專利名稱：用于形成角膜上皮的細胞片、及其制造方法和使用方法
技術領域：
本發明涉及在生物學、醫學等領域中，用于形成角膜上皮的細胞片、其制造方法和使用它們的治療方法。
背景技術：
隨著醫療技術的顯著發展，近年來，用他人的器官替換難以治療的器官的器官移植得到了普遍化。成為移植對象的器官十分多樣，包括皮膚、角膜、腎臟、肝臟、心臟等，并且術后的療程也變得格外良好，因此已被確立為醫療的一種技術。作為一個例子舉出角膜移植，約40年前在日本也設立了角膜銀行并開始了移植工作。但是，由于角膜捐獻者人數很少，相對于僅國內每年需要角膜移植的患者就有約2萬人來說，實際上能夠進行移植治療的患者只有其1/10，約2000人左右。現在的情況是盡管角膜移植的技術已被大致確立，但由于角膜捐獻不足的問題，所以需要尋找下一種醫療技術。
基于這樣的背景，從過去開始，將人工替代物和培養細胞使之組織化而成的移植物直接移植的技術受到關注。其代表性的例子可以舉出人工皮膚和培養皮膚。但是，使用合成高分子的人工皮膚具有產生排斥反應等的可能性，作為移植用皮膚不能令人滿意。另一方面，由于培養皮膚是將患者本人的部分正常皮膚培養到所希望的大小，因此使用它不需擔心排斥反應等，可以說是最自然的掩蔽劑。
一直以來，這樣的細胞培養是在玻璃表面上或在經過種種處理的合成高分子的表面上進行的。例如，進行了如Y射線照射、硅酮涂布等表面處理的各種聚苯乙烯材質容器等作為細胞培養用容器得到普及。使用這樣的細胞培養用容器培養、增殖的細胞，通過用胰島素之類的蛋白分解酶或化學藥品進行處理而被從容器表面剝離、回收。
但是，實施如上所述的化學藥品處理來回收增殖的細胞時，處理工程繁雜，混入雜質的可能性大，并且增殖的細胞經過化學處理而轉化或受到損傷、細胞原有的機能受到損害，具有如上等缺點。為了克服上述缺點，至今提出了若干技術方案。
日本專利特公平2-23191號公報中記載了制造可以移植角蛋白組織的膜的方法，其特征為，在角蛋白組織的膜可以在容器表面上形成的條件下，在培養容器中培養源自人新生兒的角化表皮細胞，使用酶來剝離角蛋白組織的膜。具體而言，公開了這樣的技術將3T3細胞作為飼養層使其增殖、多層化，使用作為蛋白質分解酶的分散劑回收細胞片。但是，該公報中所記載的方法具有如下缺點(1)分散劑源自菌，所回收的細胞片必須充分地洗凈。
(2)所培養的每種細胞其分散劑處理條件都不同，而且對該處理必須熟練。
(3)通過分散劑處理來培養的表皮細胞在病理學上被活化。
(4)由于分散劑處理，胞外基質被分解。
(5)因此移植了該細胞片的患處易受感染。
除上述的現有技術的缺點之外，作為本發明對象的角膜上皮細胞、角膜內皮細胞、以及結膜上皮細胞等前眼部相關細胞，還具有如下缺點前眼部相關細胞由于細胞和細胞間的結合不如皮膚細胞強，因此即使使用上述分散劑，培養后也無法作為整個細胞片進行剝離、回收。
為了解決上述問題，最近提出，在除去了海綿層和上皮層的羊膜上培養角膜上皮細胞或結膜上皮細胞、并使之組織化，并連同該羊膜一起作為移植用細胞片的技術(日本專利特開號)。由于羊膜具有充分的膜強度，并且不具有抗原性，因此作為移植用細胞片的支持體相當合適，但是羊膜這種東西原先并不在眼睛內，為了更精密地構筑眼內組織，還是希望制造僅用眼內的細胞就具有充分強度的細胞片，該細胞片與角膜實質組織直接接觸。
另外，在日本專利特愿號中，在細胞培養支持體上培養前眼部相關細胞，該細胞培養支持體是將相對于水的上限或下限臨界溶解溫度為0～80℃的溫度響應性聚合物覆蓋在基材表面上而成的，根據需要按照常規方法將培養細胞層多層化，通過只改變支持體的溫度來剝離所培養的細胞片，制造具有充分強度的細胞片成為可能。另外，在該細胞片上還保持有基底膜類蛋白質，與上述用分散劑處理的細胞片相比，對組織的成活性也得到明顯改善。但是，考慮到實際減輕患者的負擔，希望能夠進一步改善該成活性。
另外，最近在醫療現場也有多種方法被提案。例如，WO98/31316中提出，為了治療近視進行PRK法、LASIK法時，利用培養的角膜上皮細胞片的技術。但是，這里的培養角膜上皮細胞片是由上述分散劑剝離的細胞片，存在這樣的問題，即，培養角膜上皮細胞片對激光削薄的角膜組織的附著性差，無法取得顯著的治療效果。
另外，2001年5月10目的每日新聞紀事中，對角膜疾病的患者提出代替角膜粘貼培養口腔粘膜，促使患者角膜再生的技術。但是，這里的培養口腔粘膜是由上述分散劑剝離的粘膜，存在這樣的問題，即，培養口腔粘膜對患者的角膜組織的附著性差，無法取得顯著的治療效果。
本發明以解決上述現有技術的問題為目標。即，本發明的目的在于提供對前眼部組織的附著性良好的用于形成角膜上皮的細胞片。另外，本發明的目的在于提供其制造方法以及使用方法。

發明內容
