專利名稱：一種嗜冷谷胱甘肽還原酶及其制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物學、生物化學、酶學、極地生物學領域，特別是涉及到一種嗜冷谷胱甘肽還原酶及其制備方法。
背景技術：
由于極地獨特的地理和氣候特征，形成了一個干燥、酷寒、強輻射、高鹽度和低光照的自然環境，能夠生存于其中的生物必然具備了相應獨特的生理生化和分子機制，以適應極端的環境。南極微藻的獨特的生理生化特性、對極端環境脅迫的適應性及其機理，在基礎研究和開發應用等方面具有廣闊的前景，它已成為研究極端環境生物學的良好試驗材料。
谷胱甘肽系統在生物體內維持還原緩沖狀態有著非常重要的地位，主要成分是還原型谷胱甘肽(GSH)，谷胱甘肽合成酶系，谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)和谷胱甘肽還原酶(GR)等。
谷胱甘肽還原酶(GR)是谷胱甘肽抗氧化系統的主要酶之一，它對谷胱甘肽的恢復起到重要的作用，同時它對抗壞血酸的循環再生也是不可缺少的。GR在還原輔酶II NADPH存在的情況下使氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成谷胱甘肽，以維持細胞內的還原狀態和保持正常的GSH/GSSG比例，及對抗氧化脅迫。防止氧化型谷胱甘肽、蛋白-SSG和其它二硫化合物的積累，對細胞膜、核酸、脂類、血紅蛋白和酶的穩定是必需的，對那些不能合成大分子的細胞如眼纖維細胞和成熟紅細胞的保護尤為重要。各種脅迫因子如低溫、輻射、化學毒物、病原等能誘導生物體內自由基的產生，從而通過脂質過氧化對機體造成傷害。研究表明谷胱甘肽還原酶的活力與各種脅迫呈相關性，說明它在保護各類生物免受不同脅迫傷害中具有重要作用，并且具有很大的應用價值。
雖然許多常溫生物的谷胱甘肽還原酶已被分離純化，這些研究對其在常溫生物中的地位具有較大的意義。但是低溫谷胱甘肽還原酶的分離純化、性質及研究還未涉及，尤其是關于南極微藻的這種酶。

發明內容
本發明的目的是為了彌補上述現有技術的不足，提供一種嗜冷谷胱甘肽還原酶及其制備方法。它是以南極微藻為材料，分離到一種嗜冷谷胱甘肽還原酶，并涉及其性質較詳細的說明，為對其充分利用提供科學依據，解決低溫谷胱甘肽還原酶的純化問題。
為實現上述目的，本發明的主要內容和采取的技術方案是該嗜冷谷胱甘肽還原酶，(1)由2個相同的亞基構成，亞基的表觀分子量為54.6kDa，總分子量為105kDa；(2)動力學參數表觀米氏常數Km還原輔酶II NADPH、Km氧化型谷胱甘肽GSSG、Km還原輔酶I NADH分別為23.3μmol/L、66.0μmol/L、83.8μmol/L；(3)最適pH為7.5，強堿性對其活性影響比較大；(4)最適溫度為25℃，屬于一種低溫酶或嗜冷酶，在0℃還具有一定的活力；對高溫具有不穩定性，與低溫酶相同；活化能為3.7kJ/(mol·K)，-78℃保藏是最佳的保藏方法；(5)最適Mg2+為7.5mmol/L，Ca2+、Mg2+對其活性具有促進作用；(6)螯合劑EDTA乙二醇-雙(2-氨基乙基)四乙酸等、重金屬離子如Cd2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+等不同程度地抑制其活力。
嗜冷谷胱甘肽還原酶的制備方法，是將南極微藻低溫培養收獲后，先用液氮研磨、反復凍融破細胞、酶提取液初提后，以硫酸銨沉淀、離子交換、親和層析和凝膠過濾4步法，對南極微藻谷胱甘肽還原酶進行分離純化，其比活力達到178.8U/mg，純化倍數達10000倍以上，回收率為25％，SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)電泳表明達到均一性。
