專利名稱：改善弱精癥患者精子質量的藥物及其制法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療疾病的藥物，特別是用于改善弱精癥患者精子質量的藥物。
背景技術：
刺五加系五加科五加屬植物Acanthopanax Senticosus(Rupr.EtMaxim)Harms的干燥根及根莖，為我國北方地區特產藥材之一，是我國藥典收載的常用中藥，臨床上主要用于鎮靜安神，益氣健脾，補腎。已知的化學成分類型有苷類(刺五加苷A、B、C、D、E、F、G、I、L、K、M)、糖類(葡萄糖、蔗糖、堿性多糖、水溶性多糖、吡喃型乙醛多糖等)、油酸甲酯、乙酯、十八酸二烯甲酯、肉豆蔻酸、棕櫚酸、十八碳二烯酸、十六碳三烯酸、維生素C、E、胡籮卜素、芝麻素、丙三醇、白樺脂酸和苦杏仁苷等。弱精子癥是男性不育癥的常見原因，近年來生殖醫學領域采用的人工受精、試管嬰兒等技術為不育癥的治療開辟了新的途徑。然而，在體外獲得質量優良的精子是提高人工授精或體外授精成功率的關鍵之一，在體外處理精子后進行人工授精是治療某些男性不育癥常用而有效的方法。改善弱精癥患者精子質量成為治療男性不育癥的重要課題。近年來國內外對這一問題作了許多研究，包括體外應用不同物理方法進行優質精子的分離及篩選，應用不同化學藥物如咖啡因、茶堿、松弛素、前列腺素E等體外提高精子活力指標的研究[參見王藹為，章靜波.體外應用化學藥物改善精子質量的研究進展.國外醫學計劃生育分冊.1989，11(4)206-210]。然而，這些方法都不盡理想，效果不顯著，往往不能達到預期目的。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于改善弱精子(如弱精癥患者的精子)質量的藥物，使其具有能明顯提高精子活率、精子運動速度和前向運動精子百分率，有效改善男性弱精癥患者的精子質量等特點。
本發明的另一個目的是提供一種在體外改善弱精質量的方法。
本發明提供的改善弱精子質量的藥物是刺五加的水提取物或/和正丁醇提取物，其制備方法是(a)取刺五加藥材用水煎煮三次，每次各煎煮1-1.5h，合并三次所得濾液，濃縮至藥材∶水＝2.5-3∶1；(b)在上述濃縮液中加95％的乙醇至含醇量70％，抽濾，保留濾液，減壓回收，得醇浸膏，加水至藥材∶水＝2.5-3∶1使成溶液；(c)分別用飽和正丁醇和水對上述溶液進行萃取，分別收集飽和正丁醇層、水層，減壓回收，得刺五加的正丁醇提取物(其含藥量20g/ml)和水提取物(其含藥量為13.5g/ml)。
本發明提供的改善弱精子質量的藥物還包括刺五加注射液。
刺五加注射液(20ml/支，含總黃酮100mg/支)體外對精子活力有促進作用，其有效濃度范圍為稀釋5-200倍(即含總黃酮20mg/支~0.5mg/支，以下類推)；優選濃度范圍為稀釋10-40倍；最優選濃度為稀釋20倍。
本發明提供的體外改善弱精子質量的方法之一是先將刺五加水提取物(每毫升含原生藥量13.5g)或/和正丁醇提取物(每毫升含原生藥量20g)用優選液(BALANCED SALTSOLUTION，SIGMA CHEMICAL CD.提供)將其濃度稀釋100倍，將弱精子精液優選后[方法參見王學本，李科茂，麥庭福.簡易上游法優選精子治療少、弱精子癥的臨床應用.中國男科學雜志，1998，12(4)224]取一定量，與等體積的稀釋后的刺五加水提取物，或與等體積的稀釋后的刺五加正丁醇提取物，或與等體積的稀釋后的刺五加水提取物與稀釋后的正丁醇提取物的混合液共同置于37℃恒溫水浴箱培養，孵育0.5-2小時。
本發明提供的另一種體外改善弱精子質量的方法是取刺五加注射液(20ml/支)，用優選液(BALANCED SALT SOLUTION，SIGMA CHEMICAL CD.提供)將其濃度再稀釋200倍，調PH＝7.5，滲透壓為290mOsm/kg；將弱精子精液優選后[方法參見王學本，李科茂，麥庭福.簡易上游法優選精子治療少、弱精子癥的臨床應用.中國男科學雜志，1998，12(4)224]取一定量與等體積上述經稀釋調節后的刺五加注射液共同置于37℃恒溫水浴箱培養，孵育0.5-2小時。