本發明人們為了解決上述課題，從各種角度加以探討，進行了研究開發。其結果發現，在用溫度響應性聚合物覆蓋基材表面的特定條件的細胞培養支持體上，在特定條件下培養用于形成角膜上皮的細胞，之后，使培養液溫度在上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，將所培養的用于形成角膜上皮的細胞片附著在特定的載體上，通過一邊抑制細胞片的收縮，一邊將其連同載體一起進行剝離，可以得到對活體組織附著性非常優良的用于形成角膜上皮的細胞片。本發明基于上述認識得以完成。
即本發明提供了對前眼部組織的附著性良好的、緊密貼合在載體上的用于形成角膜上皮的細胞片。
另外，本發明提供了對活體組織的附著性非常良好的用于形成角膜上皮的細胞片的制造方法，其特征為，在用0～80℃的溫度范圍內水合力變化的溫度響應性聚合物覆蓋基材表面而成的細胞培養支持體上培養用于形成角膜上皮的細胞，根據需要按照常規方法使培養細胞層多層化，之后，(1)使培養液溫度在上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，(2)將所培養的用于形成角膜上皮的細胞緊密貼合在載體上，(3)將其連同載體一起剝離。
本發明還提供用于治療損傷和/或創傷達到深部的組織的、對活體組織的附著性非常良好的用于形成角膜上皮的細胞片。
本發明還進一步提供治療方法，其特征為，對損傷和/或創傷達到深部的組織，移植對活體組織的附著性非常良好的用于形成角膜上皮的細胞片。
本發明進一步提供不僅是醫療領域，作為用于評價化學物質、毒物或藥品的安全性的細胞有用的用于形成角膜上皮的細胞片。
具體實施例方式
如上所述，本發明提供緊密貼合在載體上的用于形成角膜上皮的細胞片。在本發明中，稱為“用于形成角膜上皮的細胞片”時，包含了由角膜上皮細胞形成的再生角膜上皮細胞片，或由角膜上皮細胞以外的細胞形成的角膜上皮代替細胞片。
作為本發明的用于形成角膜上皮的細胞片使用再生角膜上皮細胞片時，適合使用的細胞可以列舉角膜上皮細胞及其干細胞，但其種類不受任何制約。
另外，作為本發明的用于形成角膜上皮的細胞片使用角膜上皮代替細胞片時，適合使用的細胞可以列舉例如存在于頰膜、牙齦上的口腔粘膜細胞、毛根細胞、結膜上皮細胞中的任意一種或兩種以上的混合物，或者它們與角膜上皮細胞的混合物，但其種類不受任何制約。制造這些的細胞片等時，不必在角膜上皮代替細胞的培養中添加特別的添加物，例如將口腔粘膜細胞作為角膜上皮代替細胞使用時，可以使用口腔粘膜細胞的標準的細胞培養方法進行培養，制造細胞培養片等。
本發明的前后內容中，用于形成角膜上皮的細胞片，可以是單層細胞片的狀態、也可一是多層化細胞片的狀態。因此，稱作“再生角膜上皮細胞片”時，包括再生角膜上皮細胞的單層細胞片或多層化細胞片；稱作“角膜上皮代替細胞片”時，包括角膜上皮代替細胞的單層細胞片或多層化細胞片。即，用于形成角膜上皮的細胞片可以是再生角膜上皮細胞或角膜上皮代替細胞的單層細胞片或者多層化細胞片的任意一種。
本發明中，所謂再生角膜上皮細胞片是指，上述各種細胞在培養支持體上培養成單層狀，之后，從支持體剝離的細胞片；其多層化細胞片是指，該再生角膜上皮細胞片以單獨狀態或以與其它細胞形成的細胞片組合的狀態多層化而形成的細胞片。
另外，本發明中，所謂角膜上皮代替細胞片是指，上述各種細胞在培養支持體上培養成單層狀，之后，從支持體剝離的細胞片；其多層化細胞片是指，該角膜上皮代替細胞片以單獨狀態或以與其它細胞形成的細胞片組合的狀態多層化而形成的細胞片。
本發明的用于形成角膜上皮的細胞片在培養時不會受到以分散劑、胰島素等為代表的蛋白質分解酶引起的損傷。因此，從基材上剝離的用于形成角膜上皮的細胞片，保持著細胞-細胞間的橋粒結構，結構的缺陷少，強度高。另外，本發明的細胞片在培養時形成的細胞-基材間的基底膜類蛋白質也不會受到酶的破壞。因此，移植時能夠與活體組織良好地粘結，可以實施效率優良的治療。像這樣具有對活體組織的附著性非常高的性質，在本發明中稱為“高附著性”。
對以上事實進行具體說明，使用胰島素等常用的蛋白質分解酶的情況下，細胞-細胞間的橋粒結構以及細胞、基材間的基底膜類蛋白質等幾乎無法保持，因而，細胞成為各自分開的狀態被剝離。其中，關于作為蛋白質分解酶的分散劑，已知對細胞-細胞間的橋粒結構可以以保持10～60％的狀態剝離，但是對細胞-基材間的基底膜類蛋白質等破壞掉大部分，所以得到的細胞片強度弱。與之相對，本發明的細胞片，橋粒結構、基底膜類蛋白質殘留了80％或80％以上，可以得到前述的種種效果。從而，上述的“高附著性”在結構上是指，橋粒結構和/或基底膜類蛋白質殘留了80％或80％以上的狀態。
本發明的用于形成角膜上皮的細胞片在作為活體組織的前眼部組織能極其良好地成活；即具有“高附著性”。我們發現，作為實現該性質的要因，必須抑制從支持體表面剝離的再生角膜上皮細胞片或其多層化細胞片的收縮。此時，用于形成角膜上皮的細胞片的收縮率在細胞片內的任意方向的長度上都希望達到20％或20％以下，優選是10％或10％以下，更優選是5％或5％以下。在細胞片的任意方向的長度上達到20％或20％以上時，剝離的細胞變松弛，該狀態下附著在活體組織，也無法緊密貼合在組織上，無法達到本發明所提供的“高成活性”。
