一種堅強芽孢桿菌可濕性粉劑的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物農藥與微生物肥料領域，具體設及一種含芽抱萌發劑的堅強芽抱 桿菌可濕性粉劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 我國每年使用大量的化學農藥制劑與化肥，極易造成農藥殘留超標，生物富集，不 僅污染生態環境，還影響人類的健康。而生物農藥副作用小，對人無害，是一種具有廣闊前 景的綠色農藥，日益成為全球農藥發展的一種趨勢。
[0003] 芽胞桿菌是目前生物農藥中研究最多的一種微生物，它具有廣譜抗菌活性和極強 的抗逆能力，其營養細胞能在真菌性病原菌絲體表面繁衍定殖，有效抑制病菌生長，因此， 在控制病害發生、促進植株生長，提高作物產量等方面顯示出了廣闊的應用前景。
[0004] 堅強芽抱桿菌（Bacillus firmus)是1933年化edemannn AWerner首次發現并命名 的，堅強芽抱桿菌是一種營腐生生活的革蘭氏陽性細菌，在±壤、水體、植物表面和其它自 然環境中廣泛存在，易于獲取，內生芽抱，抗逆能力強，繁殖速度快、營養要求簡單、對農作 物和環境安全，可W產生多種抑菌物質，對許多真菌W及線蟲均有較強的抑制作用。
[0005] 目前國內，外關于堅強芽抱桿菌作為生防菌的報道不少。Bayer化opscience利用 堅強芽抱桿菌1-1582作為生物農藥已先后在美國和歐盟登記，登記名為PONCHO/VOTiVO,用 于防治玉米，大豆害蟲和植物線蟲，可直接殺死線蟲細胞，具有極好的防治效果。國內朱天 輝教授利用綠粘靑霉與堅強芽抱桿菌，預先接種生防菌協同控制赤枯病取得一定效果，鹿 秀云利用堅強芽抱桿菌XJT-7防治黃瓜白粉病，防治效果達到79%;劉幸紅等利用堅強芽抱 桿菌對核桃炭痘病進行防治，其防效可達到85%W上。目前，國內已有關生產堅強芽抱桿菌 類產品的相關技術，如:廖先清等在專利號：20中公開了一種堅強芽抱桿菌活 菌制劑的制備工藝;牛贍光等在專利號2009102564652中公開了一株堅強芽抱桿菌及其在 核桃炭痘病，黃瓜灰霉病，玉米小斑病，棉花枯萎病等多種植物病害上的防治上的應用。
[0006] 雖然W芽抱桿菌為主制備的微生物農藥產品不少，但總體說來，還存在包括研究 開發與生產脫節，制劑化困難，產品質量穩定性差、生產工藝落后，產品一致性不高，生產企 業規模小，應用推廣難度大的問題，除些之外，目前芽抱桿菌W可濕性粉劑為主，運種劑型 雖然便于儲存和運輸，但在生產應用中存在很多制約因子。如施用的可濕性粉劑中大部份 W芽抱作為衡量產品中有效成分的惟一標準，若芽抱不能及時萌發，施用效果則不佳，如王 倩利用枯草芽抱桿菌TR21防治己西蕉枯萎病時，前期試驗利用TR21菌株NB發酵液灌根和葉 蔽接種都能有效防治枯萎病，但是利用芽抱制備可濕性粉劑的灌根與葉蔽效果卻不理想， 顯示了去掉發酵液后的純芽抱可能因為萌發困難而使防效下降。但還未有具體的有關堅強 芽抱桿菌的可濕性粉劑的制備方法公開。也未有在可濕性粉劑中加入芽抱萌發劑的研究的 報道。
[0007] 另外，由于不同的芽抱桿菌與濕潤劑，分散劑等助劑的相容性，載體對各類芽抱桿 菌吸附性各不相同，將現有的芽抱桿菌可濕性粉劑的配方或制備工藝無法直接用于制備含 芽抱萌發劑的堅強芽抱桿菌可濕性粉劑;可濕性粉劑中有效菌的吸附量，存活率，對有害菌 的防治效果及可濕性粉劑量的穩定性差異較大，其整個可濕性粉劑的制備方法必須全盤考 慮各載體吸附能力，對堅強芽抱桿菌的干燥過程中保護作用，濕潤劑，分散劑對可濕性粉劑 的懸浮率，濕潤時間的影響，并且對芽抱萌發劑進行全面的篩選才能夠得到濕潤時間短，懸 浮率高，芽抱保存時間久，使用后芽抱能快速萌發的，防效好的堅強芽抱桿菌可濕性粉劑。

【發明內容】