采用精液計算機自動分析儀(CASA)觀察本發明藥物及方法對精子活力、速度等指標的影響。結果發現刺五加水提液能明顯提高精子活率、精子運動速度和前向運動精子百分率等。
實驗資料一、確定刺五加的水溶性成分改善弱精子質量的有效部位方法采用植化的方法，從中藥刺五加中提取和分離有效部位，分別為水層提取物，飽和正丁醇層和飽和乙酸乙酯層提取物，用優選液(BALANCED SALT SOLUTION，SIGMACHEMICAL CD.提供)將其濃度稀釋100倍，然后將弱精子患者精液優選后分別與等體積不同提取部位溶液共孵育，并采用計算機輔助的精液分析系統(CASA)測定不同部位提取物在0h，0.5h，2h對人精子各運動參數的變化，測定的運動參數有精子活率(MOT)、A級精子百分率、B級精子百分率、曲線運動速度(VCL)、直線運動速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)等。
結果水層提取物和正丁醇層提取物對MOT、A級精子百分率+B級精子百分率、VCL、VSL在0.5h、2h與對照組比較差異有顯著性意義(p＜0.05)。
結論水層提取物和正丁醇層提取物為刺五加改善男性弱精癥患者精子質量的有效部位。
具體實驗如下一、材料和方法(一)提取分離1.藥品及試劑刺五加為湖北省醫藥公司提供的正品刺五加。
95％乙醇、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純。
蒸餾水，由華中科技大學同濟醫學院購買。
2.實驗儀器旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器生產廠生產。
電熱恒溫水浴鍋，琴臺醫療儀器廠生產。
3.實驗步驟取刺五加藥材1Kg，水煎煮三次，每次各煎煮1.5h，合并三次所得濾液，濃縮至藥材∶水＝2.5∶1。用95％的乙醇對濃縮液進行醇沉(含醇70％)，抽濾，保留濾液，減壓回收。分別用飽和乙酸乙酯、正丁醇溶液對溶液進行少量多次萃取，分別收集飽和乙酸乙酯層、飽和正丁醇層、水層。于旋轉蒸發儀上蒸發回收，待有機溶劑和水完全揮干，得浸膏。(見表1)。
表1重量(g) 得膏率(％)總提物浸膏 24.5 2.45乙酸乙酯層 2.5 0.25正丁醇層6.5 0.65水 層 15.5 1.55將三個部位的提取物浸膏用蒸餾水稀釋，以每毫升含多少克生藥作為濃度標準。乙酸乙酯層10g/ml 正丁醇層20g/ml 水層13.5g/ml(二)CASA分析1.藥品與試劑提取分離出的各部位溶液優選液(BALANCED SALT SOLUTION，SIGMA CHEMICAL CD.)精液標本 由就診病人提供。
2.實驗儀器恒溫水浴箱CASA(CH30型，日本OLYMPUS公司)各種規格的微量取液器實驗步驟1)優選精液[方法參見王學本，李科茂，麥庭福.簡易上游法優選精子治療少、弱精子癥的臨床應用.中國男科學雜志，1998，12(4)224]a.根據所需處理的精液量取1至數支5ml醫用注射器；b.抽入空氣2ml后再抽入優選液2ml，最后緩慢抽入精液1ml，避免震動，從而使精液與優選液分界清楚；c.將注射器針頭護嘴套上，置于37℃水浴箱內的支架上，注射器按其內部的優選液和精液所呈現的交界面積最大的角度置放(一般30-40°)；d.孵化40分鐘后將注射器緩慢直立，再垂直孵化10分鐘；e.推棄優選液下方的精液，收集優選液(此時液中已富含優選出的精子)于400×g條件下離心6分鐘；f.吸棄離心管中的上清夜，再用新鮮的優選液吹散精子團塊。
2)精液分析a.配制藥品 取三支干燥潔凈的試管，分別加入三個提取部位的溶液0.1ml，然后向試管中加入優選液至5ml，依次編號為1，2，3。
b.取4個小離心管，依次編為1，2，3，4。1，2，3組為藥品組，4組為對照組。
