專利名稱：肽甲硫氨酸亞砜還原酶的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白酶的新用途，特別涉及肽甲硫氨酸亞砜還原酶的新用途。
背景技術：
蛋白質結構中某些氨基酸的氧化和還原是生物體內對蛋白功能的一種調控方式。甲硫氨酸(Met)被氧化則變為甲硫氨酸亞砜(Met(O))，它可導致所在蛋白質的生物學活性降低或喪失。
肽甲硫氨酸亞砜還原酶(Peptide methionine sulfoxide reductase，MsrA)是一種高度保守的蛋白酶，它能夠催化多肽鏈中或細胞中自由的甲硫氨酸亞砜還原成甲硫氨酸，從而修復氧化損傷的蛋白。同時MsrA可以作為體內的關鍵調節酶，通過蛋白中甲硫氨酸的氧化還原來調節蛋白的生理活性；還可以作為抗氧化酶，通過體內甲硫氨酸的氧化還原循環而清除活性氧。
蛋白錯誤折疊能夠導致阿爾茲海默氏癥、傳播性海綿狀腦病和肌萎縮性(脊髓)側索硬化等許多疾病。因此抑制蛋白錯誤折疊，阻止蛋白聚集與變性是防止這些蛋白錯誤折疊病的有效方法。
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，簡稱SOD)為氧自由基的天然清除劑，具有防止細胞過度氧化，延緩生命衰老的生理功能。SOD是一種金屬酶類，根據所含金屬輔基不同，分為Cu/Zn-SOD，Fe-SOD，Mn-SOD和Ni-SOD四類。
在肌萎縮性(脊髓)側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)患者體內發現大量人Cu/Zn-SOD突變體。目前認為這些突變蛋白在體內形成蛋白聚集而產生的毒性是導致肌萎縮性(脊髓)側索硬化的主要原因。
檸檬酸合成酶是三羧酸循環中的一個關鍵酶，但該蛋白熱穩定性極低。體外在43℃會很快變性聚集進而沉淀。其聚集過程可以用光散射的變化反映出來。
酵母Sup35蛋白是導致瘋牛病朊病毒的模型蛋白，這類蛋白在動物和人體內能夠導致Creutzfeldt-Jacob疾病、牛海綿狀腦病、羊搔癢病。Sup35蛋白很容易錯誤折疊而形成纖維，其纖維形成可以通過工熒光發射的變化來檢測。
發明創造內容本發明的目的是提供肽甲硫氨酸亞砜還原酶的新用途。
研究表明，甲硫氨酸亞砜還原酶具有防止蛋白質聚集、蛋白質變性以及蛋白質錯誤折疊的功能。
其中，在防止蛋白質變性中，所述變性可由物理因素和/或化學因素引起。所述物理因素包括熱，紫外線照射，高壓和表面張力等。所述化學因素包括有機溶劑，脲、胍，酸和堿等。
實驗證明，MsrA在體內能夠有效防止人Cu/Zn-SOD的聚集，因而阻止人Cu/Zn-SOD形成蛋白聚集、減少毒性產生，從而防止肌萎縮性(脊髓)側索硬化的發生；MsrA防止檸檬酸合成酶不被熱變性，減緩正常蛋白的熱變性過程，因而保護體內蛋白正常生理功能的發揮；MsrA具有很強的抑制酵母Sup35蛋白纖維形成的能力，表明MsrA在防止和治療人瘋牛病中具有應用前景。本發明為肽甲硫氨酸亞砜還原酶的進一步開發利用提供了更加廣闊的空間。


圖1為MsrA對人Cu/Zn-SOD聚集的抑制曲線圖2為不同濃度MsrA對人Cu/Zn-SOD聚集的抑制作用曲線圖3為MsrA對檸檬酸合成酶熱變性的抑制作用曲線圖4為不同濃度MsrA對檸檬酸合成酶熱變性的抑制作用柱狀5為MsrA對Sup35蛋白纖維形成的抑制作用柱狀圖具體實施方式
實施例1、體外表達和純化MsrA通過常規PCR方法從含有MsrA基因的質粒pQE30L/MsrA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1997，949585-9589)中擴增該基因。其中，所用的引物為上游引物為5’GTCGAATTCTCGTCGCTTATTTCAAAAACCA 3’(序列表中的序列1；帶下劃線部分的堿基為EcoRI酶切位點)，下游引物為5’GGCGTCGACTTA CTA CATTTCT CTCAGATAAT GAGTA 3’(序列表中序列2；帶下劃線部分的堿基為SalI酶切位點)。PCR體系為50μl，其中，質粒模板10ng，兩種引物濃度為50pmol，95℃變性5分鐘后加入2.5U Taq PlusDNA聚合酶，95℃變性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，30循環后于72延伸10分鐘。利用常規分子克隆方法，將得到的PCR擴增產物用EcoRI和SalI雙酶切后連接入pGEX-4T-1原核表達載體中，得到重組表達載體pGEX-4T-1/MsrA。將該重組表達載體通過CaCl2法轉化大腸桿菌BL21(DE3)。取單菌落在LB培養基內37℃培養12小時后，1∶100轉接至新鮮培養基放大培養，當菌液在600nm下OD值為0.6-0.8時，加IPTG至終濃度0.25mM誘導蛋白表達，繼續在25℃培養6-8小時，離心收集菌體，菌體用緩沖液A(10mM Tris-HCl，10mM β-巰基乙醇，pH7.4)重懸，并用超聲儀于冰上超聲裂解。裂解液于4℃下27,000×g離心20min，上清液以Glutathione Sepharose 4B柱純化。SDS-PAGE檢測純化的MsrA蛋白，結果表明得到純化的MsrA蛋白。蛋白濃度采用Edelhoch方法檢測(Biochemistry，1967，61948-1954)。
