專利名稱：CoQ10的微生物生產方法
技術領域：
本發明涉及輔酶Q-10的合成中涉及到的酶，涉及編碼所述酶的經過分離的DNA，還涉及對輔酶Q-10進行微生物生產的方法。
輔酶Q-10被發現于微生物、植物和動物中。已有確定并日益增加的證據表明，輔酶Q-10是關于人類健康和疾病的重要因子。可以通過化學合成或通過使用微生物發酵來對其進行生產。
癸異戊二烯基二磷酸酯(decaprenyl diphosphate，DPP)合酶和4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶(4-hydroxybenzoate polyprenyltransferase)能催化輔酶Q-10(2，3-二甲氧基-二甲基-6-癸異戊二烯基-1，4-苯醌，也稱作泛醌-10)生物合成中的步驟。DPP合酶通過連續的七步將異戊二烯二磷酸酯(IPP)分子加到異戊二烯類中間產物法呢基二磷酸酯(farnesyldiphosphate，FPP)上的步驟來形成DPP。DPP再與4-羥基苯甲酸酯結合；在大多數細菌中(如果不是全部細菌的話)，4-羥基苯甲酸酯來自分支酸(chorismate)。由4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶催化的這種異戊二烯化反應，產生了3-癸異戊二烯基-4-羥基苯甲酸酯(3DP4HP)。3DP4HP的芳環再被進一步的修飾，形成還原型泛醌(ubiquinol)，其是泛醌的還原形式。
異戊二烯類中間產物IPP是通過多步催化途徑從乙酰-CoA開始合成的。由phaA編碼的乙酰-CoA乙酰基轉移酶，催化了兩個乙酰-CoA分子的縮合，形成乙酰乙酰-CoA(acetoacetyl-CoA)，這是IPP合成的第一步。乙酰乙酰-CoA還作為phaB基因產物的底物發揮作用，phaB基因產物是乙酰乙酰-CoA還原酶，其催化聚羥基烷酯(PHA)生物合成的第一個關鍵步驟。在很多細菌中，PHA生物合成中涉及的基因組合成操縱子。在Paracoccus denitrificans中，分別編碼乙酰-CoA乙酰基轉移酶和乙酰乙酰-CoA還原酶的phaA和phaB基因被串在一個操縱子上，而編碼該途徑最后一個酶(PHA合酶)的phaC基因，則不是該操縱子的一部分。
本發明涉及經過分離的DNA，其包含(1)編碼癸異戊二烯基二磷酸酯(DPP)合酶的核苷酸序列和(2)編碼4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的核苷酸序列，其中，編碼DPP合酶的核苷酸序列選自由以下序列構成的組(a)SEQ ID NO16所示的DNA序列或其互補鏈；(b)一種DNA序列，其在標準條件下能與(a)中定義的DNA序列或其片段雜交，并編碼具有DPP合酶活性的多肽；(c)一種DNA序列，其與編碼SEQ ID NO17所示的多肽的DNA至少80％，優選至少90％相同，并且其編碼具有DPP合酶活性的多肽；和(d)一種DNA序列，其編碼與SEQ ID NO17所示的氨基酸序列至少80％相同的多肽，并編碼具有DPP合酶活性的多肽；并且其中，編碼4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的核苷酸序列選自由以下序列構成的組(a’)SEQ ID NO23所示的DNA序列或其互補鏈；(b’)一種DNA序列，其在標準條件下能與(a’)中定義的DNA序列或其片段雜交，并編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽；(c’)一種DNA序列，其與編碼SEQ ID NO24所示的多肽的DNA至少80％，優選至少90％相同，并且其編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽；和(d’)一種DNA序列，其編碼與SEQ ID NO24所示的氨基酸序列至少80％相同的多肽，并編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽。
本文中使用的“標準條件”下的雜交指在例如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d Edition，1989，和Shor Protocolsin Molecular Biology，ed.Ausubel，et al.中所述的嚴謹條件下的雜交，這兩份出版物都通過引用的方式被包括進本文中。嚴謹條件是取決于序列的，在不同環境下有所不同。較長的序列在較高的溫度下特異性雜交。通常，嚴謹條件被選擇為較之對于特定序列在設定的離子強度和pH下的熱熔解溫度(thermal melting point，Tm)要低大約5-10℃的溫度。Tm是(在設定的離子強度、pH和核酸含量的情況下，)達到平衡時，與目標序列互補的序列中的50％與目標序列雜交的溫度(目標序列過量存在時，Tm處，達到平衡時50％的探針處于被利用的狀態)。嚴謹條件是以下這樣的鹽濃度低于大約1.0M鈉離子，典型地是大約0.01至1.0M的鈉離子濃度(或其它鹽)，pH7.0至8.3，對于短的雜交探針(例如，10至50個核苷酸)溫度為至少大約30℃，對于長的雜交探針(例如，多于50個核苷酸)溫度為至少大約60℃。嚴謹條件還可以通過加入去穩定劑例如甲酰胺來獲得。就本發明公開的目的而言，用于此類雜交的合適的嚴謹條件是包括下述條件的，所述條件是于37℃在40％甲酰胺、1M NaCl、1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的緩沖液中進行雜交，在至少大約50℃的溫度(通常是約55℃至約60℃)下于0.2XSSC中至少進行一次20分鐘的洗滌；或者是等同的條件。陽性雜交至少是背景的兩倍。普通技術人員將很容易知道，其它替代的雜交和洗滌條件可被用于提供相似嚴謹度的條件。
本文中所用的術語“片段”指長度為大約10個或更多個核苷酸的核酸序列。
在本文中，如果按照下文所述以最大的對應情況進行比對時，兩條序列的核苷酸序列或氨基酸(分別適用的情況下)殘基相同，那么兩條核酸序列或多肽就被稱為是“相同的”。上下文中提到兩條或多條核酸或多肽序列時，術語“相同的”或百分比的“相同性”，指當使用本領域已知的序列比較算法或通過手工比對及視覺檢查來進行測量，在比較窗口上按照最大的對應情況來進行比較和比對時，相同的或具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸的兩條或多條序列或亞序列(subsequence)。當序列相同性的百分比被用于蛋白質或肽，應認識到不相同的殘基位置通常是由于保守氨基酸取代造成的，其中氨基酸殘基被具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基所取代，因此不改變分子的功能屬性。當序列因為保守取代而不同時，百分比的序列相同性可被調高，以針對取代的保守本質進行校正。做出此種調節的方法是本領域技術人員公知的。典型地，這包括對保守取代進行評分，將其作為部分而非全部的錯配，因此提高百分比的序列相同性。因此，例如，當相同的氨基酸被給為1的分值，非保守取代被給為0的分值時，對保守取代給出0和1之間的分值。根據，例如Meyers & Miller，Computer Applic.Biol.Sci.411-17(1988)的算法，例如PC/GENE程序(Intelligenetics，Mountain View，Calif.，USA)所實現的，來計算對保守取代的賦分。在相同序列中間可能會有不相同核苷酸或氨基酸殘基的缺口。如果核苷酸或氨基酸序列的不同導致了多結構域的酶的一個結構域的生物活性的降低或改變，而該酶的另一結構域的另一生物活性被保留下來，這樣的核苷酸或氨基酸序列仍然是被包括在本發明范圍之內的。通常，如果一種多肽與SEQ ID NO17或SEQ IDNO24的DPP合酶或4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的天然存在的氨基酸序列至少80％相同，這種多肽就被認為是在本發明的范圍之內。如果一條核酸序列與SEQ ID NO16或SEQ ID NO23的編碼DPP合酶或4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的天然存在的核酸序列至少80％，優選至少90％相同，那么，這條核酸序列就被認為是在本發明的范圍之內。
此外，本發明涉及下述多肽(1)具有氨基酸序列SEQ ID NO17，或較之SEQ ID NO17有一個或幾個氨基酸缺失、添加或插入的氨基酸序列，并具有DPP合酶活性的多肽，和(2)具有氨基酸序列SEQ IDNO24，或較之SEQ ID NO24有一個或幾個氨基酸缺失、添加或插入的氨基酸序列，并具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽。
本文中所用的術語“一個或幾個氨基酸缺失、添加或插入”表示，各條多肽序列被一個或多個缺失、添加或插入所突變。在本申請的上下文中，術語“幾個”指2或更多個。
本發明進一步地提供了包含本發明的新穎的核苷酸序列的構建體，還可以包含調控序列。
本文中所用的“構建體”是具有插入的或添加的額外DNA的DNA片斷或序列，例如攜帶有DNA插入的表達載體或質粒。此類“額外DNA”是指并非在該位置天然存在的DNA，其通過本領域已知的克隆方法被插入或被添加。還包括在內的是通過本領域技術人員已知的標準DNA轉化、轉導或接合方法被插入到微生物基因組中的DNA序列。因此，在本發明上下文中所用的構建體包括本文公開的通過本領域已知的方法插入到質粒或表達載體或插入到微生物基因組中的DNA序列。合適的質粒或表達載體是本領域技術人員已知的。
術語“調控序列”包括控制或調節編碼DNA轉錄的序列。此類序列可與編碼DNA相鄰或可定位于編碼DNA的上游或下游。調控序列包括但不限于啟動子、轉錄調節子、核糖體結合位點、終止子、mRNA穩定序列以及翻譯或轉錄增強子元件。
在本發明的一種實施方式中，提供了包含上述特定DNA的微生物。因此，本發明提供了包含上述構建體的微生物。微生物優選是細菌或酵母，更優選是輔酶Q-10的天然生產者的細菌或酵母，例如Gluconobactersp.、Sphingomonas trueperi、Schizosaccharomyces pombe、Candida sp.、Pseudomonas sp.或Paracoccus denitrificans。最優選的是Paracoccuszeaxanthinifaciens或Rhodobacter sphaeroides的細菌。
本發明提供了在微生物中生產輔酶Q-10的方法，所述方法包括如下步驟(a)增加編碼具有DPP合酶的蛋白質的基因和/或編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的蛋白質的基因的表達，以增加所述蛋白質的活性，以及(b)在能生產輔酶Q-10的條件下，在培養基中培養微生物或宿主細胞。編碼DPP合酶的基因已知為ddsA，編碼4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的基因已知為ubiA。在一個方面，該方法還包括通過對所述微生物的crtE基因進行突變，去掉香葉基香葉基二磷酸酯(geranyl geranyldiphosphate，GGPP)合酶的活性。
本發明的酶的活性可被下述方法增加，所述方法包括但不限于增加基因的拷貝數，使用更強的啟動子，對mRNA進行穩定，增強翻譯，使用較之野生型具有增加的活性和/或增加的穩定性和/或對抑制的抗性和/或對底物或產物抑制的抗性的酶的突變形式，或者本領域技術人員已知的任何其它方法。
用于生產輔酶Q-10的培養基和條件是技術人員已知的，在實施例1的培養基和條件部分中對此有詳細描述。
術語“突變”或“對……進行突變”在本文中可與“修飾”互換使用，表示對天然核苷酸序列進行的導致蛋白質氨基酸序列的相應變化的改變。此種改變可導致例如蛋白質功能或活性上的改變。突變可通過若干方法來產生，所述方法包括一個或多個移碼、取代、插入和/或缺失，包括無義突變[琥珀型(T/UAG)、赭石型(T/UAA)和乳白型(T/UGA)]。缺失可以是單個核苷酸或多個核苷酸的缺失，也包括整個基因的缺失。用于制造此類突變的方法包括但不限于使用NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)或EMS(乙基磺酸甲烷)以及亞硝酸進行化學誘變，UV(紫外)照射，以及使用生物試劑例如轉座子、插入元件或控制細胞突變速率的特定基因(例如，mutS和mutT)進行的誘變。突變可通過DNA重組方法來產生，其中使用了DNA片段的制劑，其中含有通過PCR制造出來的突變，通過本領域技術人員已知的標準的DNA轉化、轉導或接合方法，將此類含有突變的DNA片段引入到染色體中(天然的座或次級染色體位點)。