藥品組分別加入與之對應的藥品各0.1ml，對照組分別加入0.1ml的優選液，然后將它們放入37℃的水浴箱中保溫。
c.將優化過的精液依次加入各個離心管中，加液量為0.1ml，與藥品共同孵育，分別在0h、0.5h、2h取樣分析，測定精子各運動參數的變化。測定的運動參數有精子活率(MOT)、A級精子百分率、B級精子百分率、曲線運動速度(VCL)、直線運動速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)等。
(三)統計學方法應用SAS軟件對數據進行方差分析。
(四)結果刺五加不同提取部位不同時間體外對精子運動參數的影響結果見表2。
表2刺五加不同部位不同時間體外對精子運動參數的影響(X±SD)
時 例組別 精子活率(MOT) 前向運動百分率 直線速度 曲線速度時 數 (A+B)VSL VCL0 14水層 66.261±6.280 34.295±9.26511.247±2.413 16.777±3.939飽和正丁醇67.318±7.798 30.832±7.5909.551±1.736 14.740±2.529層飽和乙酸乙61.054±11.022 27.037±7.4489.589±1.662 13.937±1.935酯層對照組63.914±4.868 29.513±5.4639.183±1.590 14.380±2.8970.5 14水層 74.998±6.322*37.413±7.558*10.694±1.986 16.993±3.32*飽和正丁醇65.001±9.386 36.574±10.283*12.643±2.57*17.906±4.27*層飽和乙酸乙62.353±7.354 30.678±10.200 11.609±1.995 17.143±3.95*酯層對照組67.536±7.337 25.847±7.9939.813±1.843 14.144±2.9332 14水層 64.809±9.472*31.597±10.846*10.896±3.08*16.226±5.44*飽和正丁醇62.130±11.51*31.074±11.664*11.200±3.77*17.039±6.13*層飽和乙酸乙54.866±13.833 27.954±8.7988.324±2.646 12.121±4.351酯層對照組51.061±11.203 17.549±7.7706.812±1.941 9.653±2.591“*”表示與對照組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)由表2可以看出，水層提取物和飽和正丁醇層提取物組與精子在經過0.5小時的孵育后，測定其中精子的運動參數，其結果與對照組相比，差異均有顯著性意義；飽和乙酸乙酯層提取物組與對照組相比，無統計學意義。在經過2小時的孵育后，水層提取物和飽和正丁醇層提取物組中的精子的各運動參數與對照組相比差異均有顯著性意義；飽和乙酸乙酯層組與對照組相比，無統計學意義。
本發明實驗表明，刺五加的水提液能明顯提高精子活率、精子運動速度等。在本實驗中，我們對刺五加的水提取液進行進一步的研究，用不同極性的有機溶劑進行萃取，分為三個部分，并收集了14例病人精液，按照WHO推薦的實驗方法及標準進行實驗[參見王藹為，章靜波.體外應用化學藥物改善精子質量的研究進展.國外醫學計劃生育分冊.1989，11(4)206-210][陳振文，張先華，賈孟春，等.WHO人類精液及精子----宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊，第三版.北京科學出版社，199430]，對得到的數據進行統計分析，得到水提取部分和正丁醇提取部分，與對照組相比差異有顯著性意義，水層提取物和正丁醇層提取物為刺五加改善男性弱精癥患者精子質量的有效部位。
