專利名稱：一株生產丙酮酸的代謝工程酵母菌的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說是涉及一株生產丙酮酸的代謝工程菌光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672，CGMCC N0.0879和利用該菌發酵生產丙酮酸的方法。
背景技術：
丙酮酸是有重要應用價值的一種有機酸，具有保健生理功能(Pyruvicacid’s health function.Soft Drinks International，1998(5)24.)，并且是合成L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多巴等產品的原料。丙酮酸可通過微生物發酵葡萄糖得到(Wang Q，He P，Lu D，Shen A，Jiang NLet.Appl. Microbiol.，2002，35338-342；Qiang Hua，Chen Yang，kazuyuki ShimizuJ.Biosci.Bioeng..1999，87(2)206-213；A.Yokota，H.Shimizu，Y.Terasawa et alAppl.Microbiol.Biotech..1994，41638-643；Mitsuaki MoriguchiAgric.Biol.Chem..1982，46(4)955-961；M.Moriguchi，K.Shuto，T.HashimotoJ.Ferment.Technol..1984，62(3)243-248；S.Takao，M.TanidaJ.Ferment.Technol..1982，60(4)277-280；Carsten Schinschel，Helmut SimonJ.Biotech..1993，31191-203)，目前發酵水平最高的菌種是光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)IFO0005(大阪發酵研究所Institute for Fermentation，Osaka)，曾報道用該菌種在補料流加發酵的情況下，生產強度為1.08g/L.h(Reiko Miyata，Tetsu YoneharaJ.Ferment.Bioeng..1996，82(5)475-479)。我國也用光滑球擬酵母發酵得到類似的結果(Li Y，Chen J，Lun SY，Rui XYAppl.Microbiol.Biotechnol.，2001，55680-685)。

發明內容
由于丙酮酸是生物體糖代謝的中間代謝物，丙酮酸經丙酮酸脫羧酶催化生成乙醛，再還原得到乙醇，因此，丙酮酸脫羧酶的存在使乙醇作為副產物的產生降低了丙酮酸的產量。為了克服以上現有技術上存在的缺欠，我們從光滑球擬酵母IFO0005出發用代謝工程的方法敲除了它的丙酮酸脫羧酶基因，得到一株生產丙酮酸的代謝工程菌光滑球擬酵母3672，使丙酮酸脫羧酶活性降低了70％，阻斷消耗丙酮酸生成乙醇的代謝途徑，該菌株發酵時減少了副產物乙醇的生成，從而提高了丙酮酸的產量，使其產酸水平的生產強度比光滑球擬酵母IFO0005出發菌提高了一倍，為此，本發明的目的在于提供一株敲除了丙酮酸脫羧酶基因，比現有生產菌種更優越的丙酮酸生產菌光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672，該菌種可以在丙酮酸的生產中應用。在2003年01月15日已將光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672保藏在北京、中關村、100080，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊的編號為CGMCC N0.0879。另外，本發明還提供了該菌生產丙酮酸的種子培養基，其成分為10％葡萄糖，3％魚蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，和4％CaCO3，pH5.5，也可以添加4mg/L煙酸，200μg/L維生素B6和2μg/L的生物素；發酵培養基，其成分為10％葡萄糖，0.1％大豆蛋白胨，0.6％(NH4)2SO4，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O和4％CaCO3，pH5.5，其中0.1％大豆蛋白胨，可以用3％魚蛋白胨代替，還可以添加8mg/L煙酸，1mg/L維生素B6，30μg/L生物素，30μg/L維生素B1于發酵培養基中。
具體實施例方式
以下是列舉的實施例，以便更好地理解本發明。
