專利名稱：：一種完全利用木質纖維素生產富馬酸的方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程
技術領域：
，尤其是利用木質纖維素資源的微生物發酵產有機酸的方法，具體涉及將木質纖維素完全利用于微生物發酵生產富馬酸的方法。
背景技術：
：富馬酸(FumaricAcid)，是一種重要的有機基本化工原料和精細化工產品，主要用于合成不飽和聚酯樹脂等，廣泛用于涂料、樹脂、醫藥、增塑劑等領域，并可作為添加劑用于食品飼料工業以及醫藥領域。同時作為一種重要的四碳平臺化合物，富馬酸還可以通過酶催化轉化等工藝生產L-天冬氨酸、蘋果酸、琥珀酸等其他四碳化合物。當前富馬酸生產的主流技術是順酐異構法，其原料苯的毒性嚴重限制了富馬酸在食品及醫藥等方面的應用。近年來隨著石油價格的不斷上漲，富馬酸的生產成本也不斷提高，研究利用可再生的生物質資源發酵制備富馬酸成為大勢所趨。發酵法制備富馬酸的常用菌種為根霉菌(i/^o;w),如米根霉(/.W7加e)、少根根霉(兄arWzi^)以及黑根霉(i.m'gn'cara)等，使用的原料有葡萄糖、木糖、淀粉等，在發酵過程中產生的主要副產物為蘋果酸、乳酸等雜酸。美國專利US4877731公開了一種通過分階段溶氧控制策略發酵i.an^/zws利用葡萄糖生產有機酸的方法，富馬酸占發酵產總酸的比例約為78%，同時發酵液中含有琥珀酸、蘋果酸、a-酮戊二酸等多種有機酸。本發明人公開了一種富馬酸產生菌及其誘變篩選方法和利用該菌抹發酵葡萄糖生產富馬酸的方法，經液體深層發酵富馬酸濃度達到90120g/L,富馬酸產量占總酸產量的90%95%。除了使用葡萄糖為原料，HelenaKautola等利用木糖為原料，固定化發酵i.wr/n'zw,10.25天后得到富馬酸最大產量為16.4g/L(ApplMicrobiolBiotechnol,1989，31:448452);CartaF.S等利用根霉菌發酵富含淀粉的木質纖維素木薯甘蔗渣酶解液得到富馬酸產量為21.28g/L(BioresourceTechnology,1999,68:2328)。到目前為止，主要研究集中于根霉菌發酵葡萄糖生產富馬酸，而以木糖等其他生物質資源作為發酵培養基的碳源，富馬酸產量低，生產速率差，糖酸轉化率低，制約了發酵產富馬酸的工業化。木質纖維素來源于農作物廢棄物，它包括玉米秸稈、玉米芯、甘蔗渣、廢木屑等工農業廢棄物，含35%50%的纖維素，20%35%的半纖維素和10%15%的木質素，其降解產物中富含大量的糖類，主要有纖維素降解產物葡萄糖以及半纖維素降解產物木糖等。因此，木質纖維素是一筆巨大的潛在資源，若利用得當，就可以化廢為利，兼收經濟、環境和社會效益。對于我國這樣一個人口眾多，人均資源貧乏的農業大國，研究與推廣木質纖維素的資源化對保護環境，發展經濟具有重大的現實意義。目前對微生物如何有效利用木質纖維素這一方法的研究主要集中于將木質纖維素降解得到的混合糖液用于發酵產乙醇的方面，但是由于葡萄糖對乙醇發酵有很強的抑制作用，以及混和糖利用在乙醇發酵上有困難等問題，在這類產品的生產方法的開發改進問題還有待解決。而其他研究也限于諸如將降解得到的糖液分別分離提純后，再利用純木糖轉化為木糖醇等方面，然而木糖的轉化率低、代謝效率差是解決木質纖維素有效利用的一個關鍵問題，木質纖維素的完全利用還需要在生產方法上進一步改良。
發明內容本發明的目的是提供一種能將木質纖維素的降解液完全利用于微生物發酵生產富馬酸的方法，主要在于可以將降解半纖維素得到的木糖和降解纖維素得到的葡萄糖幾乎完全利用于發酵生產富馬酸，實現木質纖維素的高效利用，有效降低富馬酸生產的成本。為了實現本發明的技術目的，本發明采用的技術方案如下以兩步法降解木質纖維素得到的兩步降解液為原料，將其分別用于^f艮霉菌的種子培養步驟以及發酵產富馬酸步驟。將降解半纖維素得到的木糖溶液配制成種子培養基用于種子培養的同時，再將降解纖維素的產物葡萄糖溶液配制成發酵產酸培養基用于發酵產富馬酸，實現完全利用木質纖維素發酵生產富馬酸的技術目的。具體的步驟如下1、對木質纖維素進行降解本發明所述的對木質纖維素的降解主要是兩步降解法，即首先降解木質纖維素中的半纖維素得到木糖以供種子培養步驟，再降解木質纖維素中的纖維素得到葡萄糖以供發酵產富馬酸步驟。