二、刺五加注射液體外對人精子運動參數的影響方法將正常生育男性精子(I組)和弱精子及少精子癥(II)組分別與刺五加注射液共孵育，并采計算機輔助的精液分析系統測定添加刺五加注射液后人精子各運動參數的變化。
結果刺五加注射液能顯著提高I組和II組(II組較明顯)精子的運動參數，包括A級精子運動百分率、精子曲線速度(VCL)、直線運動速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)和精子頭擺幅度(ALH)，經t檢驗，差異具有顯著意義和極顯著意義(p＜0.05或p＜0.01)。
結論中藥刺五加注射液體外能明顯改善人精子的運動參數。
具體實驗如下材料與方法1.1人精液正常生育精子(I)組健康成年生育男性，年齡25～35歲，禁欲3～5天，手淫法收集標本，按WHO標準[1]選取正常精液25份；弱精子及少精子癥(II)組來自1999年9月至2000年6月在本院就診的成人男性者，年齡22～38歲，禁欲3～5天，手淫法收集標本，按WHO推薦的實驗方法及標準[1]選取弱精子癥及少精子癥36份。
1.2藥材刺五加注射液(黑龍江完達山制藥廠)。
1.3主要實驗儀器和試劑計算機輔助的精液分析系統(Computer-aided sperm analysis，CASA)；37。C恒溫水浴箱(BS60型，北京市醫療設備廠產)；Ham’s F10溶液(Sigma公司)。
1.4實驗方法1.4.1刺五加溶液配制將刺五加注射液(20mL/支)用Ham’sF10稀釋200倍，調PH＝7.5，滲透壓為290mOsm/kg。
1.4.2精液優選按文獻[2]方法將精液進行精子優選。
1.4.3步驟將等體積配制后刺五加溶液加入優選后精液，同時以優選后精液空白對照，置于37。C恒溫水浴箱孵育，溫度調至37℃，分別于孵育0、1、3h用CASA進行分析。
1.5統計學處理；以上測定數據均按配對t檢驗處理。
結果刺五加注射液對精子活率(Mot)、精子活力A級百分率、精子活力B級百分率、精子曲線速度(VCL)、精子直線速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)及精子頭擺幅度(ALH)有提高作用，刺五加對以上各指標的提高作用在II組更明顯。在I組，統計學處理顯示，精子活力A級在3h，精子曲線速度(VCL)、直線速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)及精子頭擺幅度(ALH)在0h與對照組比較有顯著性差異；而在II組，各運動參數指標在0h、1h與對照組比較都有顯著性差異或極顯著性差異。
刺五加注射液(稀釋20倍)，咖啡因(7mM)和茶堿(20mM)體外對精子運動功能影響的比較刺五加對精子運動各參數均有促進作用；而茶堿僅對精子直線運動速度有促進作用，但效果劣于刺五加注射液；咖啡因對精子運動功能各參數均無作用，其統計學無顯著性差異。
體外應用黃芪和刺五加注射液提高人精子運動參數的比較中草藥黃芪對精子質量的影響已有報道[見江峰，王益鑫，盛新福。體外添加黃芪對精子質量影響。男性學雜志，1998，12(2)74]，而刺五加注射液在體外對精子運動尚未見報道。
方法將正常生育男性精子(I組)和弱精子及少精子癥(II組)分別與黃芪注射液和刺五加注射液共培養并采用CASA觀察人精子各運動參數。結果黃芪和刺五加注射液均能提高各組精子運動參數，與對照組比較有顯著性差異或極顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。黃芪注射液的作用在II組較明顯，刺五加注射液的作用在I組較明顯。黃芪注射液組與刺五加注射液組間兩兩比較無統計學差異(P＞0.05)。結論黃芪注射液和刺五加注射液都提高人精子的運動能力，二者對人精子運動的促進作用無顯著差別。
具體實施例方式
