專利名稱：一種氧化葡萄糖桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物轉化技術領域，具體涉及一種氧化葡萄糖桿菌突變株CGMCC No.1184，以及該菌種在6-(2-羥乙基)-氨基-6-脫氧-α-L-山梨呋喃糖制備中的應用。
背景技術：
米格列醇作為α-糖苷酶抑制劑類藥物之一已被應用于II型糖尿病的治療。根據文獻資料，米格列醇的制備可通過化學全合成或生物轉化結合化學合成的手段來實現。其中化學全合成法由于合成路線長、涉及試劑材料繁多、成本高、工藝復雜而難以控制、分離提純困難等諸多不利因素而使其應用受到極大限制。相比之下，生物技術的引入，使米格列醇的制備從根本上變得現實可行。從已見報道的幾條化學合成結合生物轉化的制備線路來看，以先從葡萄糖化學合成得到N-(2-羥乙基)-葡萄糖胺(I)、再生物氧化獲取關鍵中間體6-(2-羥乙基)-氨基-6-脫氧-α-L-山梨呋喃糖(II)、最后經氫化還原得到米格列醇(III)的方法最為理想(參見EP 0 477 160 A1)，實用性較強。該制備過程的反應線路如下 I II III轉化底物 中間體 終產物(轉化產物) (米格列醇)作為以上制備線路的關鍵中間體，6-(2-羥乙基)-氨基-6-脫氧-α-L-山梨呋喃糖(II)系來自于以N-(2-羥乙基)-葡萄糖胺(I)為底物的生物轉化過程，而此步生物轉化典型的方案是采用氧化葡萄糖桿菌屬的細菌來進行生物催化。
本發明所要解決的技術問題是通過菌種選育手段改善菌種性能，達到優化培養和轉化環節的目的，從而比現有技術更好地適應工業生產的需要。

發明內容
本發明公開的突變菌株其親株系分離自我國江西省井岡山地區土壤的一株野生菌株，屬于葡萄糖桿菌屬。從親株出發，通過運用一系列的物理、化學誘變和自然選育等處理手段，得到了一株性狀穩定、易培養、轉化效率高的突變株。該微生物菌種已于2004年7月1日在中國微生物菌種保藏管理委員會登記保藏，保藏號CGMCC No.1184，經鑒定該菌種屬于一種氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)。
得到本發明的突變菌株CGMCC No.1184的過程涉及的均為微生物菌種選育領域的常規技術，其中包括出發菌株以物理、化學因子交替誘變操作，其中選用了紫外線、亞硝基胍作為誘變劑，再結合原生質體制備再生以及自然分離，在瓊脂平板上選擇生長較快較好的菌落用于搖瓶初篩進行液體培養考察，即定時對培養液取樣測定OD600值的變化情況。生物轉化過程的考察含以下步驟完成液體培養后離心培養液，收集沉淀物(菌體)；再以無菌水洗滌一遍后離心收集。在三角搖瓶中配制含底物(I)2％、MgSO40.02M的轉化液50ml，高壓滅菌后再加入上述濕菌體3％。在28℃搖床上孵育，對轉化液定時取樣，在甲醇∶氨水(2∶1)的系統中作硅膠薄層層析(TLC)，層析結束將TLC板置150℃烘烤處理，隨后觀察顯色斑點中底物(I)和產物(II)的強度變化。
菌株CGMCC No.1184經鑒定具如下特征1.染色特征革蘭氏染色陰性；抗酸染色陰性。
2.形態特征于30℃培養2天后，細胞呈橢圓形到桿狀體，大小為0.6-0.8μm×1.5-2.0μm；單個、成對生長，罕見成鏈生長，偶有略大的不規則細胞狀(退化體)出現，兩端鈍圓，有的端尖，不形成芽孢，無莢膜，無氣生菌絲體。
3.培養特征在麥芽汁瓊脂和葡萄糖碳酸鈣瓊脂上生長良好，乳白色到微黃色，菌落圓形，表面有突起，粘稠狀。在葡萄糖碳酸鈣酵母膏瓊脂上生長良好，并溶解碳酸鈣。
4.生理生化特征


