專利名稱：生物體成分組成改變了的溶液的調制方法
技術領域：
本發明涉及一種從含有生物體成分的溶液、特別是從人類的血漿、尿等中分離蛋白質等生物分子，來制備生物體成分組成變化了的溶液的方法及制備裝置。特別涉及以臨床蛋白組學分析為目的，除去妨害檢測微量成分的成分、特別是高分子量蛋白質，以制備生物體成分的組成改變了的溶液的方法及其裝置。
背景技術：
近年來，作為后基因組學研究，蛋白組學分析研究(蛋白組學)開始受到重視。作為基因產物的蛋白質被認為比基因更加直接與疾病的癥狀相關，因此期待對蛋白質進行系統研究的蛋白組學分析的研究成果可以在診斷和治療中得到廣泛的應用。而且，發現多種在基因組分析中未能找到病因的蛋白質或疾病相關因子的可能性相當高。
蛋白組學分析之所以能夠高速發展，與技術上可以采用質量分析裝置(mass spectrometerMS)進行高速結構分析是密不可分的，由于MALDI-TOF-MS(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flightmass spectrometry)等的實用化，使多肽的高通量超微量分析成為可能，已可檢測出以前檢測不到的微量蛋白質，成為探索疾病相關因子的強有力的工具。
蛋白組學分析的臨床應用的首要目的是發現由疾病誘導或消失的生物標志物(bio-marker)蛋白質。由于生物標志物的活動與病癥相關，所以除了可以作為診斷的標志物之外，作為藥物開發靶點的可能性也很高。即，蛋白組學分析的成果，由于比特定基因更有可能作為診斷標志物和藥物開發靶點，所以成為后基因組時代的診斷和治療的關鍵技術，而由于確認的生物標志物與患者的藥物反應性評價或副作用的發現預測等的患者可以享受到的利益直接相關，因此可以說對テ一ラ一メ一ド醫療(結合個人基因進行給藥治療的技術)的推進起到了很大作用。
在臨床研究中導入蛋白組學分析時，要求迅速、準確地分析大量被檢測物，而且由于臨床檢測物微量而貴重，所以必須迅速地進行高分解度、高靈敏度和高機能的測定。針對此情況的巨大推動力是質量分析(massspectrometry)，質量分析裝置具有的超高靈敏度，對高通量的特性具有很大貢獻。但是，雖然此類方法和儀器正在快速的改良之中，但還未達到能夠使蛋白組學分析在臨床現場簡便且迅速地實施的狀況。
其原因之一可列舉出臨床檢測物的前處理。作為質量分析的前處理，有必要分級、精制臨床檢測物的蛋白質，目前的狀況是該處理仍需要數天時間，并且由于前處理的操作很繁雜必須要有經驗，這大大阻礙了其在臨床中的應用。如果能通過少量的血液、體液進行全身疾病的診斷和病癥監控，則其實用性將非常高，但由于血漿中含有的蛋白質的多樣性，產生了很多問題。
據推測，人類蛋白質有10萬種或其以上，而僅血清中含有的蛋白質就達到約1萬種，其總量在血清中的濃度約為60～80mg/ml。人血清中的高含量蛋白質是清蛋白(分子量66kDa)、免疫球蛋白(150～190kDa)、運鐵蛋白(80kDa)、結合珠蛋白(＞85kDa)、脂蛋白(數均分子量100kDa)等，任一種均以超過1mg/mL的水平大量存在。另一方面，被認為是病癥的生物標志物或疾病相關因子的肽類激素、白細胞介素、細胞因子等生理活性蛋白質中的多數僅以小于1ng/mL的極微量狀態存在。其含量比與高分子的高含量成分相比，實際上是nano(10-9)到pico(10-6)的水平。就蛋白質的大小而言，蛋白質的全部種類的70％或其以下，分子量為6萬(60kDa)或其以下，上述極微量的生物標志物蛋白質中的任一種基本都包含在該區域中(例如非專利文獻1)。由于這些蛋白質通過腎臟、使一部分從尿中排出，所以不僅可以以血液，并且也可以以尿作為檢測物進行測定。
以一般的血清學檢查進行蛋白組學分析時，首先必須除去成為妨害檢測疾病相關微量成分的分子量為6萬或其以上的高分子成分，并盡量回收分子量小于1.5萬的蛋白質。
作為該高分子量蛋白質的分離、除去方法，目前使用高效液相色譜(liquid chromatographyLC)或二維電泳(2 dimensional-polyacrylamidegel electrophoresis2D-PAGE)，但僅LC或2D-PAGE的操作就需要1～2天。該所需時間與MALDI-TOF-MS或ESI-MS(electrospray ionizationmass spectrometry)等數分鐘的分析時間相比，非常長，分析裝置MS所具有的高通量的巨大優勢不能在臨床蛋白組學分析中得到充分發揮。因此，不得不承認，為了實現在醫療現場進行診斷和治療而在盡量短的時間內獲得分析結果，在現階段仍缺乏實用性，這成為難以在日常的臨床檢查中運用MS的很大原因。
因此，如果從樣品中除去一部分或全部高分子量蛋白質的方法實現高速化，則可以期待飛躍性地提高利用臨床蛋白組學分析進行的臨床檢查的診斷的快速性。具體而言，只要是能代替LC或2D-PAGE的、能用微量的檢測物快速地獲得下述溶液的方法或裝置即可，所述溶液是以目標蛋白質群殘留的形式，改變了生物體成分組成的含生物體成分的溶液。
作為以清蛋白為主要對象物質進行除去的手段，作為已經實用化的制品或公開的技術，有固定了藍色色素等親和配體的載體(已制品化)、通過離心分離過濾將高分子量成分進行分級的離心管形式的裝置(已制品化)、通過電泳原理進行分級的方法、Cohn的乙醇沉淀等傳統的沉淀方法或通過色譜進行分級的方法(例如非專利文獻2)等。
但是，上述的任一種方法的分離性能均不充分，存在不適用于微量樣品或混入對質量分析等有障礙的試劑等問題。特別是以清蛋白為對象、僅用吸附進行除去的方法，雖能除去清蛋白，但難以除去免疫球蛋白等其他6萬或其以上的高分子成分。
另外，在人工腎臟、人工肺、血漿分離裝置等中使用的分離膜，根據其用途，開發有各種大小的產品，雖然也進行了提高對生物體成分的適應性那樣的改善(專利文獻2)，但是沒有暗示能解決臨床蛋白組學中存在問題，即，要高效率地除去清蛋白等高分子量蛋白質。
如果能開發出解決此類問題的方法、裝置，則可以在醫學研究和臨床現場廣泛地進行蛋白組學分析，可以更迅速地進行高精度的檢查、診斷，并可以期待成為探索尚無有效治療方法的疑難疾病的原因或開發其早期的診斷法的強有力的工具。
如上所述，在進行臨床蛋白組學分析時，有必要除去成為妨礙的過剩的高分子量蛋白質。要求一種與2D-PAGE、液相色譜等雖然具有很高的分離能力、但繁雜而費時的方法比較，簡便并且在短時間內具有很高的分離能力的設備。
雖然最近，作為有效的改良過的清蛋白除去法，發表了使用Affi-GelBlue凝膠的方法(非專利文獻3)、使用“Gradiflow”體系的方法(非專利文獻4)等，但是仍沒有實現用于獲得更多信息的分析用溶液的報道。
以血漿中的清蛋白的除去為指標，作為所要求的方法的條件，是使血漿成分高速流動、不出現蛋白質變性作用、進行用于實現高機能化的微細加工、不十分昂貴等。尚未發現解決這些問題的裝置或設備。
非專利文獻1安德森·NL(Anderson NL)，安德森·NG(AndersonNG)著，“人血漿蛋白組學歷史、特征和診斷前景(The human plasmaproteomehistory，character，and diagnostic prospects)”，分子與細胞蛋白組學(Molecular & Cellular Proteomics)，(美國)，美國生物化學與分子生物學協會，有限公司(The American Society for Biochemistry andMolecular Biology，Inc.)，2002年，第1卷，p845-p867。
非專利文獻2日本生化學會編，《新生化學實驗講座(第1卷)蛋白質(1)分離·純化·性質》，東京化學同人，1990年非專利文獻3細胞工程分冊，《生物實驗イラストレイテツド 5》，秀潤社，2001年非專利文獻4N.Ahmed et al.，Proteomics，On-line版，2003年06月23日非專利文獻5D.L.Rothemund等，(2003)，Proteomics，第3卷，279-287頁)專利文獻1日本，特表號公報專利文獻2日本，專利3297707號公報發明內容鑒于上述情況，本發明要解決的課題是提供一種從含有生物體成分的溶液中有效地分離·除去在臨床蛋白組學分析時成為妨害的多余的高分子量蛋白質，來調制適用于蛋白組學分析的生物體成分的組成改變了的含生物體成分的溶液的制備方法及裝置。
本發明中，作為第1發明組，包含以下發明。
1.一種清蛋白相對于總蛋白質的濃度組成比小于0.3的生物體成分的組成發生改變了的溶液的調制方法，其特征在于，將含有生物體成分的溶液，提供至至少β2-微球蛋白與清蛋白的透過比率為50或其以上的分離膜，使其透過分離膜；2.如上所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述分離膜的透過比率為70或其以上；3.如上述任一項所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述濃度組成比小于0.1；4.如上述任一項所述的溶液的調制方法，其特征在于，生物體成分組成改變了的溶液的總蛋白質中的β2-微球蛋白的組成比率，相對于含生物體成分溶液的總蛋白質中的β2-微球蛋白的組成比率，為10倍或其以上；5.如上所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述倍率為100倍或其以上；6.如上述任一項所述的溶液的調制方法，其特征在于，分離膜的膜內的流路為非對稱結構；7.如上述任一項所述的溶液的調制方法，其特征在于，生物體成分是血液、血漿、血清等血液來源物、尿、腹水、唾液、淚液、腦脊髓液、胸水或來自細胞的蛋白質提取溶液；8.一種蛋白組學分析用溶液，是通過上述任一項所述的調制方法得到的；9.一種生物體成分中含有的蛋白質的分析方法，其特征在于，在通過上述任一項的方法制備生物體成分組成改變了的溶液后，對上述溶液中含有的蛋白質進行分析；10.如上述9所述的蛋白質的分析方法，蛋白質的分析方法為選自質量分析、電泳分析和液相色譜中的至少1種；11.一種調制生物體成分組成改變了的蛋白組學分析用溶液的裝置，是具有內置有β2-微球蛋白與清蛋白的透過比率為50或其以上的分離膜的組件的裝置，其特征在于，組件至少具有在分離膜的原液側的含生物體成分的溶液的原液入口和經由分離膜透過的透過液的出口。