該嗜冷谷胱甘肽還原酶的制備方法和條件如下如下硫酸銨沉淀飽和度區間為40％-90％，以12000轉/分鐘的轉速離心20分鐘；離子交換層析平衡緩沖液為，50mmol/L pH7.8的磷酸鉀鹽緩沖液(含5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/L EDTA乙二胺四乙酸、0.1mmol/L DDT二硫蘇糖醇)，填料為二乙基氨乙基葡聚糖凝膠DEAE-Sephadex A50，氯化鉀梯度洗脫；親和層析條件為，填料為腺苷二磷酸葡聚糖凝膠2’，5’-ADPSepharose 4B，用含5mmol/L的NADP+氧化性輔酶II的緩沖液進行洗脫，流速控制為0.25ml/分鐘，按1ml/管分部收集；凝膠過濾層析條件為，填料為葡聚糖凝膠Sephadex G-200，用50mmol/L pH7.8的磷酸鉀鹽緩沖液洗脫，洗脫流速為0.25ml/分鐘，按2.5ml/管分部收集。
在整個純化過程中溫度的控制，適當的酶保護劑的使用，以及酶液的適當保存方法等的掌握非常重要，本發明表明最終酶活力的保持效率極好。純化的酶可以用于性質與應用研究。采用酶活測定方法(郭麗紅，2002)研究它的各種性質，采用Bradford法(1976)測定蛋白質濃度，十二烷基磺酸鈉變性凝膠電泳采用Laemmli(1970)的方法。
本發明可以解決以下問題(1)有效地闡明南極微藻對低溫等脅迫的適應性，完善其適應機制。
(2)能為抗逆性新品種改良提供新的思路，如通過轉其基因等方式提高冷水性水生生物的抗逆能力。
(3)與其激活劑一起使用可以用于人類常見疾病如艾滋病、老年癡呆病等，及水生生物疾病的輔助預防和治療。
(4)可以作為低溫酶催化機理研究的極好材料，進一步闡明低溫酶的催化機制。
(5)作為一種低溫酶，對它的研究不僅可以豐富生物谷胱甘肽還原酶的普遍性和多樣性，而且可以應用于生物系統發育與分類等的研究。
(6)純化方法可以進行該酶的規模化制備，并可以應用于其他低溫谷胱甘肽還原酶的分離純化。
(7)可以完善谷胱甘肽的酶法測定法，降低溫度，減少因加溫等造成的影響。
(8)可以通過抑制劑造成該酶活性低下或缺失的南極微藻，為科學研究提供具有獨特意義的實驗材料。
具體實施例方式本發明用下列實施例來進一步說明。
酶液的初提谷胱甘肽還原酶純化的操作均在4℃進行。將冷凍干燥的南極微藻稱重，共20g，加石英砂和液氮研磨數次后，加入4倍約80ml的酶提取液(含0.1mol/L pH7.8的磷酸鉀鹽緩沖液，5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DDT、1％PVP聚乙烯吡咯烷酮)，反復凍融3次，四層紗布過濾；含脂類較多時使用0.22μm濾膜抽濾除脂；然后以14000轉/分鐘的轉速離心15分鐘，除去不溶性淀粉，上清液再以11000轉/分鐘的轉速離心15分鐘，棄沉淀，保留上清液。上清液在酶提取液中透析2天，透析期間更換緩沖液數次。
硫酸銨沉淀將透析過的含谷胱甘肽還原酶的上清液，先用量筒量好體積，緩慢逐步加入硫酸銨至40％飽和度，在冰浴中進行，邊加邊攪拌。加完后用濃氨水調pH至7.0，再繼續攪拌2小時，不要起泡；以12000轉/分鐘的轉速離心20分鐘，取上清液繼續加入硫酸銨至90％飽和度，邊加邊攪拌，濃氨水調pH至6.0左右，置于冰箱中過夜；同樣轉速離心，將沉淀懸于40ml酶提取液，重復上面步驟再沉淀1次，最終沉淀溶于離子交換平衡緩沖液(緩沖液A，含50mmol/L pH7.8的磷酸鉀鹽緩沖液，5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DDT)，且對緩沖液A透析2天。
離子交換層析填料用二乙基葡聚糖凝膠DEAE Sephadex A50；先用平衡緩沖液平衡；上樣后，用平衡緩沖液洗滌，再用氯化鉀梯度洗脫，分部收集。