1)降解半纖維素木質纖維素原料經過除雜粉碎、稀酸浸泡預處理后，使用3%的稀硫酸，20(TC處理120分鐘，過濾后將濾液收集得到半纖維素降解液。在此過程中，半纖維素非常容易被降解得到以木糖為主的五碳糖降解液；利用Ca(0H)2調節該降解液pH至10,再用酸溶液調節到7，過濾CaS04沉淀以及不溶物，得到的主要含有木糖的降解液供種子培養用；2)降解纖維素重新加酸降解殘留的纖維素(主要為微晶纖維素)。降解完半纖維素后剩余的固體殘渣于250°C,3%硫酸處理5分鐘，將剩余纖維素的75。/。可轉化為葡萄糖，該降解液再經過蒸發濃縮脫毒，得到纖維素降解液供發酵產酸用得到可發酵的降解產物葡萄糖降解液以備用于發酵產富馬酸步驟。2、半纖維素降解液用于種子培養1)配制種子培養基稱量一定量的半纖維素降解液稀釋或濃縮成濃度為1040g/L的木糖溶液，加入種子培養必需的營養物質，配制成種子培養基，將種子培養基在11512rC的高溫下滅菌1530分鐘，冷卻；種子培養所必需的營養物質為(NH4)2S041.53g/L，酵母膏04g/L,玉米漿05mL/L，KH2P040.11g/L，MgS04.7H200,1g/L,ZnS04'7H200.010.1g/L,FeS04.7H20O.O卜O,lg/L,瓊脂03g/L,添加中和劑控制pH為46.5;其中,添加的中和劑為H2S04或HCI;2)種子培養按照1%5%的接種量接入配制好的霉菌孢子懸浮液，置于溫度為3035°C，培養1842小時后的種子液備用以發酵產富馬酸。3、纖維素降解液用于發酵富馬酸1)制備發酵產酸培養基將降解纖維素后得到的葡萄糖降解液濃縮至80120g/L,加入發酵產酸必需的營養物質，配制成發酵產酸培養基，將發酵產酸培養基在11512rC的高溫下滅菌1530分鐘，冷卻；發酵產酸培養基所必需的營養物質為(NH4)2S0403g/L,酵母膏01g/L,KH2PO40.11.0g/L，MgS04'7H200.11.0g/L,ZnS04-7H200.010.1g/L，FeS04'7H200.010.1g/L,通過向培養基中添加中和劑控制pH為3.06.0;其中，添加的中和劑為CaC03、Ca(OH)2、NaOH或NaHC03;2)接種種子液發酵產富馬酸量取種子培養得到的種子液，按照10%30%的接種量接入發酵產酸培養中，置于溫度為3035。C，發酵培養6096小時，得到富馬酸。本發明的有益效果在于將木質纖維素資源通過工藝成熟的兩步法處理d旦得到的降解糖液不合并，將主要含有木糖的半纖維素降解液和主要為葡萄糖的纖維素降解液分別用于種子培養以及發酵，利用霉菌發酵高產富馬酸，所用原料為木質纖維素類物質，來源更加廣泛，且不經過分離提純，有效降低了生產成本，具備優異的工業化生產前景。且本發明的整個技術方案不僅充分利用了木質纖維素中的木糖，避免了木糖直接用于發酵產酸的效率低的問題，而且充分利用了木質纖維素資源，降低了生產成本。圖1完全利用木質纖維素類兩步降解糖液生產富馬酸的工藝流程圖具體實施方式實施例1本實施例說明了兩步法降解木質纖維素得到兩種糖液的步驟。(1)木質纖維素原料除雜，粉碎到粒徑50目備用；(2)用1。/。的稀酸浸泡過夜處理后過濾；(3)加入3%的稀硫酸，200。C處理120分鐘；(4)過濾后將濾液收集得到半纖維素降解液，半纖維素轉化率為70%90%,經過Ca(0H)2調節pH至10,再^^用酸溶液調節到pH為7,過濾;琉酸4丐沉淀以及不溶物，得到的主要含有木糖的半纖維素降解液供種子培養用；(5)將上述剩余的固體殘渣250°C,3%硫酸處理25分鐘，將剩余纖維素中約50%80%轉化為葡萄糖，經過蒸發濃縮脫毒，得到纖維素降解液供發酵產酸用。不同種木質纖維素降解得到的兩種糖液指標如表1:表1不同木質纖維素降解得到的兩種糖液含量木質纖維素種類半纖維素降解液木糖(g/L)半纖維素轉化率(%)纖維素降解液葡萄糖(g/L)纖維素轉化率(%)玉米秸稈19.99018.472玉米芯17.98020.476甘庶渣23.3卯21.968廢木屑15.57516.373實施例2本實施例說明完全利用木質纖維素降解液生產富馬酸的步驟。菌種霉菌(孢子懸浮液，濃度為1(^個/mL)(1)配制培養基a.