本發明的一種特定的實施方式提供了經過分離的DNA，其選自包含編碼癸異戊二烯基二磷酸酯(DPP)合酶的核苷酸序列的DNA，其選自如下序列構成的組(a)SEQ ID NO16所示的DNA序列或其互補鏈；(b)一種DNA序列，其在標準條件下能與互補于(a)中定義的DNA序列的DNA序列或其片段雜交，并編碼具有癸異戊二烯基二磷酸酯(DPP)合酶活性的多肽；(c)一種DNA序列，其編碼具有由(a)或(b)的DNA序列編碼的氨基酸序列的多肽；(d)一種DNA序列，其與編碼包含SEQ ID NO17的氨基酸序列的多肽的DNA至少80％相同，并且其編碼具有癸異戊二烯基二磷酸酯(DPP)合酶活性的多肽；和(e)一種DNA序列，其編碼包含與SEQ ID NO17的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的多肽，并編碼具有癸異戊二烯基二磷酸酯(DPP)合酶活性的多肽；以及包含編碼4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的核苷酸序列的DNA，選自由如下序列構成的組(a’)SEQ ID NO23所示的DNA序列或其互補鏈；(b’)一種DNA序列，其在標準條件下能與互補于(a’)中定義的DNA序列的DNA序列或其片段雜交，并編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽；(c’)一種DNA序列，其編碼具有由(a’)或(b’)的DNA序列編碼的氨基酸序列的多肽；(d’)一種DNA序列，其與編碼包含SEQ ID NO24的氨基酸序列的多肽的DNA至少80％相同，并且其編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽；和(e’)一種DNA序列，其編碼包含與SEQ ID NO24的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的多肽，并編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽。
在另一種實施方式中，本發明包括在微生物中生產輔酶Q-10的方法，所述方法包括提高選自ddsA和ubiA的基因的表達，以增加選自DDP合酶和4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的酶的活性，以及在能生產輔酶Q-10的條件下，于培養基中培養細胞。
下述實施例被提供來對本發明進行進一步的闡述。這些實施例僅作闡述之用，而非欲以任何方式對本發明的范圍進行限制。
實施例1 細菌菌株、微生物方法和分析工序在細菌中，包括Paracoccus zeaxanthinifaciens中，對來自異戊二烯類中間產物FPP和IPP的玉米黃質的合成涉及五個酶反應步驟。首先，通過crtE編碼的GGPP合酶形成香葉基香葉基二磷酸酯(GGPP)，然后在crtB編碼的八氫番茄紅素(phytoene)合酶的催化下，兩個GGPP分子結合形成八氫番茄紅素。下一個酶，crtI編碼的番茄紅素合酶通過開展四個去飽和步驟，將八氫番茄紅素轉化為番茄紅素。由crtY編碼的番茄紅素環化酶將番茄紅素轉化為β-胡蘿卜素，其再被由crtZ編碼的β-胡蘿卜素羥化酶羥化，得到玉米黃質。番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃質是紅色或橙色的，而其它中間產物是無色的。
P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588可從American Type CultureCollection(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas VA 20110-2201，USA獲得，其是生產玉米黃質的野生型海洋(marine)細菌(US3,891,504)。菌株R1534和R114是經過改進的玉米黃質生產突變體，它們是通過經典誘變和篩選工序從ATCC 21588獲得的。根據《布達佩斯條約》，菌株R1534和R114之前已被保藏于ATCC，其ATCC菌株編號分別被指定為PTA-3336和PTA-3335。對菌株R1534intE、UV9-4和EMS9-7的構建在實施例2有詳細描述。
培養基和條件E.coli菌株于37℃在LB培養基(Becton Dickinson，Sparks，MD，USA)中生長。為保持重組菌株中的質粒，向培養基中加入氨芐青霉素(100μg/ml)和/或卡那霉素(25-50μg/ml，取決于實驗)。對于固體培養基，加入瓊脂(1.5％的最終濃度)。液體培養物在旋轉式搖床上于200rpm下生長。
P.zeaxanthinifaciens菌株在28℃生長。用于P.zeaxanthinifaciens的培養基的組分在下文中描述(用于每項實驗的具體培養基會在后面的實施例部分特別指出)。除非另有指明，生長于瓶中的P.zeaxanthinifaciens的所有液體培養物在旋轉式搖床上于200rpm下被振蕩。對于固體培養基，加入瓊脂(1.5％的最終濃度)。通過高壓對培養基滅菌時，在滅菌之后加入葡萄糖(作為濃縮的貯藏溶液)，以獲得理想的最終濃度。
F-培養基含有(每升蒸餾水)胰蛋白胨，10g；酵母提取物，10g；NaCl，30g；D-葡萄糖·H2O，10g；MgSO4·7H2O，5g。在通過過濾或高壓滅菌之前，將pH調為7.0。
培養基362F/2含有(每升蒸餾水)D-葡萄糖·H2O，33g；酵母提取物，10g；胰蛋白胨，10g；NaCl，5g；MgSO4·7H2O，2.5g。在通過過濾或高壓滅菌之前，將pH調為7.4。滅菌后，微量元素溶液、NKP溶液和CaFe溶液各加入2.5ml。后三種溶液通過過濾被滅菌。微量元素溶液含有(每升蒸餾水)(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，80g；ZnSO4·7H2O，6g；MnSO4·H2O，2g；NiSO4·6H2O，0.2g；EDTA，6g。NKP溶液含有(每升蒸餾水)K2HPO4，250g；(NH4)2PO4，300g。CaFe溶液含有(每升蒸餾水)CaCl2·2H2O，75g；FeCl3·6H2O，5g；濃HCl，3.75ml。
對P.zeaxanthinifaciens的分批培養從冷凍的細胞懸浮液(于-80℃貯藏于15-20％的甘油貯液中)來初始化全部培養物。在含有200ml 362F/2培養基的2升帶檔板搖瓶中，制備雙份的用于分批發酵的預培養物。對每只瓶子而言，用一毫升解凍的細胞懸浮物作為接種體。預培養物的初始pH為7.2。在28℃，250rpm的振蕩下，將預培養物培養28小時，之后660nm處的光密度(OD660)在14和22個吸收單位之間，這取決于所使用的菌株。主培養物生長于Biostat ED生物反應器(B.Braun Biotech International，Melsungen Germany)中，其中含有具有如下組分的培養基(每升蒸餾水)D-葡萄糖·H2O，25g；酵母提取物(Tastone 900)，17g；NaCl，4.0g；MgSO4·7H2O，6.25g；(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，0.5g；ZnSO4·7H2O，0.038g；MnSO4·H2O，0.013g；NiSO4·5H2O，0.001g；CaCl2·2H2O，0.47g；FeCl3·6H2O，0.062g；煙酸，0.01g；NH4Cl，0.5g；消泡劑，0.1ml；KP溶液，3.5ml。KP溶液的組分是(每升蒸餾水)K2HPO4，250g；NaH2PO4·2H2O，200g；(NH4)2HPO4，100g。對于帶有質粒的菌株，向培養基中加入卡那霉素(50mg/l終濃度)。所有方法中使用的補料溶液都具有如下組分(每升蒸餾水)D-葡萄糖·H2O，550g；KP溶液，18.25ml。生物反應器中的初始體積(接種之后)為8L。按照需要用滅菌水對預培養物進行稀釋，使得加入50ml到生物反應器中，可獲得0.5的初始OD660值。發酵條件被自動控制如下28℃，pH7.2(加入28％的NH4OH來控制pH)，溶解氧控制為最小為40％的相對值(有葉片攪拌的情況下)，最低攪拌為300rpm，通氣速率為1v.v.m.(相對最終體積)。在上述條件不添加補料溶液的情況下，培養進行大約20小時(批次)。這段時間后，攪拌速率降低，基礎消耗急劇降低和CO2產量降低是初始葡萄糖被耗盡的指示，補料開始進行。標準的補料曲線是如下定義的(從補料起始點開始)17小時內，從50g/h斜線上升至80g/h，在80g/h持續7小時，然后在11個小時內斜線下降至55g/h，發酵的剩余階段都保持在55g/h上。主培養物的最終體積為大約10升。
分析輔酶Q-10的方法樣品制備和提取。將20ml培養物轉移到一次性的50ml聚丙烯離心管中，在4000rpm離心20分鐘。將上清液移棄。將沉淀重新懸浮于10ml的丙酮中，對樣品進行20秒的超聲波處理(sonified)。將管子蓋上，用IKA Vibrax搖晃器(shaker)對樣品進行20分鐘的混合。然后在室溫對樣品進行離心，4000rpm下10分鐘，將上清液轉移至干凈的50ml聚丙烯離心管中。將10ml丙酮和10ml叔丁基甲醚(TMBE)加入到沉淀中，進行第二次提取。重復用于第一次提取的超聲波處理、混合和離心步驟。來自該第二次提取的上清液被移出，并與第一次提取的上清液組合。像組合后的提取物中加入五毫升乙醇，以幫助除去水。對樣品進行混合之后，用SpeedVac蒸發器(環境溫度)除去溶劑。將殘余物再次溶解于1ml TMBE加1ml乙醇中。在超聲波浴中對樣品進行5分鐘的超聲波處理，以協助溶解。最后，對樣品進行離心，將上清液轉移到褐色玻璃瓶中，用于高效液相色譜(HPLC)分析。
HPLC。反相HPLC方法被發展出來，用于對泛醌及其相應的對苯二酚的同時測定。該方法可以清楚地將類胡蘿卜素八氫番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質和玉米黃質與輔酶Q-10分開。用裝備有溫控自動進樣器和二極管陣列檢測器的Agilent 1100 HPLC系統色譜來進行色譜分析。方法參數如下
柱YMC Carotenoid C30柱；5微米，鋼，250mm×4.6mm I.D.(YMC，Part No.CT99S052546WT)保護柱Pelliguard LC-18 cartridge，20mm(SUPELCO，PartNo.59654)流動相乙腈∶甲醇∶TBME(比例58％∶10％∶32％)的混合物，等度洗脫(isocratic elution)進行時間25分鐘典型柱壓起始為48bar流速1.0ml/分鐘檢測UV，在280nm處注射體積20μl柱溫度15℃試劑。乙腈和TBME是HPLC級別的，從Fluka獲得。乙醇(p.a.)和甲醇(Lichrosolv)是從Merck，Darmstadt購買的。丙酮(Puriss.，p.a.)和輔酶Q-10是從Fluka購買的。
計算。在用外部標準來進行兩級校正的情況下，進行定量分析。基于峰的面積進行計算。
選擇性。通過注射相關參考化合物的標準溶液來檢驗本發明的選擇性。目標化合物(輔酶Q-10和還原型泛醌-10)被完全分開，沒有顯示任何干擾。被選出的化合物的保留時間為全反式玉米黃質，8.0分鐘；15Z-八氫番茄紅素，10.4分鐘；輔酶Q-9，11.0分鐘；β-隱黃質，12.3分鐘；還原型泛醌-10，13.8分鐘；輔酶Q-10，14.8分鐘；β-胡蘿卜素，19.0分鐘。
線性。制備輔酶Q-10在TBME/乙醇(1∶1)中的一系列稀釋溶液(最終濃度為300、100、30和3μg/ml)，用上述HPLC方法進行分析。線性范圍被發現為從3μg/ml至300μg/ml。相關系數為0.9999。