另外，本發明中，作為第2發明組，包含以下發明。
1.一種用于調制生物體成分組成改變了的溶液的液流回路，其特征在于，具備以下結構組件，其內置分離膜，具有與上述分離膜的原液側流路連接的原液入口和原液出口以及分離膜的透過液的出口，溶液循環回路，其連接上述原液入口和上述原液出口、在中途具有泵和分離用目標液入口，稀釋液流入口，其設置于上述分離用目標液入口的上游的位置、或上述溶液循環回路中途的位置；2.一種用于調制生物體成分組成改變了的溶液的裝置，其特征在于，含有至少2個上述液流回路，1個液流回路的分離目標液出口與另外1個液流回路的分離目標液入口通過液體流路直接或間接地相連；3.一種生物體成分組成改變了的溶液的調制方法，是使用內置分離膜的組件使含有生物體成分的溶液流入分離膜的原液側，并使原液側的液體通過設置于組件外的溶液循環回路進行循環，取出已透過分離膜的液體作為生物體成分組成改變了的溶液的工藝，其特征在于，在開始流入含有生物體成分的溶液后，使用于含生物體成分溶液的稀釋液追加流入到內置于組件中的分離膜的原液側；4.如上所述的溶液的調制方法，其特征在于，在下述條件下進行分離，所述條件為流入到分離膜的原液側的含生物體成分的溶液的流量Q1與透過的液體的流量Q2滿足0＜Q2/Q1＜1；5.如上所述的溶液的調制方法，Q2/Q1為0.005≤Q2/Q1≤0.5；6.如上述任一項所述的溶液的調制方法，透過的液體的流量Q2與流入到分離膜的原液側的含生物體成分的溶液和稀釋液的流量之和Q3滿足0.5≤Q2/Q3≤1.5；7.如上所述的溶液的調制方法，Q2/Q3約為1；8.如上述任一項所述的溶液的調制方法，其特征在于，稀釋液使用生理鹽水或緩沖溶液；9.如上述任一項所述的溶液的調制方法，其特征在于，生物體成分是血液、血漿、血清等血液來源物、尿、腹水、唾液、淚液、腦脊髓液、胸水或來自細胞的蛋白質提取溶液；10.一種生物體成分組成改變了的溶液的調制方法，其特征在于，使用2個組件，使用利用第1組件用上述任一調制方法得到的溶液，進一步用第2組件進行上述任一種調制方法。
進而，本發明中，作為第3組發明，包含下述發明。
1.一種由生物體成分來調制組成改變了的溶液的方法，是通過對含有生物體成分的溶液進行至少2個工序的處理，由含生物體成分溶液來調制生物體成分組成改變了的溶液的方法，其特征在于，連接使用至少2個工序，所述工序選自(1)吸附一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白質的工序；(2)通過分子篩來分級分子量大于等于清蛋白的蛋白質，并將一部分或全部除去的工序；及(3)濃縮蛋白質的工序。
2.如上所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述(1)工序中，使用含有下述原料的材料，所述原料選自纖維素、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中的1種或其以上；3.如上述任一項所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述(2)工序中，使用含有下述原料的分離膜，所述原料選自纖維素、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯和聚丙烯中的1種或其以上；4.如上述任一項所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述(3)工序中，使用含有下述原料的分離膜，所述原料選自纖維素、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚乙烯和聚丙烯中的1種或其以上；5.如上述任一項所述的溶液的調制方法，將表面固定有下述物質的原料用于工序(1)或工序(2)，所述物質為選自聚乙烯亞胺、氨基甲基吡啶、多酚、藍色色素、2價金屬離子和含烷基化合物中的1種或其以上；6.如上述任一項所述的溶液的調制方法，其特征在于，將下述物質添加至工序(1)或工序(2)中的水溶液中，所述物質選自表面活性劑、乳化劑、有機溶劑、乙醇、乙二醇類、聚丙二醇、聚乙烯亞胺、氨基甲基吡啶、硫酸精蛋白、硫酸銨、多酚、藍色色素、離液鹽和含烷基化合物中的1種或其以上；7.如上述任一項所述的溶液的調制方法，其特征在于，含生物體成分的溶液含有來源于人體成分的檢測物質；8.一種由含有生物體成分的溶液來調制組成改變了的溶液的裝置，其特征在于，具有選自下述裝置中的至少2種裝置，上述選出的裝置之間通過流路來連接，所述裝置為(1)吸附一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白質的裝置、(2)通過分子篩來分級一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白質的裝置、及(3)濃縮蛋白質的裝置；9.一種調制權利要求29所述的溶液的裝置，具有可與液相色譜、電泳裝置或質量分析裝置相連接的液流出路。
通過本發明公開的這些方法或裝置，可在短時間內從以血液、血清、血漿為代表的生物體成分調制出溶液，所述溶液可以檢測出多數目前難以檢測出的微量的蛋白質。


本發明的實施例1、3中使用的分離系統的簡圖。(1個膜分離單元)[圖2]本發明的實施例2中使用的分離系統的示意圖。(2個膜分離單元)[圖3]本發明的實施例4中使用的分離系統的簡圖。(3個膜分離單元)[圖4]本發明的實施例5、6中使用的分離系統的簡圖。(是具有膜分離功能和吸附功能的單元為3個、濃縮單元為1個的例子)[圖5]顯示屬于第3發明組的一例裝置的示意圖。
生物體成分的組成改變了的溶液的電泳照片。
實施例2中得到的生物體成分的組成改變了的溶液的2維電泳照片。
人類血清溶液的2維電泳照片。
符號的說明1閥門2溶液循環回路3循環用泵4處理液回收口5第1工序組件6第2工序組件7第3工序組件8注入用泵100注入用泵101三向閥門102溶液循環回路103循環用泵
104膜分離單元處理液回收口105分離膜組件106組件的下部罐202第2階段溶液循環回路203第2階段循環用泵204第2階段的膜分離單元的處理液回收口205第2分離膜組件206第2階段的組件的下部罐302第3階段溶液循環回路303第3階段循環泵304第3階段的膜分離單元的處理液回收口305第3分離膜組件306第3階段的組件的下部罐402濃縮單元溶液循環回路403濃縮單元的循環泵404濃縮單元的濾液出口405濃縮膜組件406濃縮用組件的下部罐407濃縮單元的處理液回收口具體實施方式
首先對本發明中共同的部分進行說明。
本發明中所說的“生物體成分的組成改變了的溶液”是指，以血液等來源于生物體的溶液即含有生物體成分的溶液作為原液，進行特定處理而改變了蛋白質組成的溶液。這里所說的“血液”，是指人類等動物血液，也包含由血清、血漿等血液中的一部分成分組成的溶液。所謂“來源于生物體的溶液”，除了血液之外至少可列舉出，尿、唾液、淚液、腦脊髓液、腹水、胸水或來自細胞的蛋白質提取溶液等作為生物體相關物質含有蛋白質的溶液。
另外，本發明中所說的“分離膜組件”是指，在外殼中收納分離膜而成的組件。在該外殼中具備，被分離溶液流入的入口和流出的出口、及透過分離膜被分離后的溶液流出的透過液流出口。對上述外殼的原材料并無特別的限定，可列舉出聚碳酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜等塑料制品。
本發明中獲得的含有生物體成分的溶液的組成改變了的溶液，優選用于蛋白質分析、特別是蛋白組學分析。作為分析方法，無特別限定，可以列舉出LC、2D-PAGE、核磁共振(NMR)、MALDI-TOF-MS、ESI-MS等。這些方法，由于以高含有率含有清蛋白等在部分溶液中大量存在的蛋白質，所以成為分析靈敏度降低的分析方法，而通過使用本發明中得到的溶液，可成為高靈敏度分析。另外，對于使用MS、電泳的蛋白組學分析是有用的。對本發明的溶液調制裝置可以直接或間接地連接的MS，沒有特別的限定，但是優選為電子噴霧離子化型、大氣壓離子化型、四極桿(QQQ)型、扇形磁場型、飛行時間型、MS/MS、MSn、FT-MS型、離子捕捉型和它們的組合型。另外，還包含MS/MS或MSn(例如MS3)那樣的串聯MS。在串聯MS的情況下，所有類型的MS都可適用，特別地，使用離子捕捉、四極桿-飛行時間(Q-TOF)、FT-MS、及四極桿與離子捕捉的扇形器件的組合，效率優良。由此，可選擇性的檢測出MS/MS和/或MSn測定中產生的峰。
通過使用本發明的方法或精制裝置得到的溶液，并使用上述分析裝置，如果進一步發展就可收集到各種微量蛋白質成分的結構信息。這些不僅限于肽·質譜指紋(peptide-mass fingerprintPMF)，還包含各肽的一級結構信息(氨基酸序列)。
接下來對第1發明組進行說明。