綜合該菌種的各項特征，其被鑒定為氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacteroxydans)。
連續傳代、增殖培養考察結果表明，菌株CGMCC No.1184性狀穩定，比親株繁殖能力更強、增殖更快，具體表現在培養開始24小時菌體濃度即可達到峰值(參見附圖1)，這樣便使培養周期得以縮短。此外，在培養過程中還發現，該菌種在發酵罐中進行液體好氧培養時產生泡沫較少，即便液體繁殖培養基里少加甚至未加化學消泡劑也不易發生逃液現象。這樣不僅可減少消泡劑支出，還可以進一步避免消泡劑給菌體帶來的潛在毒害作用，有利于菌體以及其中所含的酶系在后續轉化反應系統中更好地發揮其生物轉化功能。事實上，培養繁殖后收獲的菌體被用于生物轉化步驟時確實顯示了轉化反應效率的改善，具體表現為經48小時就可完成整個轉化反應過程，基本上實現底物的完全轉化。由此反映出針對出發菌株所進行的一系列菌株選育工作獲得了有益的效果，在現有技術基礎上明顯縮短了菌體培養時間和轉化反應時間，同時菌體在發酵罐培養過程中產生泡沫也明顯減少。
構成CGMCC No.1184菌種液體繁殖培養基的組分可選自于葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、復合氨基酸和磷酸鹽等，其中碳源含量4％-7％，氮源含量1.5％-3.5％，pH6.0-6.8。該菌株的培養過程條件溫和易控，菌體繁殖旺盛，在28℃環境培養24小時即可達到菌濃度峰值，而且在發酵罐中進行液體培養時因產生泡沫較少故可以減少使用甚至不用化學消泡劑；收獲的菌體用于后續生物轉化中轉化周期也較短，48小時就可結束轉化反應。


圖1CGMCC No.1184菌種在液體培養基中的生長曲線。其中以OD600值反映菌體相對濃度。
具體實施例方式
以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。其中，百分比為重量與體積之比，除非另有說明外。
實施例1菌種的自然分離和NTG誘變處理培養基斜面/平板培養基葡萄糖10.0％，酵母膏1.0％，CaCO32.0％，瓊脂2.4％，pH6.8。此培養基用于出發菌株的培養、菌種的自然分離、菌種常規傳代等目的。
自然分離取菌種的新鮮斜面一支加入少量無菌水，輕輕刮下菌苔倒入裝有無菌玻璃珠和無菌水的三角瓶中，充分振搖10分鐘，用塞有脫脂棉的無菌漏斗過濾，得到菌懸液。菌懸液梯度稀釋后涂布于平板培養基上，于28℃培養到長出單菌落。
NTG誘變以滅過菌的磷酸緩沖液替代上述的無菌水，按以上自然分離的方法，在菌懸液系統中加入NTG于28℃搖床上培養處理30秒-10分鐘，取樣梯度稀釋涂布于平板培養基上，28℃培養。
自然分離或誘變處理后，在長成的菌落中選擇出現得較早或長得較大較豐滿者進行進一步的選育，或者進入搖瓶初篩。
實施例2培養基斜面培養基同實施例1液體培養基D-山梨醇4.5％，葡萄糖2.0％，牛肉浸膏1.5％，酵母粉1.5％，KH2PO42.4％，pH 6.5菌種斜面于28℃培養成熟后，挖塊接種到含液體培養基的搖瓶中于28℃進行液體繁殖培養，以測定培養液的OD600值來反映菌種的繁殖狀況。
實施例3按實施例2程序培養好的菌液作為種子液，接種于100L發酵罐(罐內培養液配方D-山梨醇5.0％，葡萄糖0.5％，酵母浸膏2.4％，KH2PO43.0％，pH6.0)。控制溫度28℃、通氣量1∶1-1.5，攪拌轉速300rpm。培養24小時離心收集菌體。
實施例4在三角搖瓶中配制含底物(I)2％、MgSO40.02M的轉化液50ml，高壓滅菌后再加入實施例3中所述的濕菌體(經無菌水洗滌后再次離心收集)3％。在28℃搖床上孵育，對轉化液取樣，在甲醇∶氨水(2∶1)的系統中作硅膠薄層層析(TLC)。層析結束將TLC板置150℃烘烤處理，觀察顯色斑點中底物(I)和產物(II)的強度變化。結果如下
權利要求
1.一種氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No.1184。
2.權利要求1所述氧化葡萄糖桿菌CGMCC No.1184在6-(2-羥乙基)-氨基-6-脫氧-α-L-山梨呋喃糖制備中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種氧化葡萄糖桿菌突變株CGMCCNo.1184及其在微生物轉化制備6－(2－羥乙基)－氨基－6－脫氧－α－L－山梨呋喃糖中的應用。該菌株具有性狀穩定、培養條件溫和易控、繁殖較快、轉化時間短等優點。
文檔編號C12P19/26GK1916158SQ20051002882
公開日2007年2月21日 申請日期2005年8月16日 優先權日2005年8月16日
發明者陳代杰, 戈梅, 李治川, 陶正利, 陳泉 申請人:上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司, 浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