實施例一光滑球擬酵母3672 CGMCC N0.0879和光滑球擬酵母IFO0005分別接種于成分為1％酵母提取物，2％蛋白胨，10％葡萄糖pH5.5的培養基中，在250ml三角瓶中于30℃、220轉/分的搖床培養16小時后，分別離心收獲細胞，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)洗2次，重新懸浮在該緩沖液中，加入玻璃珠，在4℃下劇烈振蕩10分鐘，15,000×g離心30分鐘，分別測定上清液的丙酮酸脫羧酶酶活。光滑球擬酵母3672 CGMCCN0.0879的丙酮酸脫羧酶酶活為0.49U/ml，光滑球擬酵母IFO005的丙酮酸脫羧酶酶活為1.72U/ml。
實施例二光滑球擬酵母3672 CGMCC N0.0879和光滑球擬酵母IFO005分別接種于種子培養基，其成分為10％葡萄糖，3％魚蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，和4％CaCO3，pH5.5的培養基中，在250ml三角瓶中于30℃、220轉/分的搖床培養24小時。以10％的接種量分別轉接到發酵培養基，其成分為10％葡萄糖，0.1％大豆蛋白胨，0.6％(NH4)2SO4，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O和4％CaCO3，pH5.5的培養基中，在250ml三角瓶中于30℃、220轉/分的搖床培養32小時，分別測定兩株菌發酵液的丙酮酸和乙醇含量。光滑球擬酵母3672 CGMCC N0.0879為丙酮酸20.2g/L，乙醇4.6g/L；光滑球擬酵母IFO005為丙酮酸7.3g/L，乙醇7.4g/L。
實施例三光滑球擬酵母3672 CGMCC N0.0879和光滑球擬酵母IFO005分別接種于種子培養基，其成分為10％葡萄糖，3％魚蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，4mg/L煙酸，200μg/L維生素B6，2μg/L生物素和4％CaCO3，pH5.5的培養基中，在250ml三角瓶中于30℃、220轉/分的搖床培養24小時。然后，以10％的接種量分別轉接到發酵培養基，其成分為10％葡萄糖，3％魚蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，8mg/L煙酸，1mg/L維生素B6，30μg/L生物素，30μg/L維生素B1和4％CaCO3，pH5.5的培養基中，在250ml三角瓶中于30℃、220轉/分的搖床培養48小時，分別測定兩株菌發酵液的丙酮酸含量。光滑球擬酵母3672 CGMCCN0.0879為50.2g/L；光滑球擬酵母IFO005為24.5g/L。
實施例四光滑球擬酵母3672 CGMCC N0.0879接種于種子培養基，其成分為10％葡萄糖，3％蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，4mg/L煙酸，200μg/L維生素B6，2μg/L生物素和4％CaCO3，pH5.5，在500ml三角瓶中于30℃、220轉/分的搖床培養24小時。然后，以10％的接種量分別轉接到5000ml自控發酵罐，其培養基成分為15％葡萄糖，3％蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，8mg/L煙酸，1mg/L維生素B6，30μg/L生物素，30μg/L維生素B1和4％CaCO3，pH5.5。在30℃、700轉/分、通氣量2升/分培養36小時，測定菌發酵液的丙酮酸含量為46.9g/L，生產強度為1.30g/L.h。
權利要求
1.一株敲除丙酮酸脫羧酶基因的生產丙酮酸的酵母菌光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672 CGMCC NO.0879。
2.根據權利要求1所述的菌，其培養基的組成分為葡萄糖、蛋白胨、無機鹽，并添加煙酸、維生素B1、B6和生物素，pH5.5
3.根據權利要求1所述的菌在丙酮酸生產中的應用。
4.根據權利要求2的所述培養基的組成分在光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)3672 CGMCC NO.0879丙酮酸的生產中的應用。
全文摘要
丙酮酸是有重要應用價值的一種有機酸。用代謝工程的方法構建一株生產丙酮酸的光滑球擬酵母菌，敲除了丙酮酸脫羧酶基因，使丙酮酸脫羧酶活性降低了70％，阻斷消耗丙酮酸生成乙醇的代謝途徑，減少了乙醇的生成而增加了丙酮酸的積累。是一株比原生產菌種更優越的丙酮酸生產菌。
文檔編號C12P7/40GK1536070SQ0310921
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月3日 優先權日2003年4月3日
發明者江寧, 王欽宏, 沈安, 賀鵬, 盧大軍, 江 寧 申請人:中國科學院微生物研究所