在第1發明組中，為了得到生物體成分的組成改變了的、特定的清蛋白的濃度組成比小于0.3的溶液，采用下述方法，即，將含有生物體成分的溶液提供至β2-微球蛋白的篩分系數(sieving coefficient)除以清蛋白的篩分系數的值即透過比率為50或其以上的分離膜，收集透過分離膜的液體。另外，為了進行該方法，使用下述裝置該裝置具有內置有β2-微球蛋白與清蛋白的透過比率為50或其以上的分離膜的組件，組件至少具有在分離膜的原液側的含生物體成分溶液的原液入口、及經由分離膜透過的透過液的出口。在上述裝置的組件中，也可在分離膜的原液側具有含生物體成分的溶液的原液出口。
上述分離膜的透過比率優選為70或其以上，更優選為140或其以上，不特別設置上限值，但是在該值過高的膜分離單元中，所期望的分子量小于1.5萬的蛋白質的回收量有可能減少，因此優選為10000或其以下。該分離膜優選使用中空絲膜。在被用于透過蛋白質時，中空絲膜迄今為止被廣泛用作被稱作人工腎臟的透析組件的材料。人工腎臟中使用的分離膜被設計為盡量不使清蛋白等蛋白質透過，可使肌酸酐、尿素等低分子成分透過，使血液流到中空絲內腔側，從中空絲外腔流出生物體所不需要的低分子蛋白質，由此凈化血液。在第1發明組的分離膜中，優選通過中空絲膜從中空絲內腔側透過到外側的方法。特別優選通過在中空絲內腔側盡量不使清蛋白等高分子量成分透過，另一方面，主要使分子量1.5萬或其以下的蛋白質成分透過，來獲得溶液的方法。雖然使用平膜的分離膜也可以獲得同樣的結果，但是由于利用中空絲膜容易增大單位處理液體量的表面積，并且操作上的壓力損失小，所以可有效地實施本發明。
對第1發明組中使用的分離膜的原材料，沒有特別限制，可以使用含有下述高分子的原材料，所述高分子選自纖維素、三乙酸纖維素等纖維素類聚合物、聚碳酸酯、聚砜、聚醚砜等聚砜類聚合物、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯和聚丙烯中的1種或其以上。其中，近年透析器等中經常使用的聚砜，由于分級特性良好，因而是優選的原材料。關于膜結構，優選分離膜的膜內的流路為非對稱結構，進一步優選為由致密層與支持層的多層結構構成的非對稱結構，所述支持層是空隙率高的維持膜強度的支持層。使用電子顯微鏡以1000倍的觀察條件觀察膜的剖面結構，由此來判斷該非對稱結構。通過觀察是否存在沿膜的厚度方向不能充分確認空孔的層、和可以確認空孔的層這兩者，來進行判斷。在可以確認這兩層的情況下，確認為非對稱結構。
另外，在該非對稱結構中，優選原液所接觸的面的附近的空孔最為致密。這是因為可以減少溶質引起的膜表面的堵塞。
第1發明組中使用的分離膜優選盡量不吸附蛋白質，從這一觀點出發，優選表面為親水性的膜。特別是親水性膜可以抑制對蛋白組學分析提供重要信息的蛋白質的吸附，具有可以毫不浪費地回收的效果。作為親水性膜，只要經親水性化，就無特別限制，可以列舉出，親水性單體與疏水性單體共聚而成的膜；親水性高分子與疏水性高分子共混制膜而成的膜；或在由疏水性高分子構成的膜的表面結合、附著親水性聚合物而成的膜；對由疏水性高分子構成的膜的表面進行了化學處理、等離子處理、放射線處理的膜。作為提供親水性成分的化學結構，無特別限制，優選為聚乙二醇等聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羥基乙酯、聚丙烯酰胺等親水性高分子。
進而，可根據需要，進一步進行濃縮蛋白質的工序，即從通過使用上述分離膜進行透過而獲得的液體中除去水分等溶劑。
在濃縮工序中，使用作為平面濾膜的、中空絲膜等的分離膜的、具有分子篩效果的多孔膜，利用分離篩進行濃縮。在樣品為少量時，可使用在市售的離心分離器用試管中貼付有平面過濾膜的濃縮裝置，另一方面，在有大量樣品時，使用中空絲是有效的。
對在濃縮工序中可以使用的膜的材料并無特別限制，可以使用含有下述高分子的原材料，所述高分子選自纖維素、三乙酸纖維素等乙酸纖維素類聚合物、聚碳酸酯、聚砜或聚醚砜等聚砜類聚合物、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯及聚丙烯中的1種或其以上。其中，近年來透析器等中經常使用的聚砜，由于可制得具有分級特性和高透水性的膜，因而是優選的原材料。
關于在濃縮工序中使用的膜的結構，可以使用具有接近于均一結構的海綿狀結構的膜、由致密層與空隙率高的維持膜強度的支持層的多層結構構成的非對稱膜中的任一種。關于濃縮工序中使用的膜的分子分級性能，優選使用具有在生理鹽水中不透過肽類程度的分子分級性能、例如截止值為0.5kDa或其以下，優選為0.1kDa或其以下的性能的膜或超濾膜。
在作為第1發明組的調制目的的生物體成分的組成改變了的溶液中，分子量小于1.5萬的蛋白質的存在比例必須很高，使用分子量為1.16萬的β2-微球蛋白作為本發明中上述存在比例的指標。另外，還必須減少清蛋白、免疫球蛋白、運鐵蛋白等高分子量的蛋白質，這里，以分子量接近6萬的清蛋白為指標。以清蛋白為指標的理由為，在血液的情況下，清蛋白的量為最多，在使用膜的方法的情況下，如果充分除去清蛋白，則通常還可同時除去免疫球蛋白等較大的分子。
另外，為了使用所得到的生物體成分組成改變了的溶液，進行良好的蛋白組學分析，生物體成分的組成改變了的溶液的總蛋白質中的β2-微球蛋白的組成相對于含生物體成分溶液的總蛋白質中的β2-微球蛋白的組成，優選為10倍或其以上，更優選為100倍或其以上，特別優選為1000倍或其以上。這是因為在質量分析裝置等中可注入到裝置中的蛋白質的質量有限，因此這樣可提高測定靈敏度。
如上所述可得到總蛋白質中分子量6萬或其以上的蛋白質的組成比率較低的液體，為了進行高靈敏度分析，蛋白質中的清蛋白的組成比優選小于0.3，進一步優選小于0.1，更進一步優選小于0.01。
以下，使用附圖來對第1發明組的一個形態例進行說明。
圖1為顯示調制第1發明組的溶液的一例裝置的示意圖。液體的流向如箭頭所示。血清等生物體成分檢測物質或含有其的含生物體成分溶液，從注入泵100通過三相閥門101，注入第1分離膜組件105，該組件內置有第1工序的具有特定透過比率的分離膜，利用循環泵103、在由管形成的溶液循環回路102中進行液體輸送、循環。在第1工序中透過分離膜的透過液，從作為透過液出口的第1階段膜單元處理液回收口104處獲得。該形態是工序1的基本單位(單元)。通過此操作得到所期望的蛋白組學分析用液體。在想要進一步除去高分子量蛋白質時，可以連接多個組件。圖2示出了連接2個組件進行2段式處理的例子，圖3示出了連接3個組件進行3段式處理的例子。透過的液體通過與透過液出口的膜分離單元的處理液回收口處直接連接的管子，注入下一步工序的單元中。從存在于工序最下游的單元處的回收口(圖1的裝置中為104，圖2的裝置中為204，圖3的裝置中為304)獲得目標溶液。
圖4為在圖3的裝置中進一步連接了具有濃縮功能的組件的裝置，目標溶液從濃縮單元的處理液回收口407處回收。
下面對第2發明組進行說明。
在第2發明組中，作為生物體成分組成改變了的溶液的調制方法，是使用內置分離膜的組件，使含有生物體成分的溶液流入到分離膜的原液側，使原液側的液體通過設置于組件之外的溶液循環回路進行循環，并取出透過分離膜的溶液的工藝，其特征在于，在流入含生物體成分的溶液后，使用于生物體成分的溶液的稀釋液追加流入內置于組件中的分離膜的原液側。另外，在第2發明組中，作為生物體成分的組成改變了的溶液的調制裝置，其特征在于，具備組件，其內置分離膜、并具有與上述分離膜的原液側流路連接的原液入口及原液出口、以及分離膜的透過液的出口；溶液循環回路，其連接上述原液入口和上述原液出口、在中途具有泵和分離用目標液入口；以及稀釋液流入口，其設置于上述分離用目標液入口的上游的位置、或在上述溶液循環回路中途的位置。
在第2發明組中，所謂分離膜，也是指多孔性的分離膜，可使用平面過濾膜、筒式過濾膜等的平膜型分離膜、中空絲膜等中空狀分離膜中的任一種。特別地，中空絲膜可增大單位液體處理量的膜表面積，也可減少壓損，可以有效地使用。為了增大單位液體處理量的膜表面積，中空絲膜的內徑優選較小，優選為1000μm或其以下，更優選為500μm或其以下。另外，平面過濾膜具有制膜容易且可廉價地制作的優點。作為膜原材料，可列舉出例如，選自纖維素、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯和聚丙烯及它們的衍生物中的1種或其以上的原材料。
在第2發明組中使用的分離膜中，優選使用分子量小于1.5萬的蛋白質與分子量大于等于6萬的蛋白質的透過率比為50或其以上的分離膜。其他的優選的特性、形狀與第1發明組中關于分離膜所述的內容相同。
在關于第2發明組中的溶液的調制的發明中，在分離膜的原液側，使含有生物體成分的溶液流入，然后使用于含生物體成分的溶液的稀釋液流入。這是因為，追加稀釋液可以防止在膜表面過度濃縮，防止分離膜的透過比率的惡化。另外，優選在稀釋液中使用生理鹽水或“緩沖溶液”。作為“緩沖溶液”，可列舉出MES、BIS-TRIS、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、BIS-TRIS PROPANE、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、TRIZMA、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、TRICINE、GLY-GLY、BICINE、PBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS、CABS等。上述緩沖溶液以縮寫表示，詳細的內容可參照和光純藥工業(株)、シグマアルドリツチジヤパン(株)等試劑制造商的產品目錄或MSDS(安全性數據單)。
