牛血清蛋白，1％聚乙烯吡咯烷酮40000，1mM DTT，5mM KH2PO4溶于蒸餾水中，用KOH調整溶液pH值至7.4；4)清洗液的配制50mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes，0.5M蔗糖，5mM乙二胺四乙酸，0.1％BSA牛血清蛋白，5mM KH2PO4溶于蒸餾水中，用KOH調整溶液pH值至7.4；5)Percoll梯度的配制分別取體積比45％，21％，13.5％Percoll溶于50mM pH 7.4的Hepes-KOH緩沖液中，其緩沖液中還含有0.5M蔗糖，5mM EDTA，0.1％牛血清蛋白，5mM KH2PO4；6)花粉管線粒體分離過程a)勻漿將步驟2)培養好的花粉管連同培養基一起，用500目/英寸細胞篩過濾，用吸水紙從細胞篩底部將培養基吸干，然后將細胞篩置于一培養皿上，往花粉管上添加線粒體提取液，以200rpm速度在細胞篩上研磨，研磨過程中不斷添加線粒體提取液，使從已經破碎的花粉管流出的細胞質能及時的經細胞篩流入到培養皿中，以上操作均在0～4℃進行；b)分離將上述培養皿得到的細胞質液體轉入30ml離心管中，振蕩4秒后于2000g，4℃迅速離心5min，將上清液轉入另一離心管中，繼續于18000g，4℃離心30min，獲得沉淀，即為粗線粒體組分。c)純化將上述得到的沉淀懸浮于1ml清洗液中，將Percoll梯度液按45％，21％，13.5％順序體積比1∶1∶1從下往上加入離心管中，將粗線粒體組分置于Percoll梯度頂部，于80000g，4℃，水平離心45min，離心后線粒體在45％和21％Percoll之間，為乳白色。d)Percoll的去除將純化的線粒體溶液用20倍體積的清洗液稀釋后，在4℃，20000g離心45min，得純線粒體，用少量清洗液懸浮后，備用。
全文摘要
本發明涉及一種梨花粉管中分離和純化線粒體的方法，屬于生物技術領域。包括花粉的采集、培養，線粒體提取液的配制、清洗液的配制、Percoll梯度的配制以及花粉管線粒體分離過程，將培養好的花粉管用細胞篩過濾，添加線粒體提取液研磨，獲得細胞質液體，振蕩離心后，用Percoll梯度液純化、清洗獲得線粒體。采用本方法獲得完整的具有活力的花粉管的線粒體，提高了線粒體分離純化效率。這種從微量花粉管中分離純化線粒體技術，適合于作為花粉管的生理生化及細胞遺傳等實驗材料。對于研究開發花粉管的快速生長、以及不親和花粉管的生長抑制技術將具有重要意義。
文檔編號C12N5/04GK101265461SQ20081002330
公開日2008年9月17日 申請日期2008年4月8日 優先權日2008年4月8日
發明者俊 吳, 吳華清, 張紹鈴, 王春雷, 功 陳 申請人:南京農業大學