檢測極限。通過HPLC對輔酶Q-10進行檢測的低限被測定為1μg/ml。
實施例2 構建P.zeaxanthinifaciens的crtE突變體在P.zeaxanthinifaciens菌株R1534中對crtE基因進行插入失活。Pasamontes et al.[Gene 18537-41(1997)]報道了對來自P.zeaxanthinifaciens菌株R1534的crtE基因進行的克隆和測序。使用質粒pRSF1010-Ampr-crt2(US6,291,204)作為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)來制造在其5’和3’末端具有PstI限制性酶識別位點的crtE特異性DNA片段。所用的正向和反向引物具有分別如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列。PCR反應條件是94℃，1分鐘(一個循環)；94℃，1分鐘接著是72℃，1.5分鐘(30個循環)；72℃，7分鐘(一個循環)。用PstI去消化通過PCR反應制造出來的460個堿基對(bp)的DNA片段，并用QIAquick柱(Qiagen，Hilden，德國)從瓊脂糖膠對其進行純化。經過分離的片段被連接到之前已用PstI進行過消化的“自殺型”質粒載體pSUP202[Simon et al.，Bio/Technology 1784-791(1983)]上。使用標準工序，用經連接的混合物去轉化E.coli S-17細胞。對轉化子的篩選驗證了對期待的含有內部crtE片段的質粒(被命名為質粒pSUPcrtE)的構建。使用US6,291,204中公開的接合方法，將質粒pSUPcrtE轉移到P.zeaxanthinifaciens菌株R1534中。在含有100μg/ml利福平和3μg/ml四環素的瓊脂培養基上篩選出轉移接合子。大約獲得103個菌落。較之菌株R1534(由于玉米黃質的產生呈現黃色)，上述菌落中的大量都顯示出了顏色的變化(變白)，這與由于對crtE基因進行插入失活造成的玉米黃質生產能力丟失一致。
十個有代表性的假定crtE整合子(integrant)被選出來，用于下述通過菌落PCR進行的分析。將菌落轉移到1.5ml的微量離心管中。在微波爐中對樣品進行加熱(1分鐘，900瓦)，然后轉移至冰上。然后將PCR混合物加入，其中含有PCR緩沖液、15％的甘油、聚合酶、核苷酸和引物。PCR條件是94℃，1分鐘，接著57℃，30秒，接著72℃，1分鐘(總共25個循環)；然后72℃7分鐘(一個循環)。所用的寡核苷酸引物經過了設計，所述設計使得僅當pSUPcrtE質粒的期待整合發生于P.zeaxanthinifaciens菌株R1534染色體上的crtE座時才可獲得PCR產物。正向引物，pCrtEampF(SEQ ID NO3)是crtE特異性的，而反向引物pCrtEampR(SEQ ID NO4)是bla(氨芐青霉素抗性基因)特異性的。使用該菌落PCR方法，我們發現，待測的10個菌落全部都含有在crtE座上的自殺型載體pSUPcrtE的整合(全部都給出了期待大小的PCR產物)。此外，用對應于載體pSUP202bla基因的特定片段而特別設計的PCR引物，檢測到，這10個crtE整合子中的8個都含有多個拷貝的pSUPcrtE，按照頭尾相連的方式排列。
通過Southern雜交對crtE整合子中的三個(和作為對照的P.zeaxanthinifaciens菌株R1534)進行進一步的分析。這些菌株生長于液體F-培養基上，并用標準方法從細胞中提取染色體DNA。用限制性酶AlwNI、XhoI、BglII、PvuII以及BglII加PvuII來對染色體DNA進行消化，并將其用于瓊脂糖凝膠電泳。片段到膜的轉移和用探針進行的雜交都按照標準工序來進行。用32P對來自P.zeaxanthinifaciens菌株R1534的crtE基因進行標記，并將其用作為探針。在所有利用來自對照菌株R1534的經消化的染色體DNA進行的雜交中，與crtE探針雜交的片段的數量和大小都如預期一樣基于從R1534染色體中分離出來的crtE基因的核苷酸序列。用來自三個crtE整合子的經消化的DNA進行的雜交的結果就與用R1534對照所獲得的結果明顯不同，并且(與菌落PCR分析的情況一樣)，上述結果與pSUPcrtE的多個拷貝在染色體crtE座的整合一致。一個被命名為R1534intE的整合子(表1中列出)，被保留下來用于進一步的實驗(實施例4中所述的)。
制造P.zeaxanthinifaciens菌株R114的crtE突變體。使用標準工序對P.zeaxanthinifaciens菌株R114進行誘變(用紫外[UV]照射或乙基磺酸甲烷[EMS]進行處理)。簡言之，對(生長于F-培養基上的)菌株R114的過夜培養物進行亞培養至OD660為0.1，并在振蕩下培養3小時。對試驗用量的(aliquots)培養物進行離心，通過重新懸浮于20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)來對細胞沉淀進行洗滌，懸浮液被再次離心以收集細胞。然后將經過洗滌的細胞沉淀重新懸浮于20mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.2)中，至OD660為0.1。對UV誘變而言，將10ml細胞懸浮液樣品轉移至100ml的玻璃燒杯中。用磁力攪拌器對懸浮液進行持續的輕柔混合(燒杯中置有回形針)。混合中的細胞懸浮液被UV光照射一段預定的時間，照射流量為1450μW/cm2。對EMS誘變而言，將0.1ml的EMS加入到10ml經洗滌的細胞懸浮液的樣品中。在旋轉式搖床上對混合物進行多達90分鐘的振蕩。然后通過離心收集細胞，洗兩次以去除誘變劑。
若干項預備實驗被用來完善與百分比存活率、用于涂板的稀釋率等相關的誘變工序。一旦這些條件已建立起來，經過UV或EMS誘變的P.zeaxanthinifaciens菌株R114的細胞就被涂布到362F/2瓊脂平板上，以分離白色(無玉米黃質生產的)菌落。很多的此類突變體被獲得，將其在362F/2瓊脂平板上重新劃線以分離單個菌落，并確證低返祖率/無返祖率。按照下面部分所述，對總共43個穩定的突變體進行進一步的檢測。
P.zeaxanthinifaciens的crtE、crtB或crtI基因突變體預期會給出白色菌落，因為番茄紅素是提供可視顏色的玉米黃質途徑的第一個中間產物。為從菌株R114的43個白色的無玉米黃質生產的突變體中鑒定出crtE突變體，使用了兩步篩選方法。首先，針對八氫番茄紅素的積累對突變體進行篩選，這是crtI基因產物，番茄紅素環化酶，活性丟失的指標。因為八氫番茄紅素在crtE被破壞的突變體中是不可能被生產出來的，所以任何能積累八氫番茄紅素的突變體都可被認定為不是crtE突變體，因此也不作進一步的考慮。第二，用攜帶有來自P.zeaxanthinifaciens菌株R114的克隆crtE基因的質粒pBBR-K-PcrtE-crtER114，對第一步中鑒定出來的無八氫番茄紅素積累的白色突變體進行轉化，以驗證遺傳互補。引入克隆crtE基因之后玉米黃質生產的恢復(即黃色菌落)強烈表明，白色菌落表型的基礎是crtE的突變，它使香葉基香葉基二磷酸酯(GGPP)合酶失活。
在搖瓶培養物中對突變體進行關于八氫番茄紅素積累的試驗。白色突變體(加親本對照菌株R114)生長于500ml帶檔板瓶中的110ml 362F/2培養基中。培養物的初始OD660是0.16。在24、48和72小時取出30ml的樣品，置于50ml的聚丙烯管中，離心以收集細胞。用水對細胞沉淀洗滌，并再次離心。然后用與實施例1中所述用于分析輔酶Q-10相同的方法，通過HPLC來對最終的細胞沉淀進行關于八氫番茄紅素積累的分析。因為目前還沒有八氫番茄紅素的標準物，對應于八氫番茄紅素的色譜峰只能通過其UV譜和由質譜分析測定的化合物質量來鑒定。對八氫番茄紅素濃度的判斷基于八氫番茄紅素和輔酶Q-10的比吸收系數的比例來進行。這種方法能夠清楚地辨別出在搖瓶培養物中積累八氫番茄紅素的那些突變體。六個不積累八氫番茄紅素的突變體(UV6-1、UV7-6、UV9-4、EMS3-6、EMS3-15和EMS9-7)被用來進行下一階段的試驗。
按照下述內容，通過克隆的crtE基因，對6個白色的無八氫番茄紅素積累的突變體UV6-1、UV7-6、UV9-4、EMS3-6、EMS3-15和EMS9-7進行遺傳互補的試驗。對每個突變體，用體積為1.5ml的固定相(stationaryphase)培養物來接種100ml的F-培養基。在28℃、200rpm下培養該培養物，直到OD660達到大約0.5。然后通過在4℃下以7000xg離心15分鐘來收獲細胞，在100ml冰冷的1mM HEPES緩沖液(pH7.0)中洗兩次，將最終的沉淀重新懸浮于0.1ml冰冷的1mM HEPES緩沖液(pH7.0)中，或者立即使用電感受態(eletrocompetent)細胞進行電穿孔，或者加入甘油至終濃度為15％，將細胞分裝成50μl的小份貯藏于-70℃。為進行轉化，將1-5μl的質粒pBBR-K-PcrtE-crtER114(在無鹽溶液中)加入到0.1ml的電感受態細胞中，進行電穿孔(條件18KV/cm，129ohms，在冰凍的1mm小管中；脈沖長度典型地在4至5毫秒之間)。然后加入1ml的F-培養基，在28℃伴隨振蕩下對細胞懸浮液進行1小時的培養。然后將懸浮液的稀釋物涂布到含有50μg/ml卡那霉素的F-瓊脂平板上，在28℃對平板進行培養。
突變體UV6-1、UV9-4、EMS3-6和EMS9-7的所有抗卡那霉素的菌落(即轉化子)顏色都是深黃色的，而UV7-6和EMS3-15突變體的轉化子保留了白色。該遺傳互補試驗表明，突變體UV6-1、UV9-4、EMS3-6和EMS9-7含有使GGPP合酶失活的crtE突變。突變體UV9-4和EMS9-7被用于進一步的實驗，以評價輔酶Q-10的生產。
實施例3 對來自P.zeaxanthinifaciens菌株R114和ATCC 21588的ddsA基因進行克隆和測序方法分離基因組DNA。在4℃下，以10000xg對600ml P.zeaxanthinifaciens菌株R114的培養物(生長于F-培養基中)進行10分鐘的離心，用200ml溶菌緩沖液(0.1M NaCl、50mM EDTA、10mM Tris-HCl，pH7.5)洗一次沉淀，再用100ml溶菌緩沖液洗一次。最終的沉淀被重新懸浮于20ml含有50mg溶菌酶和1mg RNase A的溶菌緩沖液中(無DNase)。在37℃培養15分鐘之后，加入1.5ml 20％的N-月桂酰肌氨酸鈉和2.25mg蛋白酶K。在50℃培養30-60分鐘之后，通過輕柔但徹底的混合，用一倍體積的經緩沖液飽和的苯酚(pH7.5-7.8)來對溶菌產物進行抽提。以30000xg對乳化液離心20分鐘，用苯酚對水相進行再次抽提。如前所述對這些相進行分離，再用一倍體積的苯酚∶氯仿(1∶1)對水相抽提兩次。在該步驟，在浮桶式轉子離心機(swinging bucket rotor)中于3200xg離心20分鐘足以獲得令人滿意的相分離結果。用一倍體積的氯仿進行最后抽提之后，加入0.1倍體積的3M乙酸鈉(pH5.2)，用兩倍體積冰冷的乙醇覆蓋溶液。將沉淀的DNA纏繞在玻璃棒上，用70％的乙醇浸泡5分鐘，用氯仿洗一下，然后空氣干燥5-10分鐘。將DNA重新懸浮于5ml TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)中過夜。因為由于痕量玉米黃質的存在溶液是黃色的，所以重復進行上述有機抽提和纏繞，以獲得純凈的制劑。
λ-文庫。從Stratagene(La Jolla，CA，USA)購買lambda FIXII中的帶有經Sau3AI部分消化的P.zeaxanthinifaciens菌株R114DNA的顧客定制文庫。
PCR。按照廠商說明書，使用富含GC的PCR系統(Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，德國)，在GeneAmpPCR系統9700(PEApplied Biosystems，Foster City，CA，USA)中進行PCR。典型地，使用的MgCl2濃度為1.5mM，溶解溶液(resolution solution)被加入至終濃度為1M。
DNA標記和檢測。PCR DIG Probe Synthesis試劑盒和DIGLuminescent Detection試劑盒被分別用于DNA標記和檢測(都從RocheMolecular Biochemicals，Manneheim，德國獲得)。