所謂流入組件的含生物體成分的溶液的流量Q1，是流入組件且在回路中流動的液體的流量，優選大于已被分離的液體被輸送的流量Q2。這是因為考慮到防止分離膜表面處的濃縮、防止堆積物在膜表面的層積、防止膜孔的堵塞等。進而，流入分離膜組件的液體的流量Q1與被分離后的液體被輸送的流量Q2的比率Q2/Q1，優選為0.5或其以下。另外，在流入分離膜組件的液體的流量Q1與分離后的液體被輸送的流量Q2的比率Q2/Q1為0的情況下，由于不進行過濾，而只靠擴散進行物質移動，因而分離的速度變慢，所以優選為0.005或其以上。
透過分離膜的流量Q2與流入組件的稀釋液的流量Q3優選滿足0.5≤Q2/Q3≤1.5的關系，Q2/Q3進一步優選為0.9～1.1，即約為1。
進而，準備2個組件，在第1組件中，如上所述，在追加流入稀釋液的同時，得到生物體成分的組成改變了的溶液，然后使該溶液流入第2組件，進而如果在追加流入稀釋液的同時，進一步調制生物體成分的組成改變了的溶液，則可調制更適合于蛋白組學分析的除去了高分子量蛋白質的溶液。進一步，還可準備第3、第4等追加的組件，進行同樣的工序。
另外，通過根據需要進一步從上述使用1個組件或多個組件的工序中得到的液體中，除去水等溶劑來進行濃縮蛋白質的工序，可以得到生物體成分的組成改變了的溶液。對于該濃縮工序中使用的膜的原材料、結構、性能，與在第1發明組中對濃縮工序所說明的內容相同。
下面，對第3發明組進行說明。
根據第3發明，通過具有吸附、利用篩分的分級和濃縮這3個處理蛋白質的工序中的至少2個工序，可有效地調制含有大量目標蛋白質成分的溶液。
第3發明組中的涉及液體的調制方法的發明，其特征在于，具有選自下述工序中的至少2個工序，所述工序為(1)吸附分子量大于等于清蛋白的蛋白質的工序；(2)通過分子篩來分級分子量大于等于清蛋白的蛋白質，除去其一部分或全部的工序；(3)對蛋白質進行濃縮的工序。
另外，作為調制第3發明組中的含有生物體成分的溶液組成改變了的溶液的裝置，其特征在于，具有選自下述裝置中的至少2種裝置，并且所選出的裝置之間通過流路相連接，所述裝置為(1)將分子量大于等于清蛋白的蛋白質的一部分或全部吸附的裝置；(2)通過分子篩來將分子量大于等于清蛋白的蛋白質的一部分或全部進行分級的裝置；(3)濃縮蛋白質的裝置。在上述裝置中，從蛋白質分析的簡便性出發，優選具有可與液相色譜、電泳裝置或質量分析裝置連接的溶液的流出路徑。
在第3發明組中所說的成為分子量基準的清蛋白，是指來源于人、牛、其他哺乳動物和鳥類的清蛋白，根據作為對象的生物體來決定，但在本發明中，優選以人的清蛋白作為基準。所謂分子量大于等于清蛋白的蛋白質，主要是指，高于清蛋白(分子量6～7萬)的分子量的蛋白質。是否是高于清蛋白的分子量，可以通過所謂SDS-PAGE(sodiumdodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis含有十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠電泳)的方法進行判斷。
下面，對第3發明組中的賦予特征的3個工序或裝置進行說明。
(1)將分子量大于等于清蛋白的蛋白質的一部分或全部進行吸附的工序或裝置此處所說的“吸附”是指，可以溶解在水中的蛋白質通過與存在于工序中的物質相互作用，而被該物質捕捉。
對本工序的吸附中使用的原材料，沒有特別限定，可以使用纖維素、三乙酸纖維素等纖維素類聚合物、聚碳酸酯、聚砜、聚醚砜等聚砜類聚合物、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的任一種原材料的高分子。
另外，作為原材料的形狀，可列舉出，球狀珠子或纖維等形態；以長纖維、短纖維等纖維為原材料來形成編織物、織物、無紡布等布帛的平面狀的形態；中空絲的形態，在各種形態中，表面凹凸大的形狀由于具有增大吸附表面積的效果，因此是優選的。另外，如果為平膜或中空絲膜等透過型分離膜，則由于可以合并進行低分子蛋白質的分離，因此是優選的。
作為基體材料本身的特性，為了不吸附目標溶液中必需的不希望被除去的低分子量蛋白質，可以適當選擇使用表面親水化了的材料；為了選擇性吸附清蛋白等高分子量蛋白質，可以選擇使用進行了疏水化的材料。
作為具有親水性表面的基體材料，可以列舉出，親水性單體與疏水性單體共聚成的材料；親水性高分子與疏水性高分子混合成的材料；或在由疏水性高分子構成的表面結合、附著親水性聚合物的材料；對疏水性高分子構成的表面進行了化學處理、等離子處理、防射線處理的材料。作為親水性成分，優選使用聚乙二醇等聚醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羥基乙酯等親水性高分子。作為疏水性基體材料，可以使用下述材料使用了疏水性物質的材料、在表面導入有疏水性配體的材料。作為疏水性成分，可列舉出例如，甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、乙烯、丙烯等烯烴類；丙烯腈、甲基丙烯腈等具有碳-碳雙鍵的化合物構成的加成聚合物；聚砜、纖維素等聚合物。
進而，還可以使用固定了下述物質中的至少任一種或其以上而成的材料，所述物質為聚乙烯亞胺、氨基甲基吡啶、多酚、藍色色素、2價金屬離子(Zn2+、Ni2+、Co2+、Cu2+等)、具有疏水性基團(甲基、芐基、苯基、氯甲基、辛基、十二烷基等)的化合物(例如乙醇、異丙醇、酰胺甲基化聚苯乙烯)等。
(2)通過分子篩來分級分子量大于等于清蛋白的蛋白質，并將其一部分或全部除去的工序在本工序中，優選使用具有平膜或中空絲膜等形態、具有分子篩效果的多孔膜。特別是如果使用中空絲膜，可以極大地增加分離膜的表面積，因此是有效的。
對本工序中優選使用的膜的原材料并無特別限定，可使用纖維素、三乙酸纖維素等乙酸纖維素類聚合物、聚碳酸酯、聚砜或聚醚砜等聚砜類聚合物、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺尼龍、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯、聚丙烯中的任一種原材料的高分子。其中，近年來透析器等中經常使用的聚砜，因為在進行篩分的不同分子量的物質中，其對低分子量的物質相對于高分子量的物質的篩分系數比很大，分級特性良好，因此是優選的原材料。關于膜結構，可以使用下述膜中的任一種，即，具有接近于均一結構的海綿狀結構的膜；包含致密層與支持層的多層結構的非對稱結構的膜，所述支持層是空隙率高的、用于維持膜強度而設置的、厚度很厚的支持層。非對稱結構的認定方法、非對稱結構優選方式，與第1發明組中說明的內容相同。
作為在分級工序中使用的膜，就膜表面的性質而言，有親水性膜和疏水性膜。
作為親水性膜，可以列舉出，親水性單體與疏水性單體共聚成的膜；親水性高分子與疏水性高分子共混制膜而成的膜；或在由疏水性高分子構成的膜的表面結合、附著有親水性聚合物的膜；對由疏水性高分子構成膜的表面進行了化學處理、等離子處理、防射線處理等的膜。對親水性成分并無特別限制，優選為聚乙二醇等聚醚、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羥基乙酯等親水性高分子。這些親水性膜可以抑制所必需的蛋白質的吸附，具有無浪費地進行回收的效果。
另一方面，在疏水性膜中，只要是可作為膜原材料使用的物質，就無特別限制，可以使用下述物質混入有疏水性成分的物質、或在膜表面導入有疏水性配體的物質。作為疏水性成分，可列舉出例如，甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、乙烯、丙烯等烯烴類、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚1，1-二氟乙烯等由具有碳-碳雙鍵的加成聚合性化合物形成的聚合物、或聚砜、纖維素等聚合物。
進而，還可以使用通過吸附或化學反應固定了下述物質中的任一種或其以上而成的原材料，所述物質為聚乙烯亞胺、氨基甲基吡啶、多酚、藍色色素、2價金屬離子(Zn2+、Ni2+、Co2+、Cu2+等)、具有疏水性基團(甲基、芐基、苯基、氯甲基、辛基、十二烷基等)的化合物(例如乙醇、異丙醇、酰胺甲基化聚苯乙烯)等。
關于膜的分子分級性能，優選使用在生理鹽水中不能通過清蛋白的程度的分子分級性能，例如截止值在50kDa或其以下，進一步在30kDa或其以下的物質。
在工序(1)和工序(2)中，在投入的水溶液中加入各種試劑，可提高吸附或分級性能。具體而言，在工序中使用的水溶液中，可使用表面活性劑、乳化劑、有機溶劑、乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯亞胺、氨基甲基吡啶、硫酸精蛋白、硫酸銨、多酚、藍色色素、離液鹽、具有疏水性基團(甲基、芐基、苯基、氯甲基、辛基、十二烷基等)的化合物(例如乙醇、異丙醇)等中的至少1種或其以上。
例如，通過適當加入可以促進清蛋白凝集的硫酸銨、聚乙二醇、聚乙烯亞胺、離液鹽等，可以使高分子成分的蛋白質發生凝集，促進巨分子化，并促進吸附，抑制從分離膜的漏出，有效地抑制高分子成分的透過。相反，通過適當添加兩性表面活性劑、陰離子型表面活性劑等表面活性劑，可抑制蛋白質之間的相互作用，并通過分子篩有效地進行分級。