種子培養基將實施例1中降解半纖維素得到的木糖降解液濃縮得到濃度為29.5g/L的木糖溶液，加入霉菌種子培養必需的營養物質(NH4)2S042.5g/L,酵母膏2.4g/L,玉米漿2mL/L,KH2PO40.4g/L,MgS04'7H200.4g/L,ZnS04-7H200.05g/L，FeS04-7H200.01g/L,瓊脂2g/L,力。H2S04調節pH為4.5。b.發酵產酸培養基將實施例1中纖維素降解液蒸發濃縮脫毒并適當濃縮或稀釋得到濃度為80g/L的葡萄糖溶液，加入霉菌發酵產酸必需的營養物質(NH4)2S041.8g/L,酵母膏0.4g/L,KH2P040.4g/L，MgS04.7H200.4g/L,ZnS04.7H200.05g/L,FeS04'7H200.01g/L,加入過量CaC0380g/L,解除產物抑制作用并保持發酵液pH5.5。a和b中碳源、氮源分開滅菌，115。C滅菌15分鐘，CaC03干熱滅菌，冷卻后混合后備用；(2)種子培養將孢子懸浮液按照4%的接種量接入裝有50mL種子培養基的250mL凹槽搖瓶中，置于溫度為34。C、轉速為180rpm的搖床上培養種子液，42小時結束。(3)發酵產酸步驟(2)中孢子懸浮液按照10。/。的接種量接入裝有50mL發酵產酸培養基的250mL凹槽搖瓶中，置于溫度為34。C、轉速為160卬m的搖床上，培養60小時結束。(4)結果對不同霉菌的種子培養結果見表2。表2數據統計結果菌種42h后殘余木糖菌體干重木糖轉化率富馬酸產量糖酸轉化率(g/L)(%)(g/L)(g/g葡萄糖)少根根審ME-F216.14.479.328.60.42米根霉ME-Fll7.53.974.628.10.41實施例3本實施例與實施例2方法相同，條件改變。菌種根霉(孢子懸浮液，濃度為1(^個/mL)(1)配制培養基a.種子培養基將實施例1中降解半纖維素得到的木糖降解液稀釋得到濃度為10g/L的木糖溶液,加入霉菌種子培養必需的營養物質(NH4)2S041.5g/L,KH2P040.1g/L,MgS04'7H200.1g/L,ZnS04'7H200.01g/L，FeS04'7H200.01g/L,力口HC1調節pH為4。b.發酵產酸培養基將實施例1中纖維素降解液蒸發濃縮脫毒并適當濃縮或稀釋得到濃度為100g/L的葡萄糖溶液，加入霉菌發酵產酸必需的營養物質KH2P040.1g/L,MgS04.7H200.1g/L，ZnS04'7H200,01g/L,FeS04.7H200.01g/L,加入過量Ca(OH)80g/L,解除產物抑制作用并保持發酵液pH3.0。a和b中碳源、氮源分開滅菌，115。C滅菌30分鐘，CaC03干熱滅菌，冷卻后混合后備用；(2)種子培養將孢子懸浮液按照1%的接種量接入裝有50mL種子培養基的250mL凹槽搖瓶中，置于溫度為30°C、轉速為100rpm的搖床上培養種子液，18小時結束。(3)發酵產酸步驟(2)中孢子懸浮液按照20%的接種量接入裝有50mL發酵產酸培養基的250mL凹槽搖瓶中，置于溫度為3CTC、轉速為120rpm的搖床上，培養80小時結束。(4)結果對不同霉菌的種子培養結果見表3。表3數據統計結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例4本實施例與實施例2方法相同，條件改變。菌種根霉(孢子懸浮液，濃度為1(^個/mL)(1)配制培養基a.種子培養基將實施例1中降解半纖維素得到的木糖降解液適當濃縮或稀釋得到濃度為40g/L的木糖溶液，加入霉菌種子培養必需的營養物質(NH4)2S043g/L,酵母膏4g/L，玉米漿5mL/L,KH2P041g/L,MgS04'7H201g/L，ZnS04.7H200.1g/L，FeS04'7H200.1g/L，瓊脂3g/L,加H2S04調節pH為6.5。b.發酵產酸培養基將實施例1中纖維素降解液蒸發濃縮脫毒并適當濃縮或稀釋得到濃度為120g/L的葡萄糖溶液，加入霉菌發酵產酸必需的營養物質(NH4)2S043g/L，酵母膏1g/L,KH2P041g/L,MgS04'7H201g/L,ZnS04'7H200.1g/L,FeS04.7H200.1g/L,加入過量NaHC0380g/L,解除產物抑制作用并保持發酵液pH6.0。