專利名稱：一種高效原核表達載體的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程中的原核表達系統。
基因工程的表達系統有原核表達系統和真核表達系統兩大類。外源基因在原核細胞中的表達是令克隆的外源基因在原核細胞中以發酵的方式快速、高效地合成外源基因表達產物。是目前了解最深入，實際應用最廣泛的表達系統。
在原核細胞中表達外源基因時，由于實驗設計的不同，總的來說可產生融合型和非融合型重組蛋白。當以非融合方式(即所得重組蛋白的氨基酸序列與目的產物一致)表達外源基因時，為了避免表達產物被細菌蛋白酶降解，表達產物通常以不溶的包涵體形式存在。包涵體的形成非常有利于純化，但因其中的表達產物不具有生物學活性，因而需要進行變復性處理。蛋白的復性是一個極其復雜的過程，不同蛋白的復性條件各異，復性率往往很難提高。這是限制其應用的主要制約因素。采用分泌表達方式可部分克服這一問題，但表達量卻偏低，實際應用也有較大難度。另外，當表達一些分子量較小、二硫鍵較多的蛋白時，非融合表達系統很難得到有生物學活性的蛋白。非融合表達的另一個不利因素就是表達量差異很大。用相同表達載體表達不同的外源蛋白時，表達量可能有10倍甚至100倍的差異。大量的研究表明，翻譯起始序列(TIR)二級結構或高級結構是影響基因表達的關鍵因素之一(Thanarai TA，PanditMW.Nucleic Acids Res，1989；17(8)2973)。一些外源基因只有通過優化TIR的二級結構才能達到高效表達(Calvez HL et al.Gene，1996；17051)。這無疑加大了實驗的難度和工作量。為了克服這些困難，融合蛋白表達系統應運而生。即利用一些特定的融合伴體使之與外源蛋白融合，在原核細胞中表達融合蛋白。這些融合伴體包括GST，lacZ，trpE，DsBA等(Smith etal，Gene，1988，6731-40)。融合表達系統都采用了優化的TIR，在表達量方面高效穩定。由于采用的融合伴體多為來自細菌的分子伴侶，既可以保護外源蛋白免受細菌蛋白酶的降解，又能協助外源蛋白的正確折疊。因此，表達的融合蛋白的溶解性好，外源蛋白的構象更接近于天然蛋白，對于保證其生物學活性具有極為重要的作用，非常適合于基因的功能研究和重組蛋白的大量生產。當然，如想獲得外源蛋白單體，就必須將融合伴體切除。切除融合伴體可采用酶解和化學裂解法。酶解可供選擇的酶有凝血酶，蛋白酶3C，胰蛋白酶，Xa因子等；化學裂解常采用溴化氰裂解。
融合表達系統優勢明顯，但也有亟待完善的地方。如在純化方面，需要有針對融合蛋白的簡易高效的純化措施；在融合伴體的選擇方面，需要有能更好地協助目的蛋白折疊的分子伴侶；在切割融合伴體的方法上，需要有更高效、切割條件溫和、低成本的切割試劑。
本發明的目的是設計構建出一種新型高效融合表達載體，用于高效表達外源基因。使表達的融合蛋白能以簡易的方法純化之。
本發明采用大腸桿菌的硫氧還蛋白(Thioredoxin，TRX)作為融合伴體。TRX基因是通過PCR的方法，從大腸桿菌K12中擴增而得。TRX是大腸桿菌的一種分子伴侶，在細胞內能協助蛋白的正確折疊。大腸桿菌TRX分子量約為12kD，其構象嚴緊，熱穩定性好，甚至可耐受80℃的高溫。當TRX在胞內被過量表達時，其含量可占細菌總蛋白的40％而不被細菌蛋白酶降解。1993年美國Genetics Insitute公司的Mc Coy等人發現多種細胞因子如人白介素3、人白介素11、鼠白介素4、鼠白介素5、鼠白血病抑制因子等與大腸桿菌TRX基因融合后在大腸桿菌細胞內能實現可溶性表達，所表達的融合蛋白占細胞可溶蛋白的10～20％(La Vallie et a，1993)。進一步的研究表明，當TRX和上述細胞因子以獨立的形式在大腸桿菌內共表達，細胞因子為不可溶性，這表明TRX是以分子內伴侶的形式協助目的蛋白折疊。TRX的這些特性非常適合于作為外源蛋白的融合伴體。所述的啟動子可以是T7啟動子，它是載體的一個結構元件，也可用其它強啟動子如Tac，Lac等代替。
本發明在TRX融合伴體的羧基端設計了一連接區。連接區包括柔韌區、純化位點、酶切位點和多克隆位點。設置柔韌區的目的是為了在融合伴體和外源蛋白之間提供一個過渡，減少二者在空間結構上的相互干擾以及可能出現的一些剛性結構。通過計算機模擬，最終選擇了GSGSG序列作為連接區。選擇此連接區一方面是因為GSGSG的柔韌性好，另一方面是因為G、S(甘氨酸、絲氨酸)分子量小，空間位阻小，有利于腸激酶對融合蛋白的切割。
本發明在連接區中設計了6組氨酸的純化位點。組氨酸能提供配位電子和一些金屬離子如Ni2+螯合位點。6個連續的組氨酸可以使蛋白吸附于含金屬Ni2+的層析填料上，因而可以利用金屬螯和層析來純化融合蛋白，從而簡化了蛋白純化工作。