(3)濃縮蛋白質的工序所謂濃縮工序，是指對溶液中的蛋白質進行濃縮的工序。這里所說的濃縮工序，當然可以從水溶液中除去水，也可以除去分子量小于等于1kDa的低分子成分。在本工序中，平面過濾膜或中空絲組件的膜，使用多孔膜，通過分子篩進行濃縮。從分子分級性能出發，該工序中使用的膜與上述(2)中的分級工序中使用的分離膜不同。進而，在上述(2)的分級工序中，在使用分離膜的情況下，將透過膜的液體作為所希望的溶液；與在(3)的濃縮工序中，不透過膜的殘留的液體成為所希望的溶液，在這一點上是不同的。
在樣品為少量的情況下，使用在市售的離心分離器用試管中貼付有平面過濾膜的濃縮裝置是有效的，而在有大量樣品的情況下，使用中空絲是有效的。
對濃縮工序中可以使用的分離膜的原材料并無特別限定，可以使用纖維素、三乙酸纖維素等纖維素類聚合物、聚碳酸酯、聚砜或聚醚砜等聚砜類聚合物、聚甲基丙烯酸甲基酯等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的任一種原材料的高分子。其中，近年來透析器等中經常使用的聚砜，由于分級特性良好(即，在進行篩分的分子量不同的物質中，對于低分子量的物質相對于高分子量的物質的篩分系數比很大)，因此是優選的原材料。關于膜結構，可以使用下述膜中的任一種，即，具有接近于均一結構的海綿狀結構的膜；包含致密層與下述支持層的多層結構的非對稱結構的膜，所述支持層是空隙率高、且為了維持膜強度而設置的厚度較厚的支持層。關于非對稱結構的認定方法、優選的狀態，與第1發明組中說明的內容相同。
關于濃縮工序中使用的膜的分子分級性能，可以使用在生理鹽水中不能通過肽的程度的分子分級性能、即截止值為0.5kDa或其以下、進一步為0.015kDa或其以下的分離膜或超濾膜。
在該第3發明組中，用溶液流路來連接各工序的裝置、使得可以連續運轉，由此可獲得能夠簡便且自動地連續運轉的效果。但是，也可以使各工序獨立進行運轉。可使用與液體流路連接的泵進行液體輸送，但在小規模的裝置的情況下，也可使用注射器進行液體輸送。不依靠分離膜而通過離心管型裝置進行濃縮時，也可以進行離心操作。
在第3組的發明方法中，雖然是一個工程，但在該工程為具有2個或其以上的功能的工程的情況下，重復進行該工程2次或其以上的方法也包含在本發明的范圍內，所述2個或其以上功能由選自(1)分子量大于等于清蛋白的蛋白質的吸附工序；(2)通過分子篩來分級分子量大于等于清蛋白的蛋白質，除去其一部分或全部的工序；(3)濃縮蛋白質的工序實現。在第3發明組的裝置中，雖然是一個裝置，但在該裝置是具有2個或其以上的功能的裝置的情況下，連接2個或其以上該裝置的裝置也包含在本發明的范圍內，所述2個或其以上的功能由選自(1)分子量大于等于清蛋白的蛋白質的吸附裝置；(2)通過分子篩來分級分子量大于等于清蛋白的蛋白質，除去其一部分或全部的裝置；(3)濃縮蛋白質的裝置實現。
上述(1)～(3)的工序中，通過進一步重復同一工序，可進一步減少清蛋白相對于總蛋白質質量的比率，獲得所謂提高作為分析對象的低分子量的蛋白質的比率的優良效果。關于是重復進行同一工序、還是使用不同的2個工序，可根據最初提供的生物體成分中含有的蛋白質組成的程度進行設計。
根據第3發明組所述的調制方法，在健康成人的血漿的情況下，隨著其中的蛋白質組成的不同，通過操作1次本發明，可得到分子量為50kDa或其以上的高分子量蛋白質的除去率為90％或其以上，分子量小于50kDa的蛋白質的平均回收率為70％或其以上，分子量小于50kDa的蛋白質的平均濃縮率為10倍或其以上的效果。
另外，可將1次處理的時間控制在1～6小時以內。另外，從防止來自別的檢測物質的污染和生化危害的觀點出發，優選使用一次一系列的裝置，本發明的方法中使用的裝置可制成可廢棄處理型，從避免來自檢測物質的污染及確保分析的重現性的觀點出發，有很大優勢。
在第3組的發明中，該發明適合于從含生物體成分的水溶液含生物體成分的溶液、特別是人的血漿、尿、唾液、淚液、腦脊髓液、腹水、胸水等中分離生物分子特別是蛋白質成分。上述所示的膜和中空絲組件的尺寸及液體的流速，依賴于作為原材料的血漿、尿等生物體材料的質和量進行適當的決定，但是在以所謂桌上規模(desk-size)進行實施的時候，血漿以1～400mL，優選以5～100mL進行實施，流速以1～20mL/min，優選以2～10mL/min進行實施。
以下，對于屬于第3發明組的使含生物體成分的水溶液含生物體成分的溶液的組成發生改變的方法及以此為目的的裝置的一個形態例，使用圖進行說明。
圖5為屬于第3發明組的裝置之一例的示意圖，為按照吸附、分級、濃縮的順序的3工序的例子。液體的流向以箭頭所示。血清等材料的檢測物，或含有其的含生物體成分的水溶液含生物體成分的溶液，經過注入用泵8、閥門1注入至具有吸附、分級和濃縮的任一種功能的第1工序組件5中，通過泵3輸送液體至由管子形成的溶液循環回路2中，進行循環。在第1工序中處理得到的溶液，由處理液4得到。該形態是所謂的單工序單位。圖5示出3段式的例子，第2工序的組件6與第3工序的組件7相連。得到的溶液通過連接于處理液回收口的管子注入至下一個工序的組件中。
通常，在通過分子篩進行分級的工序的情況下，工序的出口即處理液的回收口成為透過液的出口；吸附工序的情況下的出口成為設置在溶液循環回路中途的出口，但是在使用透過型的膜進行吸附時，透過液的出口成為工序的出口。濃縮工序的情況下的出口成為設置于溶液循環回路的中途的出口。在圖5的形態中，各循環用泵被設置于各工序的下游，該循環用泵也可被設置于各工序的上游。
在所選出的工序中、濃縮工序處于最下游的情況下，各工序的處理可以同時進行，可以在短時間內進行以前分別需要花費長時間進行的處理。
實施例
<透過比率的測定方法>
將人血清(SIGMA社H1388或同等品)在3000rpm、15分鐘的條件下進行離心處理，除掉沉淀物以后，以0.45μm的過濾器進行處理。
準備內置有分離膜的分離膜組件，通過用管子連接原液(人血清)側入口和原液側(人血清)出口，來構成溶液循環回路。在溶液循環回路的中途，從原液側出口至原液側入口的方向上，按照順序設置有樣品罐、可不經循環地廢棄溶液的切換閥門、使溶液流入溶液循環回路的流入路徑、循環原液的泵、樣品罐。另外，從組件的過濾側出口開始連接管子，按順序設置有用于進行過濾的泵、過濾的液體的出口(樣品罐)。通過流入路徑，對分離膜組件充填PBS(日本制藥社制ダルベツコPBS(-))水溶液。(以下、將該水溶液簡單稱作“PBS”)。從原液側入口開始、以原液循環流量1m/min、過濾流量0.2ml/min的流速、在20℃下對人血清開始進行過濾。在過濾過程中，通過切換位于溶液循環回路中途的用于廢棄溶液的閥門，來無返回地廢棄組件出口的原液。在保持原樣的情況下，在注入人血清開始后的30分鐘到60分鐘之間，分別從組件原液入口附近的樣品罐、組件原液出口附近的樣品罐和組件過濾側出口附近的樣品罐中收集樣品。測定這些樣品中的清蛋白和β2-微球蛋白的濃度，根據這些測定值計算出清蛋白和β2-微球蛋白的篩分系數。此時的原液側濃度采用從組件入口和出口附近的各樣品罐收集的樣品的濃度的平均值。然后將得到的β2-微球蛋白的篩分系數除以清蛋白的篩分系數得到的值作為透過比率。另外，本實施例中的清蛋白濃度的測定是委托エスア一ルェル(株)進行測定的，項目編號07214(乳膠凝集免疫法)。該測定中，對于達到清蛋白濃度為0.4mg/L或其以下即達到測定極限或其以下的部分，利用BETHYL社制Human Albumin ELISA Quantitation Kit(Cat No E80-129)進行測定。β2-微球蛋白濃度的測定是委托エスア一ルェル(株)進行測定的，項目編號02103(乳膠凝集免疫法)。
<利用2維電泳的蛋白質分析>
通過2維電泳法對原來的含有生物體成分的溶液及通過本發明的方法得到的“生物體成分的組成改變了的溶液”進行分析。方法如下所述。
1.在生物體成分分離溶液中加入等量的80％蔗糖，作為電泳用樣品。
2.將市售的等電點電泳用凝膠IEF-PAGEmini pH3-10 1mm厚(TEFCO制)設置于電泳槽中。
3.加入200ml上部緩沖液(0.05M氫氧化鈉)和500ml下部緩沖液(0.01M磷酸)。
4.用上部緩沖液洗滌各孔，在孔中加入20μl10％蔗糖溶液。
5.在孔中加入了蔗糖溶液的下面放置用1.的方法制備的樣品。
6.蓋上電泳槽，連接電源，以100V30分鐘、200V30分鐘、進一步以500V60分鐘進行電泳。
7.剝離凝膠盒的塑料板，取出凝膠，浸泡在40％的醋酸水溶液中，振蕩30分鐘。
8.在考馬斯亮藍染色液(CBB染色)中染色5分鐘，在脫色液(10％甲醇，7.5％醋酸)中脫色，發現染色帶，在換水的同時進行水洗30分鐘或其以上。
9.從凝膠中切出1條膠。
10.將切出的凝膠片在SDS-PAGE用電泳緩沖液中浸泡10～20分鐘，使之平衡化。SDS-PAGE用電泳緩沖液(以下稱為電泳緩沖液)的組成為在3.0gTRIS、14.4g甘氨酸、1.0gSDS中加入蒸餾水制成1000ml的溶液。
11.將市售的SDS-PAGE用凝膠SDS-PAGEmini 4-20％ 1.5mm厚2-Dwell(TEFCO制)設置于電泳槽中。
12.加入電泳緩沖液，用電泳緩沖液洗孔。
13.將9.的凝膠片在不使氣泡進入的條件下小心地轉移至2維的SDS-PAGEmini的孔中，在小孔中加入1μl市售的分子量標志物rainbowmarker(Amersham)。
14.用1％瓊脂糖/電泳緩沖液(調制時稍稍添加能目視觀察到著色程度的量的溴酚藍)制備凝膠。
15.蓋上電泳槽，連接電源，以15mA電泳120分鐘左右(直至溴酚藍移動至凝膠的下端部分)。
16.從凝膠盒中取出凝膠，進行CBB染色和銀染色。銀染色使用市售的銀染色IIキツトワコ一(和光純藥社制)試劑盒。