分離λ-DNA。按照廠商說明書，使用QiagenLambda試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)。
DNA測序。按照廠商說明書，用BigDyeDNA測序試劑盒(PEApplied Biosystems，Foster City，CA，USA)來進行測序反應。在DyeExTM旋轉柱上來純化測序反應產物，用ABI PrismTM310 GeneticAnalyzer(PE Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)來進行檢測和片段分離。
對來自P.zeaxanthinifaciens菌株R114的ddsA基因進行克隆和測序。P.zeaxanthinifaciens菌株R114的ddsA基因(編碼DPP合酶)最初是在對phaAB基因簇進行克隆和測序時被偶然鑒定出來的。使用基于P.denitrificans的phaA和phaC基因序列的引物，獲得含有來自P.zeaxanthinifaciens菌株R1534的phaA和來自P.zeaxanthinifaciens菌株R114的phaC的部分的PCR片段。然后用這些PCR片段針對phaA和phaC基因對P.zeaxanthinifaciens菌株R114的λ文庫進行篩選。從該文庫中鑒定并克隆出與探針雜交的DNA片段。測序驗證了phaA基因和phaC基因確實存在于被克隆出的片段上。此外，phaB基因被發現處于phaA基因的下游。因此，與P.denitrificans的情況一樣，P.zeaxanthinifaciens中，phaA和phaB基因是串在一起的，而phaC基因處于基因組的其它地方。對phaAB下游區域的測序揭示了被鑒定為ddsA基因的開放閱讀框，這是基于與來自P.denitrificans的ddsA基因的相似性來鑒定的。P.zeaxanthinifaciens菌株R114的ddsA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO5)及其編碼的相應的DPP合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO6)于2002年2月21日被提交至EMBL，自2002年5月2日起可被公眾所獲得，編號為AJ431695。
對來自P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588的ddsA基因進行測序。使用來自P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588的基因組DNA作為模板，用正向引物7R-01(SEQ ID NO7)和反向引物dds-3(SEQ IDNO8)來擴增ddsA基因，對PCR產物進行測序。對來自野生型菌株ATCC 21588和來自其經典獲得的突變體R114的ddsA序列的比較揭示，R114中的ddsA基因在編碼區域的核苷酸698含有G到A的突變。這將密碼子233中的中間核苷酸從GGC改變為GAC，這導致了氨基酸233從甘氨酸(ATCC 21588中)變為天冬氨酸(R114中)。
實施例4 P.zeaxanthinifaciens的ddsA基因的過量表達對P.zeaxanthinifaciens中輔酶Q-10的生產的影響克隆來自P.zeaxanthinifaciens的ddsA基因用于在P.zeaxanthinifaciens中過量表達。用ddsA/NdeI/for(SEQ ID NO9)引物和ddsA/BamHI/rev(SEQ ID NO10)引物，通過PCR從P.zeaxanthinifaciens菌株R114中擴增P.zeaxanthinifaciens菌株R114的ddsA基因的編碼區域。引物ddsA/NdeI/for含有NdeI(CATATG)限制性位點，其被定位成使得第二條一半的鏈(second half)與ddsA基因的ATG起始密碼子一致。引物ddsA/BamHI/rev含有緊接在終止密碼子之后的BamHI位點。用NdeI和BamHI來切割PCR片段，并與經NdeI-BamHI切過的載體pXI12主鏈連接(Hümbelin et al.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.221-7，1999)，得到質粒pTH36。接著，用BstXI和Bsu36I來切割載體pBBR1MCS-2(GenBank編號#U23751)，將較大的片段與退火的(annealed)寡核苷酸MCS-2上游(SEQ ID NO11)和MCS-2下游(SEQ ID NO12)相連，得到載體pBBR-K-Nde。將經過EcoRI-NdeI切割的具有SEQ ID NO13序列的片段(該片段含有來自Rhodobacter sphaeroides的核糖體RNA操縱子的rrnB啟動子)插入到經EcoRI-NdeI切割的pBBR-K-Nde主鏈中，產生質粒pBBR-K-PrrnB。最后，用NdeI和BamHI從pTH36下切下來自菌株R114的ddsA基因，將其與經過NdeI-BamHI切割的載體pBBR-K-PrrnB的主鏈相連，得到質粒pBBR-K-PrrnB-ddsAR114。
為制造用于在P.zeaxanthinifaciens中過量表達來自P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588的野生型ddsA基因的載體，用QuikChangeTM定點突變試劑盒(Stratagene)和引物dds-wt-1(SEQ IDNO14)和dds-wt-2(SEQ ID NO15)來對質粒pBBR-K-PrrnB-ddsAR114進行突變。對得到的被命名為pBBR-K-PrrnB-ddsAwt的質粒中的ddsA基因進行了完全測序，證實了想要的改變。來自P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588的ddsA基因的完整核苷酸序列在SEQ ID NO16中示出，對應的氨基酸序列在SEQ ID NO17中示出。用于評價在重組P.zeaxanthinifaciens菌株中輔酶Q-10生產的預備實驗表明，用于質粒pBBR-K-PrrnB-ddsAR114和pBBR-K-PrrnB-ddsAwt的rrnB啟動子導致了結果的不一致。因此，用P.zeaxanthinifaciens中處于crtE基因上游的DNA序列對rrnB啟動子進行了替換。該序列含有crtE啟動子。因此得到了質粒pBBR-K-PcrtE-ddsAwt和pBBR-K-PcrtE-ddsAR114，它們攜帶有具有ddsA基因上游的SEQ ID NO18(代替SEQ ID NO13)序列的EcoRI-NdeI片段。
在過量表達ddsA基因的P.zeaxanthinifaciens菌株中生產輔酶Q-10。通過電穿孔，將質粒pBBR-K-PcrtE-ddsAwt和pBBR-K-PcrtE-ddsAR114引入到P.zeaxanthinifaciens菌株R114、UV9-4、EMS9-7和R1534intE中。得到的重組菌株及其各自的親本(對照)菌株(以雙份)生長于搖瓶培養物中(培養基362F/2)，測量輔酶Q-10的產量。最初的結果顯示，P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588的野生型ddsA基因編碼DPP合酶的活性高于來自P.zeaxanthinifaciens菌株R114的突變體ddsA基因。因此，僅有過量表達野生型ddsA基因的菌株被用于進一步研究。表1中的數據清楚地顯示(通過克隆多拷貝質粒)增加野生型ddsA基因的表達，顯著地增加了P.zeaxanthinifaciens所有菌株中輔酶Q-10的產量。在不同被測菌株中，輔酶Q-10的單位生產率提高，在2倍至8倍的范圍內。
表1
nd未檢測到實施例5 對來自P.zeaxanthinifaciens菌株R114和ATCC 21588的nbiA基因進行克隆和測序通過將P.zeaxanthinifaciens菌株R114的基因組序列與已知的細菌4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶序列進行比較，來鑒定P.zeaxanthinifaciens菌株R114的ubiA基因(編碼4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶)。P.zeaxanthinifaciens菌株R114的ubiA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO19)被用于設計正向引物ubiA-Nde(SEQ ID NO21)和反向引物ubiA-Bam(SEQ ID NO22)。引物ubiA-Nde含有NdeI(CATATG)限制性位點，其被定位成使得第二條一半的鏈(secondhalf)與ubiA基因的ATG起始密碼子一致。引物ubiA-BamHI含有緊接在終止密碼子之后的BamHI位點。使用來自P.zeaxanthinifaciens菌株R114或P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588的基因組DNA作為模板，用這兩條引物來擴增ubiA基因(分離基因組DNA、PCR和DNA測序的方法在實施例3中描述)。用TOPO TA Cloning試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)將兩條PCR片段克隆進載體pCR2.1-TOPO，產生質粒pCR2.1-TOPO-ubiAwt(含有來自野生型菌株ATCC 21588的ubiA基因)和pCR2.1-TOPO-ubiAR114(含有來自突變體菌株R114的ubiA基因)。對每種質粒的克隆插入進行測序。對來自菌株ATCC 21588的ubiA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO23)和來自菌株R114的ubiA基因的核苷酸序列(SEQ IDNO19)進行的比較揭示了改變了密碼子220的一個核苷酸不同。對從兩種菌株基因組DNA擴增出來的未克隆PCR片段的相關區域進行測序，證實了這種不同，排除了PCR人為錯誤的可能性。在來自ATCC 21588菌株的野生型ubiA基因中，密碼子220是ACC(編碼蘇氨酸)，而在來自菌株R114的突變體ubiA基因中，密碼子220是ATC(編碼異亮氨酸)。SEQ ID NO20和SEQ ID NO24中分別給出了來自P.zeaxanthinifaciens菌株R114和ATCC 21588的4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的相應氨基酸序列。
實施例6 P.zeaxanthinifaciens的ubiA基因的過量表達對P.zeaxanthinifaciens中輔酶Q-10的生產的影響克隆來自P.zeaxanthinifaciens的ubiA基因用于在P.zeaxanthinifaciens中過量表達。來自P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588和R114的ubiA基因分別被來自質粒pCR2.1-TOPO-ubiAwt和pCR2.1-TOPO-ubiAR114的限制性內切酶NdeI和BamHI切割(見實施例5)，并被連接到經NdeI和BamHI切割的來自表達質粒pBBR-K-PcrtE的載體主鏈上。這使得nbiA基因處于crtE啟動子的控制下，并制造出了與實施例4中所述的表達質粒pBBR-K-PcrtE-ddsAwt和pBBR-K-PcrtE-ddsAR114類似的質粒。用新質粒pBBR-K-PcrtE-ubiAwt和pBBR-K-PcrtE-ubiAR114，通過電穿孔來轉化P.zeaxanthinifaciens菌株R1534。選擇菌株R1534是因為其含有ddsA基因的野生型染色體版本。