抑制用于形成角膜上皮的細胞片的收縮的方法，只要是不讓細胞片收縮，就不受任何方法上的制約，例如可以舉出，從支持體剝離用于形成角膜上皮的細胞片時，在該細胞片上緊密貼合切掉了中心部分的環狀載體等，將該載體與細胞片一起剝離的方法等。
緊密貼合用于形成角膜上皮的細胞片時使用的載體，是為了保持本發明的細胞片不收縮的結構物，可以使用例如聚合物膜或由聚合物膜成型的結構物、金屬性夾具等。例如，使用聚合物作為載體材料時，其具體的材料可以列舉聚二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯、聚乙烯、纖維素及其衍生物、紙類、幾丁質(chitin)、殼聚糖(chitosan)、膠原質、烏拉坦(urethane)等。
本發明中所謂緊密貼合的情況是指，在細胞片與載體的邊界面上，細胞片在載體上不會錯離也不會移動，以使細胞片不收縮的狀態，可以由物理性的結合而緊密貼合，也可以通過兩者之間存在的液體(例如培養液、其他等滲液)緊密貼合。
載體的形狀不受特別的限制，例如，移植所得到的用于形成角膜上皮的細胞片時，使用在載體的一部分上切掉與移植部位同等大小或者比移植部位大的部分的載體，則細胞片僅固定在被切掉的周圍的部分，僅將位于切掉部分的細胞片接觸到移植部位就可以，是比較合適的。
另外，本發明的細胞片，可以在支持體表面上接種用于形成角膜上皮的細胞后，經過培養而得到，但是最好是細胞在支持體表面上達到鋪滿(充滿的狀態)后21天以內，優選15天以內，更優選10天以內。若細胞達到鋪滿(充滿的狀態)后21天以上，則所剝離的用于形成角膜上皮的細胞片的最下層的細胞活性降低，因此附著性也降低，無法達到本發明的特征——“高成活性”。
本發明的用于形成角膜上皮的細胞片，除可用于治療例如角膜糜爛、角膜潰瘍等前眼部組織的部分或全部損傷或缺損的患處等之外，還可用于治療不具有角膜上皮細胞的雙眼性的難治性角結膜疾病。本發明的前眼部組織只要是前眼部則不被特別限定，通常，可以列舉角膜上皮組織、鮑曼氏(Bowman′s)組織、角膜實質組織等。在這里所謂難治性角結膜疾病包含例如皮膚粘膜眼癥候群(Stevens-Johnson癥候群)、眼部類天胞瘡、燙傷、堿腐蝕、酸腐蝕之類的疾病。
本發明的用于形成角膜上皮的細胞片，如上所示，是對活體組織——前眼部組織能極其良好地附著的細胞片，是從現有技術完全無法得到的產品。
并且，本發明還提供了由以下的制造方法制造上述本發明的用于形成角膜上皮的細胞片的方法。即，提供了用于形成角膜上皮的細胞片的制造方法，其特征為，在用0～80℃的溫度范圍內水合力變化的溫度響應性聚合物覆蓋基材表面而成的細胞培養支持體上培養用于形成角膜上皮的細胞，根據需要按照常規方法使培養細胞層多層化，之后，(1)使培養液溫度在上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，
(2)將所培養的用于形成角膜上皮的細胞緊密貼合在載體上，(3)將其連同載體一起剝離。
用這種方法得到的用于形成角膜上皮的細胞片具有對活體組織有“高附著性”的特征。
細胞培養支持體上用于覆蓋基材的溫度響應性聚合物，其特征為水合力在0～80℃溫度范圍內變化，優選在20℃～50℃溫度范圍內變化。這樣的溫度響應性聚合物的一種情況，可以舉出在水溶液中具有上限臨界溶解溫度或下限臨界溶解溫度0～80℃，優選在20℃～50℃的聚合物。若超過80℃，細胞就有死亡的可能性，因此不優選。另外，若低于0℃，通常細胞增殖速度極度降低，或細胞會死亡，因此也不優選。
本發明中，從細胞培養支持體上剝離用于形成角膜上皮的細胞片時，優選低溫處理。本發明中低溫處理優選的溫度條件為0℃～30℃，優選的處理時間為2分鐘～1小時，但并不限定于這些溫度及時間。作為優選條件的一個例子，低溫處理可以使用在20℃培養30分鐘這樣的條件。
本發明中使用的溫度響應性聚合物可以是均聚物或共聚物的任一類。這樣的聚合物可以列舉例如日本專利特開平2-211865號公報中記載的聚合物。具體而言，例如，由以下的單體單獨聚合或者共聚得到。可使用的單體，例如可以列舉(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或者N，N-二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物、或者乙烯醚衍生物，對于共聚物，可以使用其中任意兩種或兩種以上。另外，也可以使用與上述單體以外的單體類的共聚，聚合物之間的接枝或共聚，或者聚合物、共聚物的混合物。另外，也可以在不損害聚合物原有性質的范圍內進行交聯。