(實施例1)將18重量份聚砜(ソルベ一社制ュ一デル(注冊商標)P-3500)和9重量份聚乙烯吡咯烷酮(BASF社制K30)加入至72重量份N，N’-二甲基乙酰胺與1重量份水的混合溶劑中，在90℃下加熱14小時進行溶解，得到制膜原液。將該制膜原液通過外徑0.3mm、內徑0.2mm的孔型雙重圓筒型口模的外側的管子排出。將由58重量份的N，N’-二甲基乙酰胺和42重量份的水構成的溶液作為芯液通過內側管排出。排出的制膜原液通過了從口模至凝固浴液面的350mm的距離后，導入至100％的水凝固浴中，得到中空絲膜。利用電子顯微鏡(日立社制S800)確認得到的中空絲膜的結構，結果是具有非對稱結構。將10000根得到的中空絲膜插入至與一般的透析器同樣具有透析液入口和透析液出口的圓筒狀的塑料殼體中，兩端部分用樹脂密封，制成有效膜面積為1.6m2的中空絲膜組件。用水洗滌該中空絲膜組件，然后在該組件充填有水的狀態下照射γ射線。組件的γ射線吸收量為27kGy。
切取該組件的中空絲膜，捆100根，在不閉塞中空絲膜中空部分的情況下，用環氧類的封裝劑將兩末端固定于玻璃管組件殼體上，制成微型組件。該微型組件的外直徑約為7mm，全體長度約為17cm，具有2個與一般的中空絲膜型透析器相同的中空絲的外側罐。用蒸餾水洗滌該微型組件的中空絲膜和組件內部。
然后，填充PBS(日本制藥社制ダルベツコPBS(-))水溶液，得到中空絲膜微型組件(以后簡稱為微型組件(1))。制備2個該微型組件，使用其中1個測定分離膜的透過比率，結果為70.5。將剩下的1個用于以下實驗。
將人血清(SIGMA社H1388，Lot 28H8550)在3000rpm、15分鐘的條件下進行離心處理，除掉沉淀物，然后用0.45μm的過濾器進行處理。
蓋上微型組件(1)外側的一個罐，另一個罐連接硅制管，并與透過用蠕動泵相連。另一方面，中空絲膜內側的液體通過硅制管連接組件的原液入口和原液出口，來形成溶液循環回路，使用蠕動泵來使血清可以循環。另外，在溶液循環回路的中途處設置追加供給PBS的入口。
使用4ml血清、以循環流量5ml/min、過濾流量0.2ml/min的流速在20℃下實施過濾4小時(本工序相當于主要分級比清蛋白更大的蛋白質的工序)。在血清中添加此時過濾的容量份的PBS以確保循環的液體的量恒定。在52.5ml經4小時得到的濾液即生物體成分的組成改變了的溶液中的清蛋白的濃度為61mg/l，α1-微球蛋白濃度為0.4mg/l，β2-微球蛋白濃度為0.066mg/l。使用的人血清中的總蛋白質濃度為53000mg/l，清蛋白濃度為33000mg/l，α1-微球蛋白濃度為16.5mg/l，β2-微球蛋白濃度為1.17mg/l，確認清蛋白的濃度發生大幅下降。
使用Micro BCA Protein Assay(PIERCE社制)，以BSA作為標準曲線，來測定溶液的總蛋白質。濾液中的總蛋白質濃度為275mg/l，清蛋白濃度相對于總蛋白質濃度為0.22。另外，β2-微球蛋白濃度相對于總蛋白質，在人血清中為0.0000223，與此相對，在濾液中為0.00024，增加至10.8倍。
(實施例2)將18重量份聚砜(ソルベ一社制ュ一デル(注冊商標)P-3500)和9重量份聚乙烯吡咯烷酮(BASF社制K30)加入至72重量份N，N’-二甲基乙酰胺與1重量份水的混合溶劑中，在90℃下加熱14小時進行溶解，得到制膜原液。將該制膜原液通過外徑0.3mm、內徑0.2mm的孔型雙重圓筒型口模的外側的管子排出。將由58重量份的N，N’-二甲基乙酰胺和42重量份水組成的溶液作為芯液通過內側管排出。排出的制膜原液通過從口模至凝固浴液面的350mm的距離后，導入至100％的水凝固浴中，得到中空絲膜。利用電子顯微鏡(日立社制S800)確認得到的中空絲膜的結構，結果是具有非對稱結構。將10000根得到的中空絲膜插入至與一般的透析器同樣具有透析液入口和透析液出口的圓筒狀塑料殼體中，兩端部分用樹脂密封，制成有效面積為1.6m2的中空絲膜組件。將含有0.1重量％的作為陽離子性親水性高分子的聚乙烯亞胺(BASF社制，重均分子量100萬)的水溶液，填充至該中空絲膜組件的中空絲膜內面側及外面側。然后，用γ射線照射該組件。組件的γ射線吸收量為27kGy。切取該組件的中空絲膜，捆100根，在不閉塞中空絲膜中空部的情況下，用環氧類的封裝劑將兩末端固定于玻璃管組件殼體上，制成微型組件。該微型組件的外直徑約為7mm，全體長度約為17cm，與一般的中空絲膜型透析器同樣具有2個中空絲的外側罐。用蒸餾水洗滌中空絲膜和組件內部。然后，填充PBS(日本制藥社制ダルベツコPBS(-))水溶液，得到聚乙烯亞胺固定化中空絲膜微型組件(以后簡稱為微型組件(2))。制備2個該微型組件，使用其中1個來測定分離膜的透過比率，結果為400。將剩下的微型組件用于以下實驗。
將人血清(SIGMA社H1388，Lot 28H8550)在3000rpm、15分鐘的條件下進行離心處理，除去上清液和沉淀物后，用0.45μm的過濾器進行處理。
首先，與實施例1同樣，準備中空絲膜微型組件(微型組件(1))，蓋上中空絲外側的一個罐，另一個罐連接硅制管。用硅制管連接原液入口和出口，使中空絲膜的內側液體形成溶液循環回路，并在中途設置蠕動泵、使原液可以循環。在溶液循環回路中途設置三向閥門，在一向中通過管子設置注入用泵。進而，微型組件(2)也蓋上外側的一個罐，另一個罐連接硅制管。另外，在該微型組件中，中空絲膜內側的液體通過連接原液入口和出口，形成溶液循環回路，并在中途設置蠕動泵使溶液可以循環。另外，在該溶液循環回路中途設置三向閥門。
使微型組件(1)的外側的罐連接的硅制管與設置于微型組件(2)的溶液循環回路中途的三向閥門接合。然后，在這些管和2個組件中充填PBS，制成圖2所示那樣的微型組件2段串聯連接的系統。這里，微型組件(1)的使用，相當于分級分子量大于等于清蛋白的蛋白質的工序；微型組件(2)的使用，相當于具備以下兩種功能的工序，所述功能是吸附分子量大于等于清蛋白的蛋白質的功能、及分級分子量大于等于清蛋白的蛋白質的功能。
通過注入用泵，通過管供給血清，在微型組件(1)和微型組件(2)各自的溶液循環回路的循環流量為5ml/min、過濾流量為0.2ml/min的流速的條件下、在20℃實施過濾4小時。通過注入用泵來添加此時過濾出的溶液的容量份的PBS，以確保循環的液體的量恒定。
經4小時后，由組件(2)得到的濾液、即生物體成分的組成改變了的溶液中的清蛋白的濃度為0.62mg/L，α1-微球蛋白濃度為0.036mg/L，β2-微球蛋白濃度為0.05mg/L。使用的人血清中總蛋白質濃度為53000mg/l，清蛋白濃度為33000mg/l，α1-微球蛋白濃度為16.5mg/l，β2-微球蛋白濃度為1.17mg/l，確認清蛋白的濃度發生大幅下降。濾液中的總蛋白質濃度為8.1mg/l，清蛋白的濃度相對于總蛋白質的濃度的比例為0.08。另外，β2-微球蛋白濃度相對于總蛋白質，在人血清中為0.0000223，與此相對，在濾液中為0.00617，增加至277倍。
該樣品經過二維電泳進行分析的結果示于圖7。
圖7為使用3000μl實施例2中得到的生物體成分的組成改變了的溶液而得到的濃縮液的2維電泳照片。由圖7可以判明，分子量小于6萬時可見很多獨立斑點。由本裝置分離的樣品在低分子量區域得到了很多斑點。
(比較例1)將分離前的人血清作為比較樣品進行2維電泳分析。結果示于圖8。圖8為將0.5μl實施例2中的處理前的人血清作為樣品的2維電泳照片。在圖8中，斑點寬大，無法確定物質，而且在低分子量區域幾乎觀察不到斑點。
(實施例3)切下東麗株式會社透析器BS1.8L(Lot.20440312)的兩端的樹脂粘結部分，得到中空絲膜。得到的中空絲膜的尺寸為內直徑200μm、膜厚40μm，利用電子顯微鏡(日立社制S800)確認得到的中空絲膜的結構，結果為具有非對稱結構。
將該中空絲膜捆100根，在不閉塞中空絲膜中空部的情況下，用環氧類的封裝劑將兩末端固定于玻璃管組件殼體上，制成微型組件。該組件的內直徑約為5mm，長約為17cm，與一般的中空絲膜型透析器同樣具有2個中空絲膜的內側罐(血液罐)和2個外側罐(透析液罐)。用蒸餾水洗滌該微型組件的中空絲膜和組件內部。然后，填充PBS(日本制藥社制ダルベツコPBS(-))水溶液，得到中空絲膜微型組件(以下簡稱為微型組件(3))。制備2個該微型組件，使用其中1個來測定分離膜的透過比率，結果為149。將剩下的1個微型組件用于以下實驗。
將人血清(SIGMA社H1388，Lot 122K0424)在3000rpm、15分鐘的條件下進行離心處理，除掉沉淀物后，用0.45μm的過濾器進行處理。
如圖1所示，在微型組件(1)的外側罐中，蓋上組件的下部罐106，將上部罐作為膜分離單元的處理液回收口104。中空絲膜內側的液體經硅制管連接原液入口和出口而形成溶液循環回路102，并在中途設置作為蠕動泵的循環用泵103、使血清得以循環。另外，在溶液循環回路102中途設置三向閥門101，在三向閥門101的一向中安裝注入用泵。
通過注入用泵，以1.0ml/min的流速加入4ml血清，然后以循環流量10ml/min、過濾流量1.0ml/min的流速在20℃下實施過濾50分鐘。此時，在循環回路中加入與通過透過而過濾的容量相當的容量的1.0ml/min的流速的PBS，以確保循環的液體的量恒定。在約50ml經50分鐘而得到的溶液中，清蛋白的濃度為32.8mg/l，α1-微球蛋白濃度為0.06mg/l，β2-微球蛋白濃度為0.068mg/l，作為原液使用的人血清中的總蛋白質濃度為48000mg/l，清蛋白濃度為29800mg/l，α1-微球蛋白濃度為13.2mg/l，β2-微球蛋白濃度為1.27mg/l。用作原液的人血清中的總蛋白質質量為192000μg，清蛋白質量為119000μg，α1-微球蛋白質量為52.8μg，β2-微球蛋白質量為5.08μg，與此相對，濾液的總蛋白質質量為56000μg，清蛋白質量為1640μg，α1-微球蛋白質量為3.00μg，β2-微球蛋白質量為3.40μg，可維持β2-微球蛋白的量，并且可大幅度除去清蛋白。通過該結果可知，清蛋白相對于總蛋白質濃度的組成比率為0.15。另外，β2-微球蛋白相對于總蛋白質的組成比率，在血清中為0.0000265，與此相對，在濾液中為0.00613，增加為23倍。