輔酶Q-10在過量表達ubiA基因的P.zeaxanthinifaciens菌株R1534中的生產。在生物反應器中(雙份，條件如實施例1所述)對P.zeaxanthinifaciens菌株R1534(對照菌株)、R1534/pBBR-K-PcrtE-ubiAwt和R1534/pBBR-K-PcrtE-ubiAR114進行培養，以比較輔酶Q-10的產量。表2中的結果顯示，來自P.zeaxanthinifaciensR114或ATCC 21588的ubiA基因的過量表達增加了P.zeaxanthinifaciens中輔酶Q-10的產量。
表2
序列表<110>帝斯曼知識產權資產管理有限公司<120>Co-Q10的微生物生產方法<130>21651<140>
<141>
<160>24<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>PCR正向引物<400>1aactgcagtg gccacgtcgc ccatctgtcc 30<210>2<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(33)<223>PCR反向引物<400>2aactgcagtg gccatcagcc cgccacccat gtc 33<210>3<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>PCR正向引物pCrtEampR<400>3tgatcttcga cgacatgcc 19<210>4<211>21<212>DNA
<213>人工<220>
<221>misc_featute<222>(1)..(21)<223>PCR反向引物pCrtEampR<400>4catccatagt tgcctgactc c21<210>5<211>1002<212>DNA<213>Paracoccus zeaxanthinifaciens<220>
<221>CDS<222>(1)..(1002)<223>
<400>5atg aac gtg cag gaa gac gtc cgc aaa cca ctg gac cgg ctg gcc gag 48Met Asn Val Gln Glu Asp Val Arg Lys Pro Leu Asp Arg Leu Ala Glu1 5 10 15gcg ctg gca ccc gag atg gag gcc gtg aac gcg ctg atc cgc gaa cgc 96Ala Leu Ala Pro Glu Met Glu Ala Val Asn Ala Leu Ile Arg Glu Arg20 25 30atg gcc agc agg cat gcg ccg cgc atc ccc gag gtg acc gcc cac ctg144Met Ala Ser Arg His Ala Pro Arg Ile Pro Glu Val Thr Ala His Leu35 40 45atc gag gcc ggc ggc aag cgc ctg cgc ccg atg ctg acc ctg gcc gcg192Ile Glu Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Met Leu Thr Leu Ala Ala50 55 60gcg aag ctg ctt ggc tat ggc ggc ccc tat cac gtg cat ctg gcc gcg240Ala Iys Leu Leu Gly Tyr Gly Gly Pro Tyr His Val His Leu Ala Ala65 70 75 80acg gtc gaa ttc atc cac acc gcg acc ctg ctg cat gac gac gtg gtc288Thr Val Glu Phe Ile His Thr Ala Thr Leu Leu His Asp Asp Val Val85 90 95gac gaa agc cgc cag cgc cgc ggg cgt ccg acg gcg aac ctg ctg tgg336Asp Glu Ser Arg Gln Arg Arg Gly Arg Pro Thr Ala Asn Leu Leu Trp100 105 110gac aac aag tcc agc gtg ctg gtc ggc gat tac ctg ttc gcg cgc agc384Asp Asn Lys Ser Ser Val Leu Val Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Arg Ser115 120 125ttc cag ctg atg gtc gaa ccc ggc agc atg cgc acg ctc gag atc ctg432Phe Gln Leu Met Val Glu Pro Gly Ser Met Arg Thr Leu Glu Ile Leu130 135 140tcg aac gcc gcc gcc acc atc gcc gag ggc gag gtg ctg cag ctg acc480
Ser Asn Ala Ala Ala Thr Ile Ala Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Thr145 150 155 160gcg gcg cag gat ctg gcc acg aac gag gac atc tat ctg cag gtc gtg528Ala Ala Gln Asp Leu Ala Thr Asn Glu Asp Ile Tyr Leu Gln Val Val165 170 175cgc ggc aag acg gca gcg ctg ttc tcg gcc gcg acc gag gtg ggc ggc576Arg Gly Lys Thr Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ala Thr Glu Val Gly Gly180 185 190gtc atc gcg ggc gtc ccc gat gcg cag gtc cgc gcg ctg ttc gat tac624Val Ile Ala Gly Val Pro Asp Ala Gln Val Arg Ala Leu Phe Asp Tyr195 200 205ggc gac gcg ctt ggc atc gcc ttc cag atc gtg gac gac ctg ctg gat672Gly Asp Ala Leu Gly Ile Ala Phe Gln Ile Val Asp Asp Leu Leu Asp210 215 220tac ggc ggc acc gcc gag gcg atc gac aag aat acc ggc gac gat ttc720Tyr Gly Gly Thr Ala Glu Ala Ile Asp Lys Asn Thr Gly Asp Asp Phe225 230 235 240cgc gaa cgc aag ctg acg ctg ccg gtg atc aag gcc gtg gcc cgc gcc768Arg Glu Arg Lys Leu Thr Leu Pro Val Ile Lys Ala Val Ala Arg Ala245 250 255acc ccc gag gaa cgc gcc ttc tgg tcg cgc acc atc gag aag ggc gac816Thr Pro Glu Glu Arg Ala Phe Trp Ser Arg Thr Ile Glu Lys Gly Asp260 265 270cag aag gac ggc gac ctt gaa cac gcg ctg gaa ctg ctg gcc cgc cac864Gln Lys Asp Gly Asp Leu Glu His Ala Leu Glu Leu Leu Ala Arg His275 280 285ggc gcg atg gcc gat gcc cgc cgc gac gcg ctg gac tgg gcg gcc agg912Gly Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Ala Leu Asp Trp Ala Ala Arg290 295 300gcc cgc gcc tcc ctg cag atc ctg ccc gag cat ccg atc cgc gac atg960Ala Arg Ala Ser Leu Gln Ile Leu Pro Glu His Pro Ile Arg Asp Met305 310 315 320ctg tcg gac ctg gcc gat ttc gtg gtc gaa cgc atc gcc tga 1002Leu Ser Asp Leu Ala Asp Phe Val Val Glu Arg Ile Ala325 330<210>6<211>333<212>PRT<213>Paracoccus zeaxanthinifaciens<400>6Met Asn Val Gln Glu Asp Val Arg Lys Pro Leu Asp Arg Leu Ala Glu1 5 10 15Ala Leu Ala Pro Glu Met Glu Ala Val Asn Ala Leu Ile Arg Glu Arg20 25 30
Met Ala Ser Arg His Ala Pro Arg Ile Pro Glu Val Thr Ala His Leu35 40 45Ile Glu Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Met Leu Thr Leu Ala Ala50 55 60Ala Lys Leu Leu Gly Tyr Gly Gly Pro Tyr His Val His Leu Ala Ala65 70 75 80Thr Val Glu Phe Ile His Thr Ala Thr Leu Leu His Asp Asp Val Val85 90 95Asp Glu Ser Arg Gln Arg Arg Gly Arg Pro Thr Ala Asn Leu Leu Trp100 105 110Asp Asn Lys Ser Ser Val Leu Val Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Arg Ser115 120 125Phe Gln Leu Met Val Glu Pro Gly Ser Met Arg Thr Leu Glu Ile Leu130 135 140Ser Asn Ala Ala Ala Thr Ile Ala Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Thr145 150 155 160Ala Ala Gln Asp Leu Ala Thr Asn Glu Asp Ile Tyr Leu Gln Val Val165 170 175Arg Gly Lys Thr Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ala Thr Glu Val Gly Gly180 185 190Val Ile Ala Gly Val Pro Asp Ala Gln Val Arg Ala Leu Phe Asp Tyr195 200 205Gly Asp Ala Leu Gly Ile Ala Phe Gln Ile Val Asp Asp Leu Leu Asp210 215 220Tyr Gly Gly Thr Ala Glu Ala Ile Asp Lys Asn Thr Gly Asp Asp Phe225 230 235 240Arg Glu Arg Lys Leu Thr Leu Pro Val Ile Lys Ala Val Ala Arg Ala245 250 255Thr Pro Glu Glu Arg Ala Phe Trp Ser Arg Thr Ile Glu Lys Gly Asp260 265 270Gln Lys Asp Gly Asp Leu Glu His Ala Leu Glu Leu Leu Ala Arg His275 280 285Gly Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Ala Leu Asp Trp Ala Ala Arg290 295 300Ala Arg Ala Ser Leu Gln Ile Leu Pro Glu His Pro Ile Arg Asp Met305 310 315 320Leu Ser Asp Leu Ala Asp Phe Val Val Glu Arg Ile Ala325 330