被實施覆蓋的基材，從常用于細胞培養的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、有機玻璃等化合物開始，到通常能夠賦予形態的物質，例如上述之外的聚合物、陶瓷類等全都可以使用。
溫度響應性聚合物向支持體上覆蓋的方法不受特別的限制，例如，可以按照日本專利特開平2-211865號公報中記載的方法進行。即，可以對基材和上述單體或聚合物，利用電子束照射(EB)、Y射線照射、紫外線照射、等離子處理、電暈處理、有機聚合反應的任意種，或者利用涂布、混煉等物理吸附等進行所述覆蓋。
溫度響應性聚合物的覆蓋量最好是0.4～4.5μg/cm2的范圍，優選0.7～3.5μg/cm2，更優選0.9～3.0μg/cm2。覆蓋量少于0.2μg/cm2時，即使給與刺激，該聚合物上的細胞也難以剝離，操作效率非常差，不優選。反之，覆蓋量在4.5μg/cm2以上時，細胞難以附著在該區域，難以充分附著細胞。
本發明中對支持體的形態沒有特別的限制，例如可以列舉皿、multiplate微孔板、燒瓶、細胞培養小室(Cell Insert)等。其中，特別對于細胞培養小室，例如可以將多層化角膜上皮細胞時所必需的3T3飼養細胞與角膜上皮細胞分開進行培養，因而較好。此時，角膜上皮細胞可以在細胞培養小室的一側，也可以在安裝有細胞培養小室的圓盤一側，至少必須在培養角膜上皮細胞的表面上覆蓋有溫度響應性聚合物。
本發明中，細胞的培養在如上所述制造的細胞培養支持體上進行。覆蓋在基材表面上的前述聚合物具有上限臨界溶解溫度時，培養基的溫度在該溫度以下，另外，覆蓋在基材表面上的前述聚合物具有下限臨界溶解溫度時，培養基的溫度在該溫度以上，除此之外，培養基的溫度不受特別的限制。但是，在導致培養細胞無法增殖的低溫區域、或導致培養細胞死亡的高溫區域中的培養顯然是不合適的。溫度以外的培養條件只要按照常規方法就可以，不受特別的限制。例如，對于使用的培養基，可以是添加有公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培養基，另外也可以是不添加這類血清的無血清培養基。
本發明的方法中，從支持體材料剝離回收所培養的細胞時，使培養的用于形成角膜上皮的細胞緊密貼合在載體上，通過將附著有細胞的支持體材料的溫度調節成支持體基材的覆蓋聚合物的上限臨界溶解溫度以上或者下限臨界溶解溫度以下，可以連同載體一起剝離。另外，細胞片的剝離可以在培養細胞的培養液中進行，也可以在其它等滲液中進行，可以對應目的進行選擇。
本發明中，將細胞片接觸到患處之后，將細胞片從載體剝離就可以。該剝離方法不受任何限制，例如，可以是濡濕載體，使載體與細胞片的緊密貼合性減弱的剝離方法；或者也可以是用手術刀、剪刀、激光、等離子波等工具切斷的方法。例如使用上述緊密貼合在部分切掉的載體上的細胞片的情況下，若使用激光等沿著患處的邊界線切斷，則可避免細胞片附著到患處之外不需要的部分上，是比較合適的。
本發明的用于形成角膜上皮的細胞片與活體組織間的固定方法不受特別的限定，可以縫合細胞片和活體組織，或者由于本發明的用于形成角膜上皮的細胞片迅速地在活體組織上成活，附著于患處的細胞片不與活體縫合也可以。特別對于后者，為了保護移植的細胞片，也可以同時使用隱形眼鏡。
作為本發明的一種方式的多層化細胞片的制造方法不受特別的限定，例如，可以列舉通常所知的3T3細胞作為飼養層進行增殖、多層化的方法，或者利用上述緊密貼合在載體上的用于形成角膜上皮的細胞片制造的方法等。具體而言，可以例示下述方法(1)將與載體緊密貼合的細胞片附著在細胞培養支持體上，之后加入培養基，使載體脫離細胞片，然后重復將其它與載體緊密貼合的細胞片附著的操作，使細胞片多層化。
(2)將與載體緊密貼合的細胞片反轉，以載體一側固定于細胞培養支持體上，在細胞片一側附著其它的細胞片，之后加入培養基使載體脫離細胞片，然后重復將其它細胞片附著的操作，使細胞片多層化。
(3)將與載體緊密貼合的細胞片彼此之間以細胞片一側緊密貼合的方法。
(4)將與載體緊密貼合的細胞片接觸到患處，使細胞片附著于活體組織上之后，剝離載體，再重疊其它的細胞片的方法。
本發明中的多層化細胞片，不一定是僅由用于形成角膜上皮的細胞片形成。例如，也可以將用于形成角膜上皮的細胞片的一種形態的角膜上皮細胞片與進行同樣的操作制造的角膜內皮細胞片和/或結膜上皮細胞片進行重疊。在使細胞片更加接近活體內的前眼部組織的方面，這樣的技術極為有效。
為達到將高回收率地剝離、回收用于形成角膜上皮的細胞片的目的，可以單獨使用或者同時使用下述方法或者輕敲或者晃動細胞培養支持體的方法，或用移液器攪拌培養基的方法等。另外，根據需要也可以用等滲液等沖洗培養細胞進行剝離回收。