本發明在6組氨酸位點之后還設計了腸激酶的切割位點。融合蛋白表達體系必須面對的一個問題是如何有效切除伴體蛋白而獲得目的蛋白單體。腸激酶是一種絲氨酸蛋白酶，它能特異性識別肽鏈中N-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C五個氨基酸殘基，切割點在Lys的羧基端。相對于其它切割酶，腸激酶具有識別特異性更強、切割效率更高、反應條件溫和等優點。由于腸激酶的切割位點在識別位點的羧基末端，因而切割下來的外源蛋白在氨基端無額外的氨基酸，從而使其氨基酸序列與天然蛋白完全一致。美國FDA在1997年批準上市的人白介素11就是利用腸激酶切割融合蛋白而獲得的單體。
綜上所述，本發明構建的融合蛋白載體pTRX可應用于重組蛋白的大規模生產。例如，本實驗室應用pTRX構建的pTRX-IL10表達載體，表達的融合蛋白95％以上可溶，約占細菌總可溶蛋白的40％，而國內外IL-10的原核表達均未達到這一水平。
本發明的融合蛋白載體pTRX還可用于基因功能的研究，例如，本實驗室應用pTRX構建的pTRX-PLA2(海蛇磷脂酶A2)表達載體和pTRX-NEU(海蛇短神經毒素)表達載體，表達的融合蛋白TRX/PLA2即具有海蛇磷脂酶A2的生物學活性，融合蛋白TRX/NEU即具有海蛇神經毒素的生物學活性。而國內外報道原核表達的海蛇磷脂酶A2和海蛇神經毒素大多無生物學活性或活性很低。究其原因，關鍵在于所表達的重組蛋白能否正確折疊。
本發明的載體的復制方法參照Sambrook(Sambrook，etal.1989.Molecular cloning.Cold spring Harbor Laboratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.coli DH5α或E.coli JM101菌株中轉化質粒，用含氨芐青霉素(50ug/mL)的LB培養基培養經轉化的細菌，堿法提取質粒。
附圖簡要說明


圖1是本發明的載體從啟動子至多克隆位點的序列.
圖2是TRX基因的PCR擴增產物示意圖，其中1，3是以大腸桿菌K-12基因組為模板所得的PCR產物，2是Gibico公司的100bp Marker，4是陰性對照。
圖3是轉移載體pBSK-TRX構建示意圖。
圖4是轉移載體pBSK-LINKER的構建示意圖。
圖5是融合表達載體pTRX的構建示意圖。
圖6是母載體pET22b的物理圖譜。
圖7是融合表達載體pTRX的酶切鑒定示意圖，其中1為NEB公司的100bp Marker，4為Gibico公司的1kb Marker，2為pTRX/NdeI+NotI，3為pET22b/NdeI+NotI。
圖8是利用pTRX表達TRX/IL10融合蛋白及純化的SDS-PAGE示意圖，其中1為含空載體pET22b宿主的可溶蛋白對照，2為含pTRX-IL10宿主誘導表達后的可溶性蛋白，3、4、5為用Ni2+Chelating Sepharose親和層析柱洗脫的雜蛋白，6為用Ni2+Chelating Sepharose親和層析柱洗脫的TRX/IL10融合蛋白，7為蛋白Marker。
圖9是利用pTRX表達TRX/PLA2融合蛋白及純化的SDS-PAGE示意圖，其中1為蛋白Marker，2為含空載體pET22b宿主的可溶蛋白對照，3為含pTRX-PLA2宿主誘導表達后的可溶性蛋白，4為用Ni2+Chelating Sepharose親和層析柱洗脫的TRX/PLA2融合蛋白，5為進一步純化的TRX/PLA2融合蛋白，6為用腸激酶切割TRX/PLA2融合蛋白。
圖10是利用pTRX表達TRX/NEU融合蛋白及純化的SDS-PAGE示意圖，其中其中1為含空載體pET22b宿主的可溶蛋白對照，2為含pTRX-NEU宿主誘導表達后的總蛋白，3為為含pTRX-NEU宿主誘導表達后的可溶蛋白、4為用Ni2+Chelating Sepharose親和層析柱洗脫的TRX/NEU融合蛋白，5為進一步純化的TRX/PLA2融合蛋白，7為蛋白Marker。
實施例一融合表達載體pTRX的構建1.TRX基因的PCR擴增大腸桿菌的TRX基因已在GeneBank中公布，因此我們利用PCR方法，以大腸桿菌K12基因組為模板擴增TRX基因。根據計算機軟件對TRX基因的分析，設計并合成了一對引物上游引物為5′-AAAgaattcatatgAGCGATAAAATTATTCACCTGAC-3′，下游引物為5′-AAAaagcttGGCCAGGTTAGCGTCGAGGA-3′。為方便克隆，分別在上下游引物中加入EcoRI、HindIII酶切識別序列。PCR反應參照Sambrook(Sambrook，et al.1989.Molecular cloning.Cold spring Harbor LaboratoryPress.USA)方法進行。