<210>7<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>PCR正向引物7R-01<400>7ttcatgatga cgtggtcgaa 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>PCR反向引物dds-3<400>8gcgcaatgcg gcccgcccct 20<210>9<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>PCR引物ddsA/NdeI/for<400>9atgccatatg aacgtgcagg aagacgtccg c 31<210>10<211>35<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(35)<223>PCR引物ddsA/BamHI/rev<400>10gcatggatcc ttatcaggcg atgcgttcga ccacg 35<210>11<211>36<212>DNA
<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(36)<223>合成DNA MCS-2上游<400>11tcagaattcg gtaccatatg aagcttggat ccgggg36<210>12<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(29)<223>合成DNA MCS-2下游<400>12ggatccaagc ttcatatggt accgaattc29<210>13<211>342<212>DNA<213>Rhodobacter sphaeroides<400>13gaattcctgc aggtcgtctc gcgcaccctc tgcggcggcc ggacgactac cggaggctct 60gagtcgccgc gcaggtcggg cgaaaggggc gggtcgcggc tccgcggcaa cgaaaaacgc 120caagatttct tggctgcgac atgaaatgtt acggagccca aaaaatccgc ttgcgcccgg 180ggccgtctgc tcctagaacc gcttcaccga gacgaagacc ggcagcgccg gacggagacg 240agggagggat gacagaaacg tcggccgcga caattgaaga tgaggcggac gggatgctgg 300ttgtctgtcg sctctagacg atcgcctacc ggagtacata tg 342<210>14<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>PCR引物dds-wt-1<400>14ccgccgaggc gatcggcaag aataccggcg a 31<210>15
<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>PCR引物dds-wt-2<400>15tcgccggtat tcttgccgat cgcctcggcg g 31<210>16<211>1002<212>DNA<213>Paracoccus zeaxanthinifaciens<220>
<221>CDS<222>(1)..(1002)<223>
<400>16atg aac gtg cag gaa gac gtc cgc aaa cca ctg gac cgg ctg gcc gag 48Met Asn Val Gln Glu Asp Val Arg Lys Pro Leu Asp Arg Leu Ala Glu1 5 10 15gcg ctg gca ccc gag atg gag gcc gtg aac gcg ctg atc cgc gaa cgc 96Ala Leu Ala Pro Glu Met Glu Ala Val Asn Ala Leu Ile Arg Glu Arg20 25 30atg gcc agc agg cat gcg ccg cgc atc ccc gag gtg acc gcc cac ctg144Met Ala Ser Arg His Ala Pro Arg Ile Pro Glu Val Thr Ala His Leu35 40 45atc gag gcc ggc ggc aag cgc ctg cgc ccg atg ctg acc ctg gcc gcg192Ile Glu Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Met Leu Thr Leu Ala Ala50 55 60gcg aag ctg ctt ggc tat ggc ggc ccc tat cac gtg cat ctg gcc gcg240Ala Lys Leu Leu Gly Tyr Gly Gly Pro Tyr His Val His Leu Ala Ala65 70 75 80acg gtc gaa ttc atc cac acc gcg acc ctg ctg cat gac gac gtg gtc288Thr Val Glu phe Ile His Thr Ala Thr Leu Leu His Asp Asp Val Val85 90 95gac gaa agc cgc cag cgc cgc ggg cgt ccg acg gcg aac ctg ctg tgg336Asp Glu Ser Arg Gln Arg Arg Gly Arg Pro Thr Ala Asn Leu Leu Trp100 105 110gac aac aag tcc agc gtg ctg gtc ggc gat tac ctg ttc gcg cgc agc384Asp Asn Lys Ser Ser Val Leu Val Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Arg Ser115 120 125ttc cag ctg atg gtc gaa ccc ggc agc atg cgc acg ctc gag atc ctg432Phe Gln Leu Met Val Glu Pro Gly Ser Met Arg Thr Leu Glu Ile Leu130 135 140
tcg aac gcc gcc gcc acc atc gcc gag ggc gag gtg ctg cag ctg acc480Ser Asn Ala Ala Ala Thr Ile Ala Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Thr145 150 155 160gcg gcg cag gat ctg gcc acg aac gag gac atc tat ctg cag gtc gtg528Ala Ala Gln Asp Leu Ala Thr Asn Glu Asp Ile Tyr Leu Gln Val Val165 170 175cgc ggc aag acg gca gcg ctg ttc tcg gcc gcg acc gag gtg ggc ggc576Arg Gly Lys Thr Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ala Thr Glu Val Gly Gly180 185 190gtc atc gcg ggc gtc ccc gat gcg cag gtc cgc gcg ctg ttc gat tac624Val Ile Ala Gly Val Pro Asp Ala Gln Val Arg Ala Leu Phe Asp Tyr195 200 205ggc gac gcg ctt ggc atc gcc ttc cag atc gtg gac gac ctg ctg gat672Gly Asp Ala Leu Gly Ile Ala Phe Gln Ile Val Asp Asp Leu Leu Asp210 215 220tac ggc ggc acc gcc gag gcg atc ggc aag aat acc ggc gac gat ttc720Tyr Gly Gly Thr Ala Glu Ala Ile Gly Lys Asn Thr Gly Asp Asp Phe225 230 235 240cgc gaa cgc aag ctg acg ctg ccg gtg atc aag gcc gtg gcc cgc gcc768Arg Glu Arg Lyg Leu Thr Leu Pro Val Ile Lys Ala Val Ala Arg Ala245 250 255acc ccc gag gaa cgc gcc ttc tgg tcg cgc acc atc gag aag ggc gac816Thr Pro Glu Glu Arg Ala Phe Trp Ser Arg Thr Ile Glu Lys Gly Asp260 265 270cag aag gac ggc gac ctt gaa cac gcg ctg gaa ctg ctg gcc cgc cac864Gln Lys Asp Gly Asp Leu Glu His Ala Leu Glu Leu Leu Ala Arg His275 280 285ggc gcg atg gcc gat gcc cgc cgc gac gcg ctg gac tgg gcg gcc agg912Gly Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Ala Leu Asp Trp Ala Ala Arg290 295 300gcc cgc gcc tcc ctg cag atc ctg ccc gag cat ccg atc cgc gac atg960Ala Arg Ala Ser Leu Gln Ile Leu Pro Glu His Pro Ile Arg Asp Met305 310 315 320ctg tcg gac ctg gcc gat ttc gtg gtc gaa cgc atc gcc tga 1002Leu Ser Asp Leu Ala Asp Phe Val Val Glu Arg Ile Ala325 330<210>17<211>333<212>PRT<213>Paracoccus zeaxanthinifaciens<400>17Met Asn Val Gln Glu Asp Val Arg Lys Pro Leu Asp Arg Leu Ala Glu1 5 10 15