本發明所示的用于形成角膜上皮的細胞片的用途不受任何限制，例如如上所述，除對角膜糜爛、角膜潰瘍等前眼部組織的部分或全部損傷或缺損的患處等之外，還對不具有角膜上皮細胞的雙眼性的難治性角結膜疾病等的治療有效。或者，本發明所示的用于形成角膜上皮的細胞片對屈光矯正有效，所述屈光矯正有用受激準分子激光器照射中央部分，削去角膜表面，減少角膜的屈光度，從而矯正近視的準分子激光屈光性角膜切削術(PRK)；用微型角膜刀以160μm的厚度切斷角膜實質層，制造角膜瓣，然后揭下該角膜瓣，用受激準分子激光器削去角膜實質層，平整表面，最后將角膜瓣放回本來的位置的準分子激光原位角膜磨鑲術(LASIK)；用酒精滴眼使角膜表面軟化，不使用微型角膜刀而切除角膜上皮50μm厚，制造角膜上皮瓣，用受激準分子激光器削去角膜實質層，平整表面，最后將角膜上皮瓣放回本來的位置的準分子激光角膜上皮磨鑲術(LASEK)等。
根據上述方法得到的用于形成角膜上皮的細胞片，與以往的方法得到的產品相比，在剝離時的非侵襲性方面，極為優良，強烈期待其在移植用角膜等的臨床應用。特別是，本發明的用于形成角膜上皮的細胞片與以往的移植細胞片不同，具有與活體組織的高成活性，能極為迅速地在活體組織上成活。我們認為，這是可以提高患處的治療效率、進一步可以減輕患者負擔的極其有效的技術。另外，本發明的方法中所使用的細胞培養支持體可以重復使用。
實施例以下基于本發明的實施例進行進一步詳細說明，但這些實施例對本發明沒有任何限定。
實施例1在市售的6孔細胞培養板(ベクトン·デイツキンソン·ラブウエア(Becton Dickinson Labware)公司制、フアルコン(FALCON)3090)上，涂布0.08ml30％N-異丙基丙烯酰胺單體的異丙醇溶液。以0.25MGy強度照射電子束，將聚N-異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)固定在培養皿表面上。照射后，用離子交換水洗凈培養皿，除去殘余的單體和未與培養皿結合的PIPAAm，在凈化臺內干燥，用環氧乙烷氣體滅菌，得到細胞培養支持體材料。測量基材表面的溫度響應性聚合物的量，發現以1.3μg/cm2覆蓋。
在得到的細胞培養支持體材料上，根據常規方法培養正常兔角膜上皮細胞(使用培養基コル礻パツク(クラボウ(株)制)、37℃、5％CO2下)。其結果，角膜上皮細胞在細胞培養支持體材料上正常地附著、增殖。
培養7日后，所培養的細胞成為鋪滿狀態，在進一步培養7日的細胞上覆蓋載體，所述載體由切出1.5cm直徑圓形的直徑2.1cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘后將其冷卻進行低溫處理，將細胞培養支持體材料上的細胞連同覆蓋在其上的載體一起進行剝離。得到的細胞片收縮率在5％以下，其作為整張細胞片具有充分的強度。
按照常規方法將本實施例得到的角膜上皮細胞片移植給患角膜上皮組織部分缺損的角膜糜爛病的實驗兔。將角膜上皮細胞片在創傷部位附著15分鐘，之后用手術刀切除重疊在患處以外部分的細胞片。此時，并未進行細胞片與活體側的縫合。3周后，觀察患處，角膜上皮細胞片在眼球上良好地成活。
實施例2本實施例中，除使用35％N-異丙基丙烯酰胺單體的異丙醇溶液之外，使用與實施例1同樣的方法，將聚N-異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)固定在培養皿表面上。測量用這種方法形成的基材表面的溫度響應性聚合物的量，發現以1.5μg/cm2覆蓋。
本實施例中，也與實施例1一樣，角膜上皮細胞在細胞培養支持體材料上正常地附著、增殖，培養7日后所培養的細胞成為鋪滿狀態。在進一步培養7日的細胞上覆蓋載體，所述載體由切出1.5cm直徑圓形的直徑2.1cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘后將其冷卻進行低溫處理，將細胞培養支持體材料上的細胞連同覆蓋在其上的載體一起進行剝離。得到的細胞片是收縮率在5％以下的細胞片，其作為整張細胞片具有充分的強度。
按照常規方法將本實施例得到的角膜上皮細胞片移植給患角膜上皮組織部分缺損的角膜糜爛病的實驗兔。將角膜上皮細胞片在創傷部位附著15分鐘，之后用手術刀切除重疊在患處以外部分的細胞片。此時，并未進行細胞片與活體側的縫合，移植后，在患處裝上隱形眼鏡。3周后，觀察患處，角膜上皮細胞片在眼球上良好地成活。
實施例3在實施例1的細胞培養支持體上，除將培養基改成含有絲裂霉素C的常用的保綠培養基(green′smedia)(DMEM+AB(用于制造飼養層)、用于源自人新生兒的角化表皮細胞)之外，用同樣的方法培養正常兔角膜上皮細胞。其結果，細胞培養支持體材料上的角膜上皮細胞正常地附著、增殖。
培養6日后成為鋪滿狀態，進一步培養6天使其多層化。然后，覆蓋載體，所述載體由切出1.5cm直徑圓形的直徑2.1cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘后將其冷卻進行低溫處理，將細胞培養支持體材料上的細胞連同覆蓋在其上的載體一起進行剝離。被剝離的多層化細胞片是收縮率在5％以下的細胞片，其作為整張細胞片具有充分的強度。
