專利名稱：人睪丸原腸形成蛋白基因編碼蛋白的制作方法
技術領域：
本發明屬于人類基因組技術領域。
本發明所述人睪丸原腸形成蛋白基因是發明人在南京醫科大學生殖醫學江蘇省重點實驗室用基因芯片方法篩選獲得，首先制備人睪丸功能基因表達芯片，通過比較胚胎和成年人睪丸功能基因的表達，獲得差異表達克隆，經序列測定證明為全長cDNA，為1949bp；其開放閱讀框架為672bp，其編碼224個氨基酸。查閱基因庫，該基因與小鼠和爪蟾的原腸形成蛋白基因同源，該基因表達蛋白的主要功能是激活骨形成蛋白。由于該基因是成人睪丸高表達，而胚胎與成人睪丸的主要差別是后者有精于發生，同時，本實驗室用原位雜交方法顯示，該基因在精原細胞低表達，而在精母細胞以后的生精細胞高表達，提示該基因可能是精子發生的啟動因子。用該基因克隆可制備成融合蛋白，用該蛋白免疫家兔，可獲得單克隆和多克隆抗體，該基因也可用于制備睪丸功能基因表達芯片。
由于人睪丸原腸形成蛋白基因在Genbank數據庫中尚無人的同源基因，本發明人對于該基因的結構和功能研究成果全都是開創性的。美國國家生物技術情報中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)已正式接受該基因為Genbank的新成員，接受號為AF294628。
1 tctttgaaga aacatgaagt tacactatgt tgctgtgctt actctagcca tcctgatgtt61 cctgacatgg cttccagaat cactgagctg taacaaagca ctctgtgcta gtgatgtgag121 caaatgcctc attcaggagc tctgccagtg ccggccggga gaaggcaatt gctcctgctg181 taaggagtgc atgctgtgtc ttggggccct ttgggacgag tgctgtgact gtgttggtat241 gtgtaatcct cgaaattata gtgacacacc tccaacttca aagagcacag tggaggagct301 gcatgaaccg attccttctc tcttccgggc actcacagaa ggagatactc agttgaattg361 gaacatcgtt tctttccctg ttgcagaaga actttcacat catgagaatc tggtttcatt421 tttagaaact gtgaaccagc cacaccacca gaatgtgtct gtccccagca ataatgttca481 cgcgccttat tccagtgaca aagaacacat gtgtactgtg gtttattttg atgactgcat541 gtccatacat cagtgtaaaa tatcctgtga gtccatggga gcatccaaat atcgctggtt601 tcataatgcc tgctgcgagt gcattggtcc agaatgtatt gactatggta gtaaaactgt661 caaatgtatg aactgcatgt tttaaagaag acaaatgcaa accaaagcaa cttagtaaaa721 taataggtat aaaaagttat tctgtaagtc tgttggttgt atcttgtatc aaaatcccag781 taagttaagt tgtaaagact ttggaataag tttcttttta aaaatatgac attagccagg841 gatgtgttta attatataac tggtcttact gattttattg ccccctagca ataagccctt901 tcctttgatt catgtacaaa tttggtcata tgagaagcag gtgcgcagag aattccttga961 aagatatgag gtttttaaca tgaagtctga tgtggttttc ctctagcatt ccaaaaegtt
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②制備特異性抗體基因編碼蛋白的特異性抗體是研究基因結構和功能的不可缺少的重要工具，人睪丸原腸形成蛋白基因編碼蛋白的多克隆和單克隆抗體，可用作免疫組織化學染色、ELISA、免疫電鏡、免疫共沉淀等多種根據免疫學原理設計的檢測方法，可用于該基因編碼蛋白在組織細胞中的定位和定量研究，也可用于各種生物樣本(如血液、精液、尿液等)中的含量變化研究以及蛋白質-蛋白質相互作用研究等。因此，該抗體有可能用于制備與人睪丸原腸形成蛋白基因表達異常相關疾病診斷試劑盒，并有可能用于制備抗生育藥物。