(實施例4，比較例2)使用實施例(3)中得到的中空絲膜(透過比率149)，制成1個微型組件。微型組件的形狀、中空絲膜的根數與實施例3相同。下面將該微型組件稱為微型組件(4)。另外，將40根實施例3得到的中空絲膜(透過比率149)，固定于內直徑約為5mm，長度約為12cm的玻璃管組件殼體上，與實施例1同樣制成2個微型組件(以下簡稱為微型組件(5))。將這些微型組件用于以下實驗。
將人血清(SIGMA社H1388，Lot 122K0424)在3000rpm、15分鐘的條件下進行離心處理，除掉濾液和沉淀物后，用0.45μm的過濾器進行處理。
首先準備1個微型組件(4)，蓋上外側罐中的一個，另一個罐連接硅制管。中空絲膜的內側液體通過硅制管連接原液入口和出口，形成溶液循環回路，并在該回路中設置蠕動泵、使溶液得以循環。在上述溶液循環回路中途設置三向閥門，在三向閥門的一個方向上安裝注入泵。將此作為第1階段的膜分離單元。進而，對于微型組件(5)中的一個微型組件，也蓋上外側的一個罐，另一個罐連接硅制管。微型組件(5)的中空絲膜內側的液體也通過硅制管連接組件的原液入口和出口來形成溶液循環回路，并在該回路中設置蠕動泵、使溶液得以循環。進而，在上述溶液循環回路中途設置三向閥門。將此作為第2階段的膜分離單元。進而，蓋上另一個微型組件(5)的一個外側罐，另一個罐連接硅制管。第2個微型組件(5)的中空絲膜內側的液體也通過硅制管連接組件的原液入口和出口、來形成溶液循環回路，并在回路中途設置蠕動泵、使溶液得以循環。進而，在上述溶液循環回路的中途設置三向閥門。將此作為第3階段的膜分離單元。然后將連接于各組件的外側的罐的硅制管連接至下一階段的膜分離單元的三向閥門上，向分離系統全體內填充PBS，制成圖3所示的具有3段膜分離單元的分離系統。
圖3為在該實施例中使用的分離系統的示意圖。液體的流向如箭頭所示。血清和稀釋液(PBS)從注入泵100開始，經三向閥門101進入溶液循環回路102中，進而通過循環用泵103被輸送，注入到第1分離膜組件105(微型組件(4))中，然后，在溶液循環回路102中循環。第1膜分離單元中得到的溶液，從膜分離單元的處理液回收口104處取出。然后，該溶液流入第2階段的膜分離單元，注入第2階段的分離膜組件205(第1微型組件(5))，進一步通過第2階段循環用泵203在第2階段溶液循環回路202中循環。在第2膜分離單元的第2階段的分離膜組件205中透過的溶液，從處理液回收口204處取出。進一步，使該溶液流入至第3分離膜單元，注入至第3分離膜組件305(第2個微型組件(5))，進行循環。透過第3分離膜單元的溶液，從處理液回收口304處取出。
詳細的條件如下所述。以0.2ml/min的流速將4ml血清加入第1階段膜分離單元以后，在第1階段膜分離單元、第2階段膜分離單元、第3階段膜分離單元都在流量5.0mL/min的條件下使其在溶液循環回路中循環，并使各分離膜組件的過濾流量以0.2mL/min的流速在20℃下實施4小時的過濾。此時，將經透過而過濾的容量份的PBS以0.2ml/min的流速、經注入泵100加入至第1膜分離單元中，以保持循環的液體量恒定。經4小時而得到的溶液，大約為47ml。使用ザルトリウス社制vivaspin20(3000MWCO型)使該溶液濃縮至4ml，結果清蛋白的濃度為0.38mg/l，β2-微球蛋白濃度為0.583mg/l，用作原液的人血清中的總蛋白質濃度為49000mg/l，清蛋白濃度為31200mg/l，β2-微球蛋白濃度為1.19mg/l。用作原液的人血清的總蛋白質質量為196000μg，清蛋白質量為124800μg，β2-微球蛋白質量為4.76μg，與此相對，濾液的總蛋白質質量為100μg，清蛋白質量為1.5μg，β2-微球蛋白質量為2.3μg，可維持β2-微球蛋白量，并且可以大幅度除去清蛋白。通過該結果可知，清蛋白相對于總蛋白質濃度的組成比例為0.02。另外β2-微球蛋白的濃度相對于總蛋白質，在血清中為0.0000243，與此相對，在濾液中為0.0307，增加為1263倍。
使用ザルトリウス社制vivaspin500(3000MWCO型)來濃縮該樣品、直至樣品容量為原來的1/10，等量加入樣品緩沖液(向0.5ml 0.5M Tris-鹽酸(pH6.8)、0.4M甘油、0.8ml 10％SDS、0.1ml 0.1％溴酚藍中加入蒸餾水制成10ml溶液)，在沸水中加熱3分鐘的溶液中取25μl進行電泳分析。結果在圖6的S3電泳道處示出。將市售的分子量標志物Rainbowmarker(Amersham Biosciences，RPN756)加入至S1電泳道，另外，為進行比較，向實施例4的分離系統處理前的人血清(相當于0.02μl)中加入樣品緩沖液、并在沸水中加熱3分鐘，將所獲得的溶液上樣至S2電泳道，使S1至S3電泳道的樣品同時進行電泳，結果合并示于圖6中。
從S2電泳道可知，人血清中，分子量大于等于6萬的區域存在大量蛋白質，分子量小于等于1.5萬的區域只觀察到很少量的蛋白質。與此相對，從S3電泳道可確認，經分離系統處理的實施例4的濾液的濃縮液，分子量大于等于6萬的區域蛋白質少，分子量小于等于1.5萬的區域有大量的蛋白質。
(實施例5)在照射γ射線之前，從組件上切下實施例1中制成的中空絲膜，準備100根。在50℃、相對濕度13％的氣氛下干燥24小時。與實施例4同樣操作，用環氧類的封裝劑將該中空絲膜的兩末端固定于玻璃管組件殼體上，制成微型組件。用蒸餾水洗滌該組件的中空絲膜及組件內部。然后，填充PBS(日本制藥社制ダルベツコPBS(-))水溶液，得到濃縮用中空絲膜微型組件(以下簡稱為微型組件(6))。
進而，蓋上微型組件(6)中外側的一個罐，另一個罐作為濾液出口。該微型組件(6)的中空絲膜內側的液體通過硅制管連接組件的原液入口和出口、而形成溶液循環回路，并使用蠕動泵以使原液可以循環。另外，在溶液循環回路中途設置三向閥門。并將此作為濃縮膜單元。
新制成實施例4中使用的具有3段膜分離單元的分離系統。用硅制管連接第3階段的微型組件的處理液回收口和濃縮膜單元的三向閥門。另外，在濃縮膜單元的溶液循環回路的中途，設置由三向閥門構成的濃縮單元的處理液回收口，使濃縮操作過程中只打開溶液循環回路。向系統全體中填充PBS，制成膜分離單元與濃縮蛋白質的單元直接連接的復合系統，所述膜分離單元通過分子篩分級分子量大于等于清蛋白的蛋白質。
圖4為該實施例5中使用的分離系統的示意圖(膜分離單元和濃縮單元的例子)。液體的流向如箭頭所示。血清和稀釋液(PBS)經過注入泵100、三向閥門101注入溶液循環回路102中，進一步通過循環用泵103被輸送，注入第1分離膜組件105(微型組件(4))中，然后在溶液循環回路102中循環。在第1膜分離單元中處理過的溶液，從膜分離單元的處理液回收口104處獲得。然后，該溶液被注入第2分離膜組件205(第1微型組件(5))，在第2階段循環回路202中循環。用第2膜分離單元處理過的溶液，從處理液回收口第2階段膜分離單元的處理液回收口204處獲得。進一步，使該溶液注入至第3分離膜組件305(第2個微型組件(5))，在第3階段溶液循環回路302中循環。經第3膜分離單元處理過的溶液，從處理液回收口304處取出。進一步，將該處理液注入至濃縮膜組件405(微型組件(6))，在濃縮單元循環回路402中進行循環。此時，從濃縮膜組件中透過的液體，在濃縮單元的濾液出口404處取出，并廢棄。在透過、濃縮操作結束后，通過開放濃縮單元的處理液回收口407而取出殘留在濃縮膜組件的循環回路402中的溶液。
具體的條件如下所述。以0.2ml/min的流速將1ml血清加入第1階段膜分離單元，然后在第1階段膜分離單元、第2階段膜分離單元、第3階段膜分離單元都在流量0.5mL/min的條件下、使其在溶液循環回路中循環，并使各組件的過濾流量以0.2mL/min的流速在20℃下實施4小時的過濾。此時，以0.2ml/min的流速從注入泵100加入所濾過的容量份的PBS，以保持在各分離單元和濃縮單元中循環的液體量恒定。
在運行4小時后，由泵407取出的溶液的清蛋白的濃度為0.490mg/l，β2-微球蛋白濃度為0.502mg/l，作為原液使用的人血清中總蛋白質濃度為49000mg/l，清蛋白濃度為31200mg/l，β2-微球蛋白濃度為1.19mg/l。作為原液使用的人血清中的總蛋白質質量為196000μg，清蛋白質量為124800μg，β2-微球蛋白質量為4.76μg，與此相對，在3.7ml濾液中，清蛋白量為1.81μg，β2-微球蛋白濃度為1.86μg，可維持β2-微球蛋白的量，并且大幅度除去了清蛋白。通過該結果可知，清蛋白相對于總蛋白質濃度的組成比為0.0297。另外，β2-微球蛋白的濃度相對于總蛋白質，在人血清中為0.0000243，與此相對，在濾液中為0.0304，增加為1253倍。
(比較例3)使用采用市售的平膜的分離系統(使用聚醚砜膜)，在3000rpm的條件下，對4.7ml用PBS稀釋4倍的血清進行過濾。