按照常規方法將本實施例得到的角膜上皮細胞片移植給患角膜上皮組織部分缺損的角膜糜爛病的實驗兔。將角膜上皮細胞片在創傷部位附著15分鐘，之后，用激光切除重疊在患處以外的部分的細胞片。此時，并未進行細胞片與活體側的縫合。3周后，觀察患處，角膜上皮細胞片在眼球上良好地成活。
比較例1由實施例1制作角膜上皮細胞片，除不使用載體剝離細胞片，使其收縮之外，與實施例1同樣地制造角膜上皮細胞片。此時的收縮率為42％。
與實施例1同樣，按照常規方法將得到的角膜上皮細胞片移植給缺損角膜上皮組織部分的實驗兔。將角膜上皮細胞片向創傷部位附著15分鐘，之后，用手術刀切除重疊在患處以外的部位的的細胞片。此時，并未進行細胞片與活體側的縫合。移植一天后觀察患處，角膜上皮細胞片在眼球上的成活性差，快要從患處脫落。
比較例2由實施例3制造角膜上皮細胞多層化細胞片，除達到鋪滿后的28天之后從細胞培養支持體剝離之外，與實施例3同樣地制造角膜上皮細胞片。得到的細胞片收縮率在5％以下，其作為整張膜具有充分的強度。
然后，與實施例3同樣，按照常規方法將得到的角膜上皮細胞片移植給缺損角膜上皮組織部分的實驗兔。將角膜上皮細胞片在創傷部位附著15分鐘，之后，用手術刀切除重疊在患處以外的部分的細胞片。此時，并未進行細胞片與活體側的縫合。移植一天后觀察患處，角膜上皮細胞片在眼球上的成活性惡劣，快要從患處脫落。
實施例4在市售的φ3.5cm細胞培養用培養皿(ベクトン·デイツキンソン·ラブウエア(Becton Dickinson Labware)公司制、ファルコン(FALCON)3001)上，涂布0.1ml30％N-異丙基丙烯酰胺單體的異丙醇溶液。照射0.25MGy強度的電子束，將聚N-異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)固定在培養皿表面上。照射后，用離子交換水洗凈培養皿，除去殘余的單體和未與培養皿結合的PIPAAm，在凈化臺內干燥，用環氧乙烷氣體滅菌，得到細胞培養支持體材料。測量基材表面上的溫度響應性聚合物的量，發現以1.4μg/cm2覆蓋。
另一方面，在深度麻醉下，從常規方法制造的具有角結膜上皮癥的實驗白色家兔采取口腔粘膜組織，在上述得到的細胞培養支持體材料上，將該上皮細胞按照常規方法與3T3細胞(使用培養基コル礻パツク(クラボウ(株)制)、37℃、5％CO2下)一起進行培養。其結果，在細胞培養支持體材料上的任一上皮細胞都正常地附著、增殖。
培養6日后，所培養的細胞成為鋪滿狀態，在進一步培養7目的細胞上覆蓋載體，該載體由切出1.8cm直徑圓形的直徑2.3cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘后將其冷卻進行低溫處理，將細胞培養支持體材料上的細胞連同覆蓋在其上的載體一起進行剝離。得到的細胞片收縮率在5％以下，其作為整張細胞片具有充分的強度。
按照常規方法將本實施例得到的口腔粘膜細胞片移植給患角膜上皮組織部分缺損的角結膜上皮癥的實驗白色家兔。將口腔粘膜細胞片在創傷部位附著15分鐘，之后，用手術刀切除重疊在患處以外的部位的細胞片。此時，并未進行細胞片與活體側的縫合。3周后，觀察患處，角膜上皮細胞片在眼球上良好地成活。
實施例5本實施例中，除使用35％N-異丙基丙烯酰胺單體的異丙醇溶液之外，使用與實施例4同樣的方法，在培養皿表面上固定聚N-異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)。測量用這種方法形成的基材表面的溫度響應性聚合物的量，發現以1.5μg/cm2覆蓋。
本實施例中，也與實施例4同樣，口腔粘膜上皮細胞在細胞培養支持體材料上正常地附著、增殖。培養6日后，所培養的細胞成為鋪滿狀態。在進一步培養7目的細胞上覆蓋載體，該載體由切出1.8cm直徑圓形的直徑2.3cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘后使其冷卻進行低溫處理，將細胞培養支持體材料上的細胞連同覆蓋在其上的載體一起進行剝離。得到的細胞片收縮率在5％以下，其作為整張細胞片具有充分的強度。
按照常規方法將本實施例得到的口腔粘膜細胞片移植給患角膜上皮組織部分缺損的角結膜上皮癥的實驗白色家兔。將口腔粘膜細胞片在創傷部位附著15分鐘，之后，用手術刀切除重疊在患處以外的部分的細胞片。此時，并未進行細胞片與活體側的縫合，移植后，在患處裝上隱形眼鏡。3周后，觀察患處，口腔粘膜細胞片在眼球上良好地成活。