③制備基因診斷芯片將功能基因用于制備基因診斷芯片是基因開發研究的一個重要方面，在疾病診斷(如男性不育、性功能低下)和藥物篩選等方面均具有重要意義。本發明技術方案1．人睪丸原腸形成蛋白基因融合蛋白的制備以人睪丸原腸形成蛋白基因開放閱讀框的核苷酸序列與質粒pDESTTM15制備成GST-SP2-pDEST15表達質粒，在無NaCl的LB中30℃培養到0.5 OD600，經0.3M NaCl誘導后，超聲粉碎后經GST親和層析柱純化，得到純化的融合蛋白。2．人睪丸原腸形成蛋白基因編碼蛋白特異性多克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結合，經透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)等量混合，免疫新西蘭兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激發注射一次，共三次，于三個月后取血分離血清。以免疫前動物血清作為對照做ELISA，測定各免疫兔血清中抗體滴度。篩選高滴度血清，進一步用抗原作競爭抑制免疫試驗確定抗體的特異性。根據ELISA結果確定其用于免疫組織化學染色的稀釋倍增數為1∶200～500。3．人睪丸原腸形成蛋白基因編碼蛋白特異性單克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結合，經透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdiuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹腔內注射)，隔周一次，連續2-3次，融合前靜脈加強一次，用ELISA方法證實抗體的產生后，取脾臟分離脾細胞，然后與骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞。陽性克隆經多次亞克隆，直至獲得分泌抗人睪丸原腸形成蛋白基因的單克隆雜交瘤細胞株。4．人睪丸原腸形成蛋白基因用于制備睪丸功能基因表達芯片(1)以獲取的人睪丸原腸形成蛋白基因的核苷酸序列設計引物，擴增全長的人睪丸原腸形成蛋白基因序列，用作點膜的樣品。(2)用英國BioRobotics自動點膜儀將標本點在8×12cm尼龍膜上，每一標本點2個點，每點的DNA量約幾ng。；陽性對照8個housekeeping genes (a.ribosomal protein S9；b.Actin gamma；c.glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；d.hypoxanthinephosphoribosyltransferase 1；e.H.sapiens mRNA for 23KD highly basicprotein；f.ubiqnitin C；g.Phospholipase A2；h.ubiquitin carboxyⅠ-ferminal esterase LⅠ)。陰性對照加入噬菌體DNA和P-blue質粒。(3)將含有該基因的芯片用于人睪丸原腸形成蛋白基因缺失的診斷和藥物篩選33P標記抽提待檢標本mRNA或DNA，用Random Primer標記法標記待檢標本mRNA或DNA，作為雜交的探針。雜交將點制好的尼龍膜標記探針雜交后，雜交爐(68℃)內烘干，用磷屏壓片。信號掃描和分析用記錄儀分析雜交信號。根據雜交信號的強弱分析影響人睪丸原腸形成蛋白基因蛋白表達水平或人睪丸原腸形成蛋白基因的缺失。
權利要求
1．一種精子功能特異基因克隆制備的融合蛋白，其特征是人睪丸原腸形成蛋白基因全部開放閱讀框氨基酸，序列為MKLHYVAVLTLAILMFLTWLPESLSCNKALCASDVSKCLIQELCQCRPGEGNCSCCKECMLCLGALWDECCDCVGMCNPRNYSDTPPTSKSTVEELHEPIPSLFRALTEGDTQLNWNIVSFPVAEELSHHENLVSFLETVNQPHHQNVSVPSNNVHAPYSSDKEHMCTVVYFDDCMSIHQCKISCESMGASKYRWFHNACCECIGPECIDYGSKTVKC
2．根據權利要求1所述針對人睪丸原腸形成蛋白基因開放閱讀框氨基酸序列制備的多克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合后，免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。
3．根據權利要求l所述針對人睪丸原腸形成蛋白基因開放讀框氨基酸序列制備的單克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合，免疫Balb/C小鼠，分離脾臟B淋巴細胞并和骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞，進一步用亞克隆方法、ELISA和抗體分型方法篩選分泌IgG抗體的單克隆，制備單克隆抗體。
4．根據權利要求1所述針對將人睪丸原腸形成蛋白基因開放讀框氨基酸序列用于制備睪丸功能基因表達芯片，其特征是PCR擴增人睪丸原腸形成蛋白基因cDNA，點于芯片用于芯片制備。
全文摘要
本發明屬于人類基因組技術領域,所述人睪丸原腸形成蛋白基因(twisted gastrulation protein),全長cDNA序列為1949bp,其開放閱讀框為672bp,編碼224個氨基酸,該基因在基因庫(Genbank)中的編號為AF294628。利用本發明的人睪丸原腸形成蛋白基因表達克隆,可制備融合蛋白,用該蛋白免疫動物可制備單克隆和多克隆抗體,并可將基因克隆用于睪丸特異功能基因表達芯片的制備。
文檔編號C12Q1/68GK1309137SQ01108258
公開日2001年8月22日 申請日期2001年2月28日 優先權日2001年2月28日
發明者沙家豪, 周作民, 李建民 申請人:南京醫科大學