Ala Leu Ala Pro Glu Met Glu Ala Val Asn Ala Leu Ile Arg Glu Arg20 25 30Met Ala Ser Arg His Ala Pro Arg Ile Pro Glu Val Thr Ala His Leu35 40 45Ile Glu Ala Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Met Leu Thr Leu Ala Ala50 55 60Ala Lys Leu Leu Gly Tyr Gly Gly Pro Tyr His Val His Leu Ala Ala65 70 75 80Thr Val Glu Phe Ile His Thr Ala Thr Leu Leu His Asp Asp Val Val85 90 95Asp Glu Ser Arg Gln Arg Arg Gly Arg Pro Thr Ala Asn Leu Leu Trp100 105 110Asp Asn Lys Ser Ser Val Leu Val Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Arg Ser115 120 125Phe Gln Leu Met Val Glu Pro Gly Ser Met Arg Thr Leu Glu Ile Leu130 135 140Ser Asn Ala Ala Ala Thr Ile Ala Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Thr145 150 155 160Ala Ala Gln Asp Leu Ala Thr Asn Glu Asp Ile Tyr Leu Gln Val Val165 170 175Arg Gly Lys Thr Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ala Thr Glu Val Gly Gly180 185 190Val Ile Ala Gly Val Pro Asp Ala Gln Val Arg Ala Leu Phe Asp Tyr195 200 205Gly Asp Ala Leu Gly Ile Ala Phe Gln Ile Val Asp Asp Leu Leu Asp210 215 220Tyr Gly Gly Thr Ala Glu Ala Ile Gly Lys Asn Thr Gly Asp Asp Phe225 230 235 240Arg Glu Arg Lyg Leu Thr Leu Pro Val Ile Lys Ala Val Ala Arg Ala245 250 255Thr Pro Glu Glu Arg Ala Phe Trp Ser Arg Thr Ile Glu Lys Gly Asp260 265 270Gln Lys Asp Gly Asp Leu Glu His Ala Leu Glu Leu Leu Ala Arg His275 280 285Gly Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Ala Leu Asp Trp Ala Ala Arg290 295 300Ala Arg Ala Ser Leu Gln Ile Leu Pro Glu His Pro Ile Arg Asp Met305 310 315 320Leu Ser Asp Leu Ala Asp Phe Val Val Glu Arg Ile Ala325 330
<210>18<211>277<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(277)<223>含有PcrtE啟動子的EcoRI-NdeI片段<400>18gaattcgctg ctgaacgcga tggcggcgcg gggcgcgacg cgcggggccg catccgtctg 60catcggcggg ggcgaggcga cggccatcgc gctggaacgg ctgagctaat tcatttgcgc 120gaatccgcgt ttttcgtgca cgatggggga accggaaacg gccacgcctg ttgtggttgc 180gtcgacctgt cttcgggcca tgcccgtgac gcgatgtggc aggcgcatgg ggcgttgccg 240atccggtcgc atgactgacg caacgaaggc acatatg 277<210>19<211>975<212>DNA<213>Paracoccus zeaxanthinifaciens<220>
<221>CDS<222>(1)..(975)<223>
<400>19atg aac aat cgt atc ttc gcc atg atg ggc aac gct atg caa agc agc 48Met Asn Asn Arg Ile Phe Ala Met Met Gly Asn Ala Met Gln Ser Ser1 5 10 15acg gaa aga cca gac gcg gtc gtc gac gcg ccg aag gga aac tgg gtc 96Thr Glu Arg Pro Asp Ala Val Val Asp Ala Pro Lys Gly Asn Trp Val20 25 30gat gag atc gcc ccg cca tgg tcg cgc ccc tgg ctg cgg ctc agc cgc144Asp Glu Ile Ala Pro Pro Trp Ser Arg Pro Trp Leu Arg Leu Ser Arg35 40 45gcg gac cgg ccc atc ggg aca tgg ctg ctg ctg ctg ccc tgc tgg tgg192Ala Asp Arg Pro Ile Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Pro Cys Trp Trp50 55 60ggg atc ggg ctg gcg atg atg gca gac ggg ccg cgc tgg ttc gat gcg240Gly Ile Gly Leu Ala Met Met Ala Asp Gly Pro Arg Trp Phe Asp Ala65 70 75 80tgg atc gcg ctg gcc tgc acc atc ggc gcc ttc gtc atg cgg ggc gcg288Trp Ile Ala Leu Ala Cys Thr Ile Gly Ala Phe Val Met Arg Gly Ala85 90 95
ggc tgc acc tgg aac gac atc acc gac cgc c gg atc gac gcg cag gtc336Gly Cys Thr Trp Asn Asp Ile Thr Asp Arg Arg Ile Asp Ala Gln Val100 105 110gca cgc acc cgc tcg cgc ccg ctg cca agc gga cag gtc acg ctg cgg384Ala Arg Thr Arg Ser Arg Pro Leu Pro Ser Gly Gln Val Thr Leu Arg115 120 125ggc gcc tat ggc tgg ctg atc gcg cag ggg ctg atc ggg ctg gcg atc432Gly Ala Tyr Gly Trp Leu Ile Ala Gln Gly Leu Ile Gly Leu Ala Ile130 135 140ctg ctg acc ctg ggg cag gcc gcg atc tgg atg ggc gtc gcc tcg ctg480Leu Leu Thr Leu Gly Gln Ala Ala Ile Trp Met Gly Val Ala Ser Leu145 150 155 160gcg ctg gtc gcg atc tat ccc ttc gcg aaa cgc ttc acc tgg tgg ccg528Ala Leu Val Ala Ile Tyr Pro Phe Ala Lys Arg Phe Thr Trp Trp Pro165 170 175cag atc ttc ctg ggg ctg gcc ttc aac tgg ggc gtc atg ctg gcc tat576Gln Ile Phe Leu Gly Leu Ala Phe Asn Trp Gly Val Met Leu Ala Tyr180 185 190gcc gcg cat gcg ggc cgt gtc gat gcg gcc cct gtc gtg gca tgg ctg624Ala Ala His Ala Gly Arg Val Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Trp Leu195 200 205ggg gcc atc gcc tgg acg atc ttc tac gac acc atc tat gcc cac cag672Gly Ala Ile Ala Trp Thr Ile Phe Tyr Asp Thr Ile Tyr Ala His Gln210 215 220gac gcc gag gac gac gcc ctg atc ggg gtg aaa tcc acc gcg cgg ctg720Asp Ala Glu Asp Asp Ala Leu Ile Gly Val Lys Ser Thr Ala Arg Leu225 230 235 240ttc ggc gac aaa agc ccg cgc atc ctt gcg gga ttc gcc ctg ggc gcg768Phe Gly Asp Lys Ser Pro Arg Ile Leu Ala Gly Phe Ala Leu Gly Ala245 250 255gtc ctg gtg ctg atg ctg gcc acc gcg ctg ccc ggt cgc aat ctg ttg816Val Leu Val Leu Met Leu Ala Thr Ala Leu Pro Gly Arg Asn Leu Leu260 265 270att gcc tgg gcg ggc gtc gcg ggt ttc ggc ctg cac cta ggc tgg cag864Ile Ala Trp Ala Gly Val Ala Gly Phe Gly Leu His Leu Gly Trp Gln275 280 285ctt cgc aaa ttc cag ccg gat cag ggc gat acc tgc ctg cgc ctg ttc912Leu Arg Lys Phe Gln Pro Asp Gln Gly Asp Thr Cys Leu Arg Leu Phe290 295 300cgg tcc aac cgc gat gcg ggg ctg atc cttgcg ctg ttt ctt gcc gtg 960Arg Ser Asn Arg Asp Ala Gly Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Ala Val305 310 315 320gcg ggc ctc gca tga975Ala Gly Leu Ala
<210>20<211>324<212>PRT<213>Paracoccus zeaxanthinifaciens<400>20Met Asn Asn Arg Ile Phe Ala Met Met Gly Asn Ala Met Gln Ser Ser1 5 10 15Thr Glu Arg Pro Asp Ala Val Val Asp Ala Pro Lys Gly Asn Trp Val20 25 30Asp Glu Ile Ala Pro Pro Trp Ser Arg Pro Trp Leu Arg Leu Ser Arg35 40 45Ala Asp Arg Pro Ile Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Pro Cys Trp Trp50 55 60Gly Ile Gly Leu Ala Met Met Ala Asp Gly Pro Arg Trp Phe Asp Ala65 70 75 80Trp Ile Ala Leu Ala Cys Thr Ile Gly Ala Phe Val Met Arg Gly Ala85 90 95Gly Cys Thr Trp Asn Asp Ile Thr Asp Arg Arg Ile Asp Ala Gln Val100 105 110Ala Arg Thr Arg Ser Arg Pro Leu Pro Ser Gly Gln Val Thr Leu Arg115 120 125Gly Ala Tyr Gly Trp Leu Ile Ala Gln Gly Leu Ile Gly Leu Ala Ile130 135 140Leu Leu Thr Leu Gly Gln Ala Ala Ile Trp Met Gly Val Ala Ser Leu145 150 155 160Ala Leu Val Ala Ile Tyr Pro Phe Ala Lys Arg Phe Thr Trp Trp Pro165 170 175Gln Ile Phe Leu Gly Leu Ala Phe Asn Trp Gly Val Met Leu Ala Tyr180 185 190Ala Ala His Ala Gly Arg Val Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Trp Leu195 200 205Gly Ala Ile Ala Trp Thr Ile Phe Tyr Asp Thr Ile Tyr Ala His Gln210 215 220Asp Ala Glu Asp Asp Ala Leu Ile Gly Val Lys Ser Thr Ala Arg Leu225 230 235 240Phe Gly Asp Lys Ser Pro Arg Ile Leu Ala Gly Phe Ala Leu Gly Ala245 250 255Val Leu Val Leu Met Leu Ala Thr Ala Leu pro Gly Arg Asn Leu Leu260 265 270