a和b中碳源、氮源分開滅菌，m。C滅菌15分鐘，CaC03干熱滅菌，冷卻后混合后備用；(2)種子培養將孢子懸浮液按照5%的接種量接入裝有50mL種子培養基的250mL凹槽搖瓶中，置于溫度為35。C、轉速為220rpm的搖床上培養種子液，24小時結束。(3)發酵產酸步驟(2)中孢子懸浮液按照30。/。的接種量接入裝有50mL發酵產酸培養基的250mL凹槽搖瓶中，置于溫度為35。C、轉速為220rpm的搖床上，培養96小時結束。(3)結果對不同霉菌的種子培養結果見表4。表4數據統計結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權利要求1、一種將木質纖維素的降解液完全利用于微生物發酵生產富馬酸的方法，其特征在于以兩步法降解木質纖維素步驟得到的兩步降解液為原料，將降解半纖維素得到的木糖溶液配制成種子培養基用于種子培養步驟的同時，再將降解纖維素的產物葡萄糖溶液配制成發酵產酸培養基用于發酵產富馬酸步驟，實現完全利用木質纖維素發酵生產富馬酸的目的。2、根據權利要求1所述的兩步法降解木質纖維素的方法，其特征在于首先降解木質纖維素中的半纖維素得到木糖以供種子培養步驟，再降解木質纖維素中的纖維素得到葡萄糖以供發酵產富馬酸步驟。3、根據權利要求1所述的配制種子培養基的步驟，其特征在于稱量一定量的半纖維素降解液稀釋或濃縮成濃度為1040g/L的木糖溶液，加入種子培養必需的營養物質，配制成種子培養基，將種子培養基在115121。C的高溫下滅菌1530分鐘，冷卻。4、根據權利要求3所述的配制種子培養基的步驟，其特征在于加入的種子培養必需的營養物質為(NH4)2S041.53g/L,酵母膏04g/L，玉米漿05mL/L,KH2P040.1lg/L，MgSO4'7H2O0.1lg/L，ZnS04.7H200.010.1g/L,FeS04.7H200.010.1g/L，瓊脂03g/L,添加中和劑控制pH為46.5。5、根據權利要求4所述的配制種子培養基的步驟，其特征在于所添加的中和劑為恥04或HC1。6、根據權利要求1所述的種子培養步驟，其特征在于按照1%5%的接種量接入配置好的霉菌孢子懸浮液，置于溫度為3035°C,培養1842小時后的種子液備用以發酵產富馬酸。7、根據權利要求1所述的配制發酵產酸培養基的步驟，其特征在于將降解纖維素后得到的葡萄糖降解液濃縮至80120g/L，加入霉菌種子液發酵產酸必需的營養物質，配制成發酵產酸培養基，將發酵產酸培養基在11512rC的高溫下滅菌1530分鐘，冷卻。8、根據權利要求7所述的配制發酵產酸培養基的步驟，其特征在于加入的發酵產酸培養基所需要的營養物質為(NH4)2SO403g/L,酵母膏0lg/L,KH2P040.11.0g/L,MgSO4'7H2O0.11.0g/L,ZnS04'7H200.010.1g/L,FeS04'7H20O.O卜O.lg/L,通過向培養基中添加中和劑控制pH為3.06.0。9、根據權利要求8所述的配制發酵產酸培養基的步驟，其特征在于所添加的中和劑為CaC03、Ca(OH)2、NaOH或NaHC03。10、根據權利要求1所述的發酵產富馬酸的步驟，其特征在于量取種子培養得到的種子液，按照10%30%的接種量接入發酵產酸培養中，置于溫度為3035°C,發酵培養6096小時，得到富馬酸。全文摘要本發明公開了一種完全利用木質纖維素資源發酵制備富馬酸的方法。該工藝涉及通過兩步法降解木質纖維素，將主要含有木糖的半纖維素降解液添加適當的營養物質，用于產富馬酸霉菌種子培養18～42小時，第二步將主要含有葡萄糖的纖維素降解液添加適量營養物質，作為發酵產酸培養基接種，接種上述種子液后培養60～96小時，高產富馬酸，其產量為28～56g/L，轉化率為41％～52％。本發明充分利用了原料木質纖維素類物質，來源更加廣泛，且不經過分離提純，有效降低了生產成本，具備優異的工業化應用前景。文檔編號C12P7/46GK101225412SQ20081001877公開日2008年7月23日申請日期2008年1月23日優先權日2008年1月23日發明者皓何,寧劉,霜李,振高,和黃申請人:南京工業大學