[0008] 本發明所要解決的技術問題是:針對上述現有技術的不足，提供一種加入芽抱萌 發劑的堅強芽抱桿菌可濕性粉劑及其制備方法，其制備的堅強芽抱桿菌可濕性粉劑芽抱含 量為不低于100億CFU/克，懸浮率不低于80%，潤濕時間不高于70S，細度粉碎過400目篩，水 份含量不高于5%，制備方法穩定，施入大田后芽抱萌發速度與萌發率遠遠超過普通可濕性 粉劑。
[0009] 為了達到上述目的，一種堅強芽抱桿菌可濕性粉劑由下列重量分組成：堅強芽抱 桿菌發酵液40-70份;填料：白炭黑20-30份;潤濕劑= Morwet EFW 1-4份;分散劑= Morwet D-425 0.2-1份;芽抱萌發劑:果糖0.2-1份，鄉氨酸0.1-0.5份，賴氨酸0.2-1份;紫外保護劑： 卵憐脂1-2份，簇甲基纖維素0.2-1份;干燥保護劑:麥芽糖1-5份，甘露醇0.2-1份。
[0010] 為了實現上述目的，我們采用的一種堅強芽抱桿菌可濕性粉劑的其制備方法，由 W下幾步驟組成： 一、 堅強芽抱桿菌發酵液的制備 取出菌種保藏管，用LB固體培養基劃平板進行復蘇，37°C培養48小時。在平板下挑取單 個菌落接種至50毫升LB培養基中，在培養箱中37°C震蕩培養24小時。種子采用5%的接種量， 接種至化大S角瓶中的芽抱桿菌液體培養基，裝液量為化，37°C震蕩培養16-28小時，檢測 其菌液濃度，菌液含量超過60億/毫升，即可作為堅強芽抱桿菌種子液。將堅強芽抱桿菌種 子液接種至1000 L的發酵罐中，裝液量為60化的發酵培養基，通氣量為前16小時為每分鐘液 氣比為1:0.6，其后通氣量為1:1;開攬拌，轉速為16化/min，培養溫度前24小時為37°C，其 后，每4小時將溫度提高1°C，培養28-36小時，檢測其芽抱含量超過100億CFU/ml，即可結束 發酵，作為堅強芽抱桿菌發酵液； 其中，所述LB培養基：蛋白腺5g，牛肉膏3g，氯化鋼5g，水1000 mL，pH7.2，固體培養基中 加入瓊脂2%。其中，所述芽抱桿菌液體培養基:葡萄糖lOg/L，可溶性淀粉8 g/L，豆巧粉15 g/L，魚粉5 g/L，硫酸儀0.5 g/L，硫酸儘0.5 g/L，憐酸二氨鐘0.5 g/L，憐酸氨二鐘0.5 g/ 1，抑7.2; 其中，所述的發酵培養基:葡萄糖lOg/L，玉米粉20 g/L，豆巧粉75 g/L，魚粉5 g/L，硫 酸儀0.5 g/L，硫酸儘0.5 g/L，憐酸二氨鐘0.5 g/L，憐酸氨二鐘0.5 g/L，pH7.2; 各培養基滅菌的條件為:0.10-0.15MPa，121°C滅菌30分鐘； 二、 將堅強芽抱桿菌發酵液40-70份;填料：白炭黑20-30份;紫外保護劑:卵憐脂1-2份， 簇甲基纖維素0.2-1份;干燥保護劑:麥芽糖1-5份，甘露醇0.2-1份，混勻后噴霧干燥，得到 堅強芽抱桿菌粉劑； S、將潤濕劑:Morwet EFW 1-4份；分散劑:Morwet D-425 0.2-1份；芽抱萌發劑：果糖 0.2-1份，鄉氨酸0.1-0.5份，賴氨酸0.2-1份混勻得到堅強芽抱桿菌的助劑； 四、將步驟二與步驟=所得到的堅強芽抱桿菌粉劑與助劑混勻并過通過氣流粉碎機粉 碎過400目篩，檢測其芽抱含量不低于100億cfu/g，懸浮率不低于80%，潤濕時間不高于70s， 水份含量不高于5%，真空包裝，即可得到堅強芽抱桿菌可濕性粉劑。
[0011] 其中，所述的堅強芽抱桿菌可濕性粉劑的最佳重量份組成為:堅強芽抱桿菌發酵 液60份;填料：白炭黑25份;潤濕劑:Morwet EFW 3份;分散劑:Morwet D-425 0.8份;芽抱萌 發劑:果糖0.6份，鄉氨酸0.3份，賴氨酸0.6份;紫外保護劑:卵憐脂1.2份，簇甲基纖維素0.6 份;干燥保護劑:麥芽糖3份，甘露醇0.8份。
[0012] 自然界中芽抱萌發受外源營養物質的影響，運類營養物質被稱之為"萌發劑"，通 常情況下，芽抱和促進萌發的芽抱萌發劑混合后數秒鐘之內，萌發劑快速跨過芽抱衣和皮 層到達芽抱內膜的表面，與位于芽抱內膜上的受體蛋白相互作用，激發