Ile Ala Trp Ala Gly Val Ala Gly Phe Gly Leu His Leu Gly Trp Gln275 280 285Leu Arg Lys Phe Gln Pro Asp Gln Gly Asp Thr Cys Leu Arg Leu Phe290 295 300Arg Ser Asn Arg Asp Ala Gly Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Ala Val305 310 315 320Ala Gly Leu Ala<210>21<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>PCR引物ubiA-Nde<400>21aaggcctcat atgaacaatc gtatcttcgc 30<210>22<211>28<212>DNA<213>人工<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>PCR引物ubiA-Bam<400>22cgggatcctc atgcgaggcc cgccacgg 28<210>23<211>975<212>DNA<213>Paracoccus zeaxanthinifaciens<220>
<221>CDS<222>(1)..(975)<223>
<400>23atg aac aat cgt atc ttc gcc atg atg ggc aac gct atg caa agc agc 48Met Asn Asn Arg Ile Phe Ala Met Met Gly Asn Ala Met Gln Ser Ser1 5 10 15acg gaa aga cca gac gcg gtc gtc gac gcg ccg aag gga aac tgg gtc 96Thr Glu Arg Pro Asp Ala Val Val Asp Ala Pro Lys Gly Asn Trp Val20 25 30
gat gag atc gcc ccg cca tgg tcg cgc ccc tgg ctg cgg ctc agc cgc144Asp Glu Ile Ala Pro Pro Trp Ser Arg Pro Trp Leu Arg Leu Ser Arg35 40 45gcg gac cgg ccc atc ggg aca tgg ctg ctg ctg ctg ccc tgc tgg tgg192Ala Asp Arg Pro Ile Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Pro Cys Trp Trp50 55 60ggg atc ggg ctg gcg atg atg gca gac ggg ccg cgc tgg ttc gat gcg240Gly Ile Gly Leu Ala Met Met Ala Asp Gly Pro Arg Trp Phe Asp Ala65 70 75 80tgg atc gcg ctg gcc tgc acc atc ggc gcc ttc gtc atg cgg ggc gcg288Trp Ile Ala Leu Ala Cys Thr Ile Gly Ala Phe Val Met Arg Gly Ala85 90 95ggc tgc acc tgg aac gac atc acc gac cgc cgg atc gac gcg cag gtc336Gly Cys Thr Trp Asn Asp Ile Thr Asp Arg Arg Ile Asp Ala Gln Val100 105 110gca cgc acc cgc tcg cgc ccg ctg cca agc gga cag gtc acg ctg cgg384Ala Arg Thr Arg Ser Arg Pro Leu Pro Ser Gly Gln Val Thr Leu Arg115 120 125ggc gcc tat ggc tgg ctg atc gcg cag ggg ctg atc ggg ctg gcg atc432Gly Ala Tyr Gly Trp Leu Ile Ala Gln Gly Leu Ile Gly Leu Ala Ile130 135 140ctg ctg acc ctg ggg cag gcc gcg atc tgg atg ggc gtc gcc tcg ctg480Leu Leu Thr Leu Gly Gln Ala Ala Ile Trp Met Gly Val Ala Ser Leu145 150 155 160gcg ctg gtc gcg atc tat ccc ttc gcg aaa cgc ttc acc tgg tgg ccg528Ala Leu Val Ala Ile Tyr Pro Phe Ala Lys Arg Phe Thr Trp Trp Pro165 170 175cag atc ttc ctg ggg ctg gcc ttc aac tgg ggc gtc atg ctg gcc tat576Gln Ile Phe Leu Gly Leu Ala Phe Asn Trp Gly Val Met Leu Ala Tyr180 185 190gcc gcg cat gcg ggc cgt gtc gat gcg gcc cct gtc gtg gca tgg ctg624Ala Ala His Ala Gly Arg Val Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Trp Leu195 200 205ggg gcc atc gcc tgg acg atc ttc tac gac acc acc tat gcc cac cag672Gly Ala Ile Ala Trp Thr Ile Phe Tyr Asp Thr Thr Tyr Ala His Gln210 215 220gac gcc gag gac gac gcc ctg atc ggg gtg aaa tcc acc gcg cgg ctg720Asp Ala Glu Asp Asp Ala Leu Ile Gly Val Lys Ser Thr Ala Arg Leu225 230 235 240ttc ggc gac aaa agc ccg cgc atc ctt gcg gga ttc gcc ctg ggc gcg768Phe Gly Asp Lys Ser Pro Arg Ile Leu Ala Gly Phe Ala Leu Gly Ala245 250 255gtc ctg gtg ctg atg ctg gcc acc gcg ctg ccc ggt cgc aat ctg ttg816Val Leu Val Leu Met Leu Ala Thr Ala Leu Pro Gly Arg Asn Leu Leu
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權利要求
1.一種經分離的DNA，其中包含(1)編碼癸異戊二烯基二磷酸酯(DPP)合酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自由以下序列構成的組(a)SEQ ID NO16所示的DNA序列或其互補鏈；(b)一種DNA序列，其在標準條件下能與(a)中定義的DNA序列或其片段雜交，并編碼具有DPP合酶活性的多肽；(c)一種DNA序列，其與編碼SEQ ID NO17所示的多肽的DNA至少80％相同，并且其編碼具有DPP合酶活性的多肽；和(d)一種DNA序列，其編碼與SEQ ID NO17所示的氨基酸序列至少80％相同的多肽，并編碼具有DPP合酶活性的多肽；以及(2)編碼4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自由以下序列構成的組(a’)SEQ ID NO23所示的DNA序列或其互補鏈；(b’)一種DNA序列，其在標準條件下能與(a’)中定義的DNA序列或其片段雜交，并編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽；(c’)一種DNA序列，其與編碼SEQ ID NO24所示的多肽的DNA至少80％相同，并且其編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽；和(d’)一種DNA序列，其編碼與SEQ ID NO24所示的氨基酸序列至少80％相同的多肽，并編碼具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽。
2.一種多肽，包含(1)具有氨基酸序列SEQ ID NO17，或較之SEQ ID NO17有一個或幾個氨基酸缺失、添加或插入的氨基酸序列，并具有DPP合酶活性的多肽，和(2)具有氨基酸序列SEQ ID NO24，或較之SEQ ID NO24有一個或幾個氨基酸缺失、添加或插入的氨基酸序列，并具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶活性的多肽。
3.包含如權利要求1所述的DNA的構建體。
4.如權利要求3所述的構建體，進一步地包含調控序列。
5.包含如權利要求1所述的DNA的微生物。
6.包含如權利要求3或4所述的構建體的微生物。
7.一種在微生物中生產輔酶Q-10的方法，所述方法包括如下步驟(a)增加具有DPP合酶的蛋白質和/或具有4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的蛋白質的活性，以及(b)在生產輔酶Q-10的條件下，于培養基中培養所述的微生物。
8.如權利要求7所述的方法，其中編碼DPP合酶的ddsA的表達，和/或編碼4-羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶的ubiA的表達被增加。
9.如權利要求7或8所述的方法，進一步包含通過在所述微生物中對crtE基因進行突變來去除香葉基香葉基二磷酸酯(GGPP)合酶活性的步驟。
全文摘要
本發明涉及輔酶Q－10的合成中涉及到的酶，即癸異戊二烯基二磷酸酯(DPP)合酶和4－羥基苯甲酸聚異戊二烯基轉移酶，涉及編碼所述酶的經過分離的DNA，還涉及對輔酶Q－10進行微生物生產的方法。
文檔編號C12N9/10GK1751124SQ200480004590
公開日2006年3月22日 申請日期2004年2月13日 優先權日2003年2月19日
發明者馬卡斯·赫姆貝里恩, 如爾·羅帕斯-烏里巴瑞, 約翰·B·伯金斯, 格赫斯蘭·舍恩斯 申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司