親和層析將離子交換的收集樣在緩沖液C(50mmol/L pH7.8的磷酸鉀鹽緩沖液，含0.1mol/L KCl、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DDT)透析濃縮后，進行親和層析。稱取1.5g 2’，5’-ADP Sepharose 4B溶脹后裝柱，柱大小為0.9cm×5cm，用緩沖液C平衡過夜，上樣總蛋白為1.5mg，用緩沖液C洗柱至吸光度OD280nm小于0.02為止。然后用含5mmol/L的NADP+的緩沖液C進行洗脫，流速為0.25ml/分鐘，每1ml/管收集，分別測定蛋白質吸收值和谷胱甘肽還原酶相對活力。將具有酶活力的管收集在一起，并測定酶的相對活力、蛋白質含量和總體積。柱的再生用含0.5mol/L氯化鉀KCl、pH8.5的三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸Tris-HCl和含0.5mol/L KCl、pH4.5的乙酸鈉緩沖液交替反復洗脫3次，每次洗脫約2-3倍柱體積。
凝膠過濾填料為葡聚糖凝膠Sephadex G-200，上樣后，用50mmol/L pH7.8的磷酸鉀鹽緩沖液洗脫，洗脫流速成為0.25ml/分鐘，按2.5ml/管分部收集。
權利要求
1.一種嗜冷谷胱甘肽還原酶，其特征是(1)由2個相同的亞基構成，亞基的表觀分子量為54.6kDa；(2)動力學參數表觀米氏常數Km還原輔酶II NADPH、Km氧化型谷胱甘肽GSSG、Km還原輔酶I NADH分別為23.3μmol/L、66.0μmol/L、83.8μmol/L；(3)最適pH為7.5，強堿性對其活性影響比較大；(4)最適溫度為25℃，屬于一種低溫酶或嗜冷酶，在0℃還具有一定的活力；對高溫具有不穩定性，與低溫酶相同；活化能為3.7kJ/mol·K，-78℃保藏是最佳的保藏方法；(5)最適Mg2+為7.5mmol/L，Ca2+、Mg2+對其具有促進作用；(6)螯合劑乙二醇-雙(2-氨基乙基)四乙酸EDTA等、重金屬離子如Cd2+、pb2+、Cu2+、Zn2+等不同程度地抑制其活力。
2.一種嗜冷谷胱甘肽還原酶的制備方法，其特征是將南極微藻低溫培養收獲后，先用液氮研磨、反復凍融破細胞、酶提取液初提后，以硫酸銨沉淀、離子交換、親和層析和凝膠過濾4步法，對南極微藻谷胱甘肽還原酶進行分離純化，其比活力達到178.8U/mg，純化倍數達10000倍以上，回收率為25％，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳表明達到均一性。
3.據權利要求2所述嗜冷谷胱甘肽還原酶的制備方法，其特征是硫酸銨沉淀飽和度區間為40％-90％，以12000轉/分鐘的轉速離心20分鐘；離子交換層析平衡緩沖液為，50mmol/L pH7.8的磷酸鉀鹽緩沖液含5mmol/L谷胱甘肽、1mmol/L乙二胺四乙酸EDTA、0.1mmol/L二硫蘇糖醇DDT；填料為DEAE-Sephadex A50，氯化鉀梯度洗脫；親和層析填料為2’，5’-ADP Sepharose 4B，用含5mmol/L的氧化輔酶IINADP+的緩沖液進行洗脫，流速控制為0.25ml/分鐘，按1ml/管分部收集；凝膠過濾層析填料為Sephadex G-200，用50mmol/L pH7.8的磷酸鉀鹽緩沖液洗脫，洗脫流速為0.25ml/分鐘，按2.5ml/管分部收集。
全文摘要
一種嗜冷谷胱甘肽還原酶及其制備方法，以南極微藻為材料，用硫酸銨沉淀、離子交換、親和層析和凝膠過濾4步法對該酶進行分離純化。該酶由2個相同的亞基構成，亞基的表觀分子量為54.6kDa，最適溫度為25℃，最適pH為7.5，最適Mg
文檔編號C12N9/02GK101020901SQ20061012433
公開日2007年8月22日 申請日期2006年12月22日 優先權日2006年12月22日
發明者丁燏, 簡紀常, 吳灶和 申請人:廣東海洋大學