2.含TRX基因的轉移載體pBSK-TRX的構建PCR擴增的TRX基因經瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，再經EcoRI和HindIII雙切后插入到轉移載體質粒pBSK的EcoRI和HindIII酶切窗口，構建成轉移載體pBSK-TRX，質粒構建過程詳間圖2。
3.含連接區的轉移載體pBSK-LINKER的構建首先，根據Linker區的序列合成互補的兩條寡聚核甘酸片段LA5′-AAAAGCTTGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCATCATGGTACCGACGACGACGACAAAGAA-3′LB5′-AAAGCGGCCGCAAGCTTGGATCCAGAGATATCCTCGAGACCGAATTCTTTGTCGTCGTCGTCGGTA-3′寡聚核甘酸片段LA、LB經變性、退火、延伸得雙鏈Linker序列，再以HindIII和NotI雙切插入到轉移載體質粒pBSK的NotI和HindIII酶切窗口，構建成轉移載體pBSK-LINKER，質粒構建過程詳間圖4。
4.融合表達載體pTRX的構建以NdeI和HindIII從轉移載體pBSK-TRX切下TRX序列，以HindIII和NotI從轉移載體pBSK-LINKER切下Linker序列，二者同時插入到pET22b的NdeI和NotI酶切窗口，構建成融合表達載體pTRX，質粒構建過程詳間圖5。
實施例二融合表達載體pTRX的應用將人IL-10、海蛇短神經毒素(NEU)、海蛇磷脂酶A2(PLA2)基因分別插入到pTRX載體的KpnI和NotI酶切窗口，構建成表達載體pTRX-IL10、pTRX-NEU、pTRX-PLA2。將pTRX-IL10、pTRX-NEU、pTRX-PLA2分別轉化到大腸桿菌BL21(DE3)。接單菌落于50ml氨卞抗性LB培養基中，37℃，250rpm培養過夜，取過夜培養物20ml接種于2L的氨卞抗性LB培養基中，37℃，250rpm培養至OD600＝0.6，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為1mM和0.2％，26℃，250rpm誘導培養10h后離心收獲菌體，超聲破碎菌體，離心收集上清，用Ni2+Chelating Sepharose親和層析純化。pTRX-IL10融合蛋白的表達純化見圖8、pTRX-PLA2融合蛋白的表達純化見圖9、pTRX-NEU融合蛋白的表達純化見
圖10。
利用凝膠薄層掃描儀對SDS-PAGE膠結果進行分析，pTRX-IL10的表達量占細菌總蛋白的40％以上，pTIX-NEU的表達量占細菌總蛋白的25％、pTRX-PLA2的表達量占細菌總蛋白的20％以上，這些融合蛋白90％以上為可溶。
權利要求
1.一種融合表達載體，它含有一種特定的核苷酸片斷，該核苷酸片斷由啟動子、編碼TRX伴體蛋白的基因、連接區串聯構成，其中所述的連接區含有編碼絲氨酸和/或甘氨酸的柔韌區，6組氨酸位點、腸激酶切割位點和多克隆位點。
2.按照權利要求1所述的表達載體，其中，所述的啟動子為T7啟動子。
3.按照權利要求1所述的表達載體，其中，所述的柔韌區是編碼GSGSG氨基酸殘基的序列。
4.按照權利要求1所述的表達載體，其中，所述的特定的核苷酸片斷的序列為T7 啟動子 CATATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGTCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCAAGCTTGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCATCATCATGGTACCGACGACGACGACAAAGAATTCGGTCTCGAGGATATCTCTGGATCCAAGCTTGCGGCCGC
5.按照權利要求1所述的表達載體，它還含有安芐青霉素抗性基因、質粒在大腸桿菌中的復制元件。
6.按照權利要求1所述的表達載體，它是質粒pTRX。
全文摘要
本發明利用大腸桿菌分子伴侶Thioredoxin(TRX,硫氧還蛋白)作為融合伴體,構建了一種高效原核融合表達載體。它含有T7強啟動子、TRX伴體蛋白、連接區(包括柔韌區、6組氨酸純化位點、腸激酶切割位點和多克隆位點)。該載體能以融合蛋白的形式高效表達外源基因,表達產物溶解性好,純化簡易,且多具有外源蛋白的天然生物活性。故此表達載體不僅適用于重組蛋白的大量生產,而且也適用于對基因功能與構象關系的研究。
文檔編號C12N15/62GK1343789SQ0012483
公開日2002年4月10日 申請日期2000年9月18日 優先權日2000年9月18日
發明者徐安龍, 彭立勝, 鐘肖芬, 吳文言, 衛劍文 申請人:中山大學