實施例6在實施例4的細胞培養支持體材料上，除了在深度麻醉下用常規方法從白色家兔皮膚的毛根組織采取上皮類干細胞作為細胞，并與3T3細胞一起培養之外，按照與實施例4同樣的方法實施。其結果，細胞培養支持體材料上的毛根細胞正常地附著、增殖。培養2周后，覆蓋載體，該載體由切出1.5cm直徑圓形的直徑2.1cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘后使其冷卻，從而將細胞培養支持體材料上的細胞片連同覆蓋在其上的載體一起進行剝離。被剝離的多層化細胞片收縮率在5％以下，其作為整張細胞片具有充分的強度。
按照常規方法將本實施例得到的細胞片移植給患角膜上皮組織部分缺損的角結膜上皮癥的實驗白色家兔。將毛根細胞片在創傷部位附著15分鐘，之后，用激光切除重疊在患處以外的部分的細胞片。此時，并未進行細胞片與活體側的縫合。3周后，觀察患處，細胞片在眼球上良好地成活。
實施例7在實施例4的細胞培養支持體材料上，除了在深度麻醉下用常規方法從白色家兔皮膚的結膜組織采取結膜上皮干細胞作為細胞，并與3T3細胞一起培養之外，按照與實施例4同樣的方法實施。其結果，在細胞培養支持體材料上的結膜上皮細胞正常地附著、增殖。培養2周后，覆蓋載體，該載體由切出1.5cm直徑圓形的直徑2.1cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜成型而成，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘后冷卻，將細胞培養支持體材料上的細胞連同覆蓋在其上的載體一起剝離。被剝離的多層化細胞片收縮率在3％以下，其作為整張細胞片具有充分的強度。
按照常規方法將本實施例得到的細胞片移植給患角膜上皮組織部分缺損的角結膜上皮癥的實驗白色家兔。將結膜上皮細胞片在創傷部位附著15分鐘，之后，用激光切除重疊在患處以外的部分的細胞片。此時，并未進行細胞片與活體側的縫合。3周后，觀察患處，結膜細胞多層化細胞片在眼球上良好地成活，同時也看不到來自結膜的血管侵入。
比較例3按照實施例4制造口腔粘膜細胞片，除不使用載體而剝離細胞片，使其收縮之外，與實施例4同樣地制造口腔粘膜細胞片。此時的收縮率為38％。
與實施例4同樣，按照常規方法將得到的口腔粘膜細胞片移植給缺損角膜上皮組織部分的兔子。將角膜上皮細胞片在創傷部位附著15分鐘，之后，用手術刀切除重疊在患處以外的部分的細胞片。此時，并未進行細胞片與活體側的縫合。移植一天后觀察患處，角膜上皮細胞片在眼球傷得成活性惡劣，快要從患處脫落。
根據以上結果可知，使用本技術，可能制作對前眼部組織的附著性良好的角膜上皮代替細胞片。這一事實可使治療簡便化、效率化，從而減輕患者的負擔，并且由于這些細胞片能充分覆蓋患處，并緊密地附著，因此還能顯著減輕患者本人的痛苦，可以認為是一種極其有效的技術。
實施例8按照與實施例3所示的方法完全相同的方法制造緊密貼合在載體上的角膜上皮細胞多層化細胞片。探討該細胞片在作為近視治療法而出名的準分子激光原位角膜磨鑲術(LASIK法)中能否成為角膜上皮瓣的替代品。
具體而言，首先對兔角膜用微型角膜刀以160μm的厚度切斷角膜實質層，制造角膜瓣，然后除去該角膜瓣，再用受激準分子激光器削去角膜實質層，平整表面，最后在本來應放回角膜瓣的部位附著實施例3中得到的緊密貼合在載體上的角膜上皮細胞多層化細胞片。用激光將角膜上皮細胞多層化細胞片切成與患處同樣的大小，完成移植。未進行縫合。3周后觀察患處，角膜上皮細胞多層化細胞片在眼球上良好地成活，認為本發明的角膜上皮細胞多層化細胞片對LASIK法也有效。
實施例9按照與實施例3所示的方法完全相同的方法制造緊密貼合在載體上的角膜上皮細胞多層化細胞片。探討該細胞片在作為近視治療法而出名的準分子激光角膜上皮磨鑲術(LASEK法)中能否成為角膜上皮瓣的替代品。
具體而言，首先對兔角膜用酒精滴眼使角膜表面軟化，不使用微型角膜刀而切除角膜上皮50μm厚制造角膜上皮瓣，然后除去該角膜上皮瓣，再用受激準分子激光器削去角膜實質層，平整表面，最后在本來應放回角膜上皮瓣的部位附著實施例3中得到的緊密貼合在載體上的角膜上皮細胞多層化細胞片。用激光將角膜上皮細胞多層化細胞片切斷成與患處同樣大小，完成移植。未進行縫合。3周后觀察患處，角膜上皮細胞多層化細胞片在眼球上良好地成活，認為本發明的角膜上皮細胞多層化細胞片對LASEK法也有效。
根據以上結果可知，使用本技術，能夠制作對前眼部組織附著性良好的再生角膜上皮細胞片、其多層化細胞片。這一事實就治療的簡便化、效率化，從而減輕患者的負擔這一點而言，可以認為是一種極其有效的技術。
產業上的利用可能性本發明得到的用于形成角膜上皮的細胞片對活體組織的成活性極高，即具有“高附著性”，強烈地期待其在例如角膜移植、角膜疾病治療、近視治療等的臨床應用。因而，本發明是在細胞工學、醫用工學等的醫學、生物學等領域極為有用的發明。
權利要求
1.用于形成角膜上皮的細胞片，其緊密貼合在載體上。