1.制備本發明改善弱精子質量藥物刺五加的水提取物和正丁醇提取物(1)取刺五加藥材1Kg，水煎煮三次，每次各煎煮1.5小時，合并三次所得濾液，濃縮至藥材∶水＝2.5-3∶1，(2)用95％的乙醇對濃縮液進行醇沉(含醇70％)，抽濾，保留濾液，減壓回收，得醇浸膏，加蒸餾水稀釋至藥材∶水＝2.5-3∶1，得溶液；(3)分別用飽和正丁醇和水對上述溶液進行少量多次萃取，分別收集飽和正丁醇層和水層，減壓回收，得刺五加的正丁醇提取物和水提取物。刺五加的正丁醇提取物每毫升含原生藥量為20g/ml，刺五加水提取物每毫升含原生藥量為13.5g/ml。
2.應用本發明藥物在體外改善弱精子的精子質量將本發明所得刺五加水提取物用蒸餾水稀釋，使水層提取物的濃度為13.5g/ml(每毫升含原生藥量)，用優選液(BALANCED SALT SOLUTION，SIGMA CHEMICAL CD.提供)將其濃度再稀釋100倍，將弱精子患者精液優選后[方法參見王學本，李科茂，麥庭福.簡易上游法優選精子治療少、弱精子癥的臨床應用。中國男科學雜志，1998，12(4)224]，取一定量與等體積的上述水提取液共同置于37℃恒溫水浴箱培養，孵育0.5-2h，即可使弱精子的精子質量得到改善。
權利要求
1.一種用于改善弱精子質量的藥物，其特征在于它是刺五加的水提取物或/和正丁醇提取物。
2.一種用于改善弱精子質量的藥物，其特征在于它是按以下方法制備的刺五加水提取物或/和正丁醇提取物(a)取刺五加藥材用水煎煮三次，每次各煎煮1-1.5小時，合并三次所得濾液，濃縮至藥材∶水＝2.5-3∶1；(b)在上述濃縮液中加95％的乙醇至含醇量70％，抽濾，保留濾液，減壓回收，得醇浸膏，加水至藥材∶水＝2.5-3∶1使成溶液；(c)分別用飽和正丁醇和水對上述溶液進行萃取，分別收集飽和正丁醇層、水層，減壓回收，得刺五加的正丁醇提取物和水提取物。
3.刺五加在制備用于改善弱精子質量藥物中的應用。
4.刺五加正丁醇提取物或/和水提取物在制備用于改善弱精子質量藥物中的應用。
5.刺五加正丁醇提取物或/和水提取物用于改善精子質量。
6.刺五加注射液用于改善精子質量。
7.刺五加注射液在制備用于改善弱精子質量藥物中的應用。
8.一種體外改善弱精子質量的方法，包括以下步驟(1)取刺五加注射液，用優選液將其濃度再稀釋200倍，調PH＝7.5，滲透壓為290mOsm/kg；(2)將弱精子精液優選后取一定量與等體積上述經稀釋調節后的刺五加注射液共同置于37℃恒溫水浴箱培養，孵育0.5-2小時。
9.權利要求1所述用于改善弱精子質量藥物的制備方法是(a)取刺五加藥材用水煎煮三次，每次各煎煮1-1.5小時，合并三次所得濾液，濃縮至藥材∶水＝2.5-3∶1；(b)在上述濃縮液中加95％的乙醇至含醇量70％，抽濾，保留濾液，減壓回收，得醇浸膏，加水至藥材∶水＝2.5-3∶1使成溶液；(c)分別用飽和正丁醇和水對上述溶液進行萃取，分別收集飽和正丁醇層、水層，減壓回收，得刺五加的正丁醇提取物和水提取物。
10.一種體外改善弱精子質量的方法，其特征是先將刺五加水提取物或/和正丁醇提取物用優選液將其濃度稀釋100倍，將弱精子精液優選后取一定量，與等體積的稀釋后的刺五加水提取物，或與等體積的稀釋后的刺五加正丁醇提取物，或與等體積的稀釋后的刺五加水提取物與稀釋后的正丁醇提取物的混合液共同置于37℃恒溫水浴箱培養，孵育0.5-2小時。
全文摘要
本發明提供了一種用于改善弱精子質量的藥物，為刺五加的水提取物或/和正丁醇提取物及其制備方法，以及在體外改善弱精子質量的方法，包括刺五加注射液在改善弱精子質量中的應用。本發明藥物和方法，能明顯提高精子活率、精子運動速度和前向運動精子百分率，有效改善男性弱精癥患者的精子質量等特點。
文檔編號C12N5/08GK1565514SQ0312821
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月25日 優先權日2003年6月25日
發明者劉繼紅, 尹春萍, 梁培育, 葉章群, 李浩勇, 鄧榮進 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院