清蛋白濃度為5755mg/l，β2-微球蛋白濃度為0.534mg/l，作為原液使用的人血清中的清蛋白濃度為128.5mg/l，β2-微球蛋白濃度為0.446mg/l。作為原液使用的人血清中的清蛋白質量為27049μg，β2-微球蛋白質量為2.51μg，與此相對，濾液中的清蛋白質量為578μg，β2-微球蛋白濃度為2.01μg。β2-微球蛋白與清蛋白的透過比率(這里，將濾液的濃度除以原液濃度得到的值作為透過率，將β2-微球蛋白的透過率除以清蛋白的透過率得到的值作為透過比率)為較低的40。清蛋白的濃度組成比也為較高的0.32。
(實施例6)代替實施例5的內置于微型組件(6)的中空絲膜而使用實施例2的微型組件(2)中使用的中空絲膜，除此以外，制得與實施例5相同復合系統。
與實施例5同樣地對1ml血清進行處理，4小時后從處理回收口407取得的液體的清蛋白的濃度為0.3mg/l，β2-微球蛋白濃度為0.515mg/l，作為原液使用的人血清中的總蛋白質濃度為49000mg/l，清蛋白濃度為31200mg/l，β2-微球蛋白濃度為1.19mg/l。作為原液使用的人血清中的總蛋白質質量為196000μg，清蛋白質量為124800μg，β2-微球蛋白質量為4.76μg，與此相對，在3.8ml濾液中，清蛋白質量為1.141μg，β2-微球蛋白量為2.0μg，在維持β2-微球蛋白的量的同時，大幅度除去了清蛋白。通過該結果可知，清蛋白相對于總蛋白質濃度的組成比為0.02。另外，β2-微球蛋白的濃度相對于總蛋白質，在人血清中為0.0000243，與此相對，在濾液中為0.0343，增加為1414倍。
工業可利用性通過本發明的方法或調制裝置，可以獲得分析精度提高了的含有生物體成分的溶液，該溶液適合用作醫藥研究和臨床現場中的蛋白組學分析的樣品。
權利要求
1.一種清蛋白相對于總蛋白質的濃度組成比小于0.3的生物體成分的組成發生改變了的溶液的調制方法，其特征在于，將含有生物體成分的溶液，提供至至少β2-微球蛋白與清蛋白的透過比率為50或其以上的分離膜，使其透過分離膜。
2.如權利要求1所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述分離膜的透過比率為70或其以上。
3.如權利要求1所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述濃度組成比小于0.1。
4.如權利要求1所述的溶液的調制方法，其特征在于，生物體成分組成改變了的溶液的總蛋白質中的β2-微球蛋白的組成比率，相對于含生物體成分溶液的總蛋白質中的β2-微球蛋白的組成比率，為10倍或其以上。
5.如權利要求4所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述倍率為100倍或其以上。
6.如權利要求1所述的溶液的調制方法，其特征在于，分離膜的膜內的流路為非對稱結構。
7.如權利要求1所述的溶液的調制方法，其特征在于，生物體成分是血液、血漿、血清等血液來源物、尿、腹水、唾液、淚液、腦脊髓液、胸水或來自細胞的蛋白質提取溶液。
8.一種蛋白組學分析用溶液，是通過權利要求1～7的任一項所述的調制方法得到的。
9.一種生物體成分中含有的蛋白質的分析方法，其特征在于，在通過權利要求1～7任一項的方法來制備生物體成分組成改變了的溶液，然后對上述溶液中含有的蛋白質進行分析。
10.如權利要求9所述的蛋白質的分析方法，蛋白質的分析方法為選自質量分析、電泳分析和液相色譜中的至少1種。
11.一種調制生物體成分組成改變了的蛋白組學分析用溶液的裝置，是具有內置有β2-微球蛋白與清蛋白的透過比率為50或其以上的分離膜的組件的裝置，其特征在于，組件至少具有在分離膜的原液側的含生物體成分的溶液的原液入口和經由分離膜透過的透過液的出口。
12.一種用于調制生物體成分組成改變了的溶液的液流回路，其特征在于，具備以下結構組件，其內置分離膜，具有與上述分離膜的原液側流路連接的原液入口和原液出口以及分離膜的透過液的出口，溶液循環回路，其連接上述原液入口和上述原液出口、在中途具有泵和分離用目標液入口，稀釋液流入口，其設置于上述分離用目標液入口的上游的位置、或上述溶液循環回路中途的位置。
13.一種用于調制生物體成分組成改變了的溶液的裝置，其特征在于，含有至少2個上述液流回路，1個液流回路的分離目標液出口與另外1個液流回路的分離目標液入口通過液體流路直接或間接地相連。
14.一種生物體成分組成改變了的溶液的調制方法，是使用內置分離膜的組件使含有生物體成分的溶液流入分離膜原液側，并使原液側的液體通過設置于組件外的溶液循環回路進行循環，取出已透過分離膜的液體作為生物體成分組成改變了的溶液的工藝，其特征在于，在開始流入含有生物體成分的溶液后，使用于含生物體成分溶液的稀釋液追加流入到內置于組件中的分離膜的原液側。
15.如權利要求14所述的溶液的調制方法，其特征在于，在下述條件下進行分離，所述條件為流入到分離膜的原液側的含生物體成分的溶液的流量Q1與透過的液體的流量Q2滿足0＜Q2/Q1＜1。
16.如權利要求15所述的溶液的調制方法，Q2/Q1為0.005≤Q2/Q1≤0.5。
17.如權利要求14所述的溶液的調制方法，透過的液體的流量Q2與流入到分離膜的原液側的含生物體成分的溶液和稀釋液的流量之和Q3滿足0.5≤Q2/Q3≤1.5。
18.如權利要求17所述的溶液的調制方法，Q2/Q3約為1。
19.如權利要求14所述的溶液的調制方法，其特征在于，稀釋液使用生理鹽水或緩沖溶液。
20.如權利要求14所述的溶液的調制方法，其特征在于，生物體成分是血液、血漿、血清等血液來源物、尿、腹水、唾液、淚液、腦脊髓液、胸水或來自細胞的蛋白質提取溶液。
21.一種生物體成分組成改變了的溶液的調制方法，其特征在于，使用2個組件，使用利用第1組件用權利要求14所述的調制方法得到的溶液，進一步用第2組件進行權利要求14的調制方法。
22.一種由生物體成分來調制組成改變了的溶液的方法，是通過對含有生物體成分的溶液進行至少2個工序的處理，由含生物體成分溶液來調制生物體成分組成改變了的溶液的方法，其特征在于，連接使用至少2個工序，所述工序選自(1)吸附一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白質的工序，(2)通過分子篩來分級分子量大于等于清蛋白的蛋白質，并將一部分或全部除去的工序，及(3)濃縮蛋白質的工序。
23.如權利要求22所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述(1)工序中，使用含有下述原材料的材料，所述原材料選自纖維素、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中的1種或其以上。
24.如權利要求22所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述(2)工序中，使用含有下述原材料的分離膜，所述原材料選自纖維素、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚乙烯和聚丙烯中的1種或其以上。
25.如權利要求22所述的溶液的調制方法，其特征在于，上述(3)工序中，使用含有下述原材料的分離膜，所述原材料選自纖維素、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚1，1-二氟乙烯、聚丙烯腈、聚乙烯和聚丙烯中的1種或其以上。
26.如上述任一項所述的溶液的調制方法，將表面固定有下述物質的原材料用于工序(1)或工序(2)，所述物質為選自聚乙烯亞胺、氨基甲基吡啶、多酚、藍色色素、2價金屬離子和含烷基化合物中的1種或其以上。
27.如權利要求22所述的溶液的調制方法，其特征在于，將下述物質添加至工序(1)或工序(2)中的水溶液中，所述物質選自表面活性劑、乳化劑、有機溶劑、乙醇、乙二醇類、聚丙二醇、聚乙烯亞胺、氨基甲基吡啶、硫酸精蛋白、硫酸銨、多酚、藍色色素、離液鹽和含烷基化合物中的1種或其以上。
28.如權利要求22所述的溶液的調制方法，其特征在于，含生物體成分的溶液含有來源于人體成分的檢測物質。
29.一種由含有生物體成分的溶液來調制組成改變了的溶液的裝置，其特征在于，具有選自下述裝置中的至少2種裝置，上述選出的裝置之間通過流路來連接，所述裝置為(1)吸附一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白質的裝置、(2)通過分子篩來分級一部分或全部分子量大于等于清蛋白的蛋白質的裝置、及(3)濃縮蛋白質的裝置。
30.一種調制權利要求29所述的溶液的裝置，具有可與液相色譜、電泳裝置或質量分析裝置相連接的液流出路。
全文摘要
本發明的課題在于提供一種適用于使用質量分析、電泳、液相色譜等的臨床蛋白組學分析的含有生物體成分的溶液的調配方法及用于此目的的裝置。本發明通過提供下述方法實現了上述課題，即，一種調制溶液的方法，組合使用選自(1)吸附分子量大于等于清蛋白的蛋白質的工序、(2)對分子量大于等于清蛋白的蛋白質進行分級的工序、及(3)濃縮蛋白質的工序中的2個工序；一種調制溶液的方法，通過使用分子量小于1.5萬的蛋白質與分子量大于等于6萬的蛋白質的透過比率大于等于50的膜分離單元，來進行分離；一種調制溶液的方法，對分離膜組件，在流入生物體成分原液后、流入稀釋液，在使液體循環的同時，使一部分液體通過分離膜透過。
文檔編號C12M1/00GK1845935SQ20048002546
公開日2006年10月11日 申請日期2004年9月6日 優先權日2003年9月5日
發明者和田茂久, 內海潤, 藤田芳司, 菅谷博之, 山田智子 申請人:東麗株式會社