2.根據權利要求1記載的用于形成角膜上皮的細胞片，所述細胞片未經蛋白質分解酶處理而從支持體剝離，剝離后的細胞片的收縮率保持在20％或20％以下。
3.根據權利要求1或2記載的細胞片，其殘留有80％或80％以上基底膜類蛋白質。
4.根據權利要求1～3中任意一項記載的細胞片，其殘留有80％或80％以上橋粒結構。
5.根據權利要求1～4中任意一項記載的用于形成角膜上皮的細胞片，其用于治療前眼部組織的部分或全部損傷或缺損了的患處。
6.根據權利要求5記載的用于形成角膜上皮的細胞片，所述前眼部組織是角膜上皮組織、鮑曼氏膜、角膜實質組織。
7.根據權利要求1～6中任意一項記載的用于形成角膜上皮的細胞片，其剝離的時期是在細胞在支持體表面鋪滿后起21天以內。
8.根據權利要求1～7中任意一項記載的用于形成角膜上皮的細胞片，所述細胞片是再生角膜上皮細胞片或其多層化細胞片。
9.根據權利要求8記載的用于形成角膜上皮的細胞片，所述多層化細胞片是將角膜上皮細胞進行多層化培養得到的。
10.根據權利要求1～7中任意一項記載的用于形成角膜上皮的細胞片，所述細胞片是角膜上皮代替細胞片或其多層化細胞片。
11.根據權利要求10記載的用于形成角膜上皮的細胞片，所述角膜上皮代替細胞片由口腔粘膜細胞、毛根細胞、結膜上皮細胞中的任意一種或兩種以上的混合物，或者由它們與角膜上皮細胞的混合物組成。
12.根據權利要求10或11記載的用于形成角膜上皮的細胞片，所述多層化細胞片是將口腔粘膜細胞、毛根細胞、結膜上皮細胞中的任意一種或兩種以上的混合物，或者將它們與角膜上皮細胞的混合物多層化培養得到。
13.根據權利要求11或12記載的用于形成角膜上皮的細胞片，所述口腔粘膜細胞來自頰膜。
14.根據權利要求1～13中任意一項記載的用于形成角膜上皮的細胞片，其特征是，治療不是將用于形成角膜上皮的細胞片縫合在患處，而是將用于形成角膜上皮的細胞片覆蓋于患處。
15.根據權利要求1～14中任意一項記載的用于形成角膜上皮的細胞片，在覆蓋于患處上時，按照患處的大小、形狀被切斷。
16.用于形成角膜上皮的細胞片的制造方法，其特征是，在用0～80℃的溫度范圍內對于水的水合力變化的溫度響應性聚合物覆蓋基材表面而成的細胞培養支持體上培養用于形成角膜上皮的細胞，根據需要按照常規方法使培養細胞多層化，之后，(1)使培養液溫度在上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，(2)將所培養的用于形成角膜上皮的細胞緊密貼合于載體上，(3)將其連同載體一起剝離。
17.根據權利要求16記載的用于形成角膜上皮的細胞片的制造方法，所述用于形成角膜上皮的細胞片是再生角膜上皮細胞片、角膜上皮代替細胞片、或是它們中任意一個的多層化細胞片。
18.根據權利要求16或17記載的用于形成角膜上皮的細胞片的制造方法，其特征是，所述細胞培養支持體是利用膜的細胞培養小室。
19.根據權利要求16～18中任意一項記載的用于形成角膜上皮的細胞片的制造方法，所述溫度響應性聚合物是聚(N-異丙基丙烯酰胺)。
20.根據權利要求16～19中任意一項記載的用于形成角膜上皮的細胞片的制造方法，其特征是，所述載體的形狀是切除了中心部分的環狀。
21.根據權利要求16～20中任意一項記載的用于形成角膜上皮的細胞片的制造方法，所述剝離是未經蛋白質分解酶處理的。
22.一種治療方法，其特征是，對損傷或缺損前眼部組織的部分或全部的患處，移植權利要求1～15中任意一項記載的用于形成角膜上皮的細胞片。
23.根據權利要求22記載的治療方法，其特征是，所述移植是對患處不進行縫合地覆蓋。
24.根據權利要求23記載的治療方法，其特征是，覆蓋在患處時，按照患處的大小、形狀切斷用于形成角膜上皮的細胞片。
25.根據權利要求22～24中任意一項記載的治療方法，其特征是，治療對象是角膜糜爛、角膜潰瘍、或兩眼性的難治性角結膜病患者。
26.根據權利要求22～25中任意一項記載的治療方法，其特征是，所述治療通過利用PK法、PRK法、LASIK法、或LASEK法的屈光矯正進行。
全文摘要
本發明的課題是提供對前眼部組織附著性良好的用于形成角膜上皮的細胞片。針對于此，在特定的條件下，在用0～80℃的溫度范圍內水合力變化的溫度響應性聚合物覆蓋基材表面而成的細胞培養支持體上培養用于形成角膜上皮的細胞，根據需要使培養細胞多層化，之后，(1)使培養液溫度在上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，(2)將所培養的用于形成角膜上皮的細胞緊密貼合在載體上，(3)將其連同載體一起剝離，由此制造了用于形成角膜上皮的細胞片，從而解決了上述課題。
文檔編號C12N5/00GK1747753SQ200480003698
公開日2006年3月15日 申請日期2004年2月6日 優先權日2003年2月6日
發明者岡野光夫, 西田幸二, 大和雅之 申請人:賽爾斯德株式會社, 西田幸二