實施例2、MsrA體外防止人Cu/Zn-SOD的聚集在含有8-25％的TFE(Trifluroethanol)，25μM ThT(thioflavin T)，50mM Mes[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]的pH5.4的醋酸緩沖液中，同時加入終濃度為0.2mg/ml的人Cu/Zn-SOD和終濃度為0.1、0.25、0.5和1μM的MsrA，并設不加MsrA的對照，立即檢測人Cu/Zn-SOD蛋白的聚集。蛋白聚集采用ThT熒光激發發射光譜來檢測，激發波長為440，發射波長為482nm。結果如圖1和圖2所示，表明人Cu/Zn-SOD的聚集速度比對照減慢，在473nm處，加入0.5μM MsrA后，熒光強度只為對照的50％；且抑制效果隨著MsrA濃度的增加而增加，當MsrA達到0.5μM其抑制率進入平臺期。
實施例3、MsrA保護正常蛋白不被熱變性在40mM HEPES緩沖液中加入終濃度為0.15μM檸檬酸合成酶，于43℃加熱200秒內就開始發生聚集，以熒光儀FL4500(日立公司)檢測到光散射信號的增加，在20分鐘內增加達到13倍。熒光儀檢測參數為激發光波長500nm，發射光波長500nm。狹縫寬度2.5nm。
在40mM HEPES緩沖液中，同時加入終濃度為0.15μM檸檬酸合成酶和0、0.1、0.25和0.5μM MsrA后，以熒光儀FL4500(日立公司)檢測光散射信號。結果如圖3和圖4所示，表明熱變性聚集明顯變少；在反應20分鐘時，蛋白聚集抑制率達35％；且抑制效果隨著MsrA濃度的增加而增加，在反應至20分鐘時，當MsrA濃度增加至0.25μM時抑制率增加至51.9％，當MsrA濃度增加至0.5μM時抑制率增加到74.4％。
實施例4、MsrA防止蛋白質形成纖維，于體外防止蛋白質的錯誤折疊酵母Sup35蛋白是導致人瘋牛病朊病毒的模型蛋白。將含有10μM Sup35蛋白和0、0.25、5μM MsrA的磷酸緩沖液(5mMKH2PO4，150mM NaCl，pH7.4)與等體積的25μM ThT(溶于50mM甘氨酸緩沖液，pH8.0)，在25℃下孵育120小時后，以日立FL-4500型熒光儀檢測熒光光譜信號，激發波長442nm，發射波長485nm。所得結果減去緩沖液中ThT和不同濃度的MsrA背景信號。結果如圖5所示，表明加入5μM MsrA體系的蛋白熒光相對強度較對照減少了63.8％。表明MsrA具有很強的抑制蛋白纖維形成的能力。
序列表<160>2<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gtcgaattct cgtcgcttat ttcaaaaacc a 31<210>2<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ggcgtcgact tactacattt ctctcagata atgagta 3權利要求
1.肽甲硫氨酸亞砜還原酶在防止蛋白質聚集中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述蛋白質為Cu/Zn-SOD及其突變體。
3.肽甲硫氨酸亞砜還原酶在防止蛋白質變性中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述蛋白質為檸檬酸合成酶。
5.根據權利要求3或4所述的應用，其特征在于所述變性由物理因素和/或化學因素引起。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述物理因素包括熱，紫外線照射，高壓和表面張力。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述化學因素包括有機溶劑，脲、胍，酸和堿。
8.肽甲硫氨酸亞砜還原酶在防止蛋白質錯誤折疊中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述蛋白質為酵母Sup35蛋白。
全文摘要
本發明公開了肽甲硫氨酸亞砜還原酶的新用途。本發明的研究表明，肽甲硫氨酸亞砜還原酶具有防止蛋白質聚集、蛋白質變性以及蛋白質錯誤折疊的功能，為肽甲硫氨酸亞砜還原酶的進一步開發利用提供了更加廣闊的空間。
文檔編號C12N9/02GK1587397SQ20041005853
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月18日 優先權日2004年8月18日
發明者王義華, 羅永章 申請人:清華大學