一種利用蛹蟲草菌種感染家蠶幼蟲培育蠶蟲草的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用蛹蟲草菌種感染活體家蠶幼蟲培育蠶蟲草的方法。
【背景技術】
[0002]蟲草是一類具有顯著保健功能的藥食兩用真菌，其中最著名的是冬蟲夏草，其相關產品涉及保健品、食品、中成藥等幾大類十幾個品種，在全世界都享有盛譽。但冬蟲夏草寄主專一，生活環境苛刻，人工培育很難完全成功，而且由于其天然寄主蝙蝠蛾生活周期長、天敵多、病害多，自然繁殖的幼蟲產量嚴重不足，加之這些年來冬蟲夏草產區環境污染嚴重，人為過早、過量地滋采滋挖以及草甸沙化，造成未成熟的蟲草菌感染寄主的機會大量減少等原因，從而造成冬蟲夏草產量和質量大幅度下降，貨源稀缺，價格昂貴，遠遠不能滿足市場日益增長的需求。
[0003]家蠶是一種可以大規模人工飼養的鱗翅目昆蟲，其形態與冬蟲夏草的蟲體最為接近，以其作為寄主培育出的蠶蟲草是野生冬蟲夏草最佳的替代品。特別是中藥講究的是營養成分的全面性，即全草入藥，蠶蟲草在形態和有效成分上與冬蟲夏草最為接近，利用蠶蟲草替代冬蟲夏草對家蠶資源的綜合開發利用及青藏高原的生態環境保護都具有重要意義。
[0004]潘中華(2001)用5齡桑蠶幼蟲培育蠶蟲草，接種后在溫度22°C、濕度95%以上培養，其僵化率為48%?80%，但菌種退化明顯；溫魯(2004)和朱芬娣(2005)研究了蛹蟲草菌感染4齡起蠶、5齡起蠶的桑蠶的感染情況，發現5齡2?4天的感染效果比較好，僵化率達到了 80%左右。中國發明專利申請201110381394.6公開了以家蠶幼蟲為寄主的蛹蟲草子實體及其培育方法，采用了注射液體稀釋菌種后，把家蠶插入珍珠巖和蛭石的混合物里，然后在溫度18?24°C、濕度為70%?90%條件下培養，但沒有提及其家蠶的感染率。中國發明專利申請201110306713.7公開了一種利用桑蠶幼蟲培育蛹蟲草的方法，采用了 5齡熟蠶，低溫麻醉后注射蛹蟲草菌絲懸浮液，然后經過前期不斷進行溫差培養一段時間后，轉入溫度19?20°C、濕度85%?95%條件下培養3?5天后，給光培養。此方法操作比較復雜，技術難以控制。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種感染率及出草率高的蠶蟲草人工培育方法，該方法具有操作簡單、成本低、感染率及出草率高、穩定性好、易于規模化栽培等優點，具有廣闊的發展前景。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案實現的。
[0007]其包括如下步驟:1、一種蠶蟲草的培育方法，其包括如下步驟:
[0008](1)家蠶的選擇:選擇五齡第3天到第5天的家蠶作為寄主；
[0009](2)蛹蟲草菌種的制備:將復壯后的蛹蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每2?3塊接種到一瓶液體培養基中，23°C、130r/min震蕩培養5d得發酵液，過無菌紗布得液體菌種；
[0010](3)營養土的制備:選取含水量5%?20%的土壤，121°C , 0.1Mpa滅菌30min ;
[0011](4)接種:將上述的家蠶放入超凈工作臺上紫外滅菌20?50min，然后用一次性的注射器吸取0.2?0.4ml的液體菌種注射到家蠶體內；
[0012](5)前期培養管理:將接種后的家蠶放入上述的營養土內，放置在5°C?12°C環境下避光培養5?12d ;
[0013](6)后期培養管理:將經步驟(5)中的培養的家蠶放在光照強度50?2001x，溫度21°C?23°C，濕度86%?89%條件下培養35?60d，即得蠶蟲草。
[0014]本發明的優點是:操作簡單、成本低、技術容易推廣、感染率及出草率高、穩定性好、易于規模化栽培。
[0015]更具體地，本發明涉及:
[0016]1.一種蠶蟲草的培育方法，其包括如下步驟:⑴家蠶選擇；(2)菌種制備；(3)營養土的準備；⑷蠶體表滅菌:(5)接種；(6)管理。
[0017]2.項1所述的一種蠶蟲草的培育方法，其特征在于，步驟(2)，所述的菌種制備為:過濾，無菌紗布除去液體發酵液菌球。
[0018]3.項1所述的一種蠶蟲草的培育方法，其特征在于，步驟(3)，所述營養土為:含水量5%?20%的土壤，尚溫尚壓滅囷。
[0019]4.項1所述的一種蠶蟲草的培育方法，其特征在于，步驟(4)，家蠶體表滅菌方法為:紫外滅菌，滅菌時間20min?50min。
[0020]5.項1所述的一種蠶蟲草的培育方法，其特征在于，步驟￠)，所述的管理是:將接種后的家蠶放入步驟(3)制備的營養土內，5?12°C環境避光培養5?12d ;然后轉入光強50?2001x，溫度21?23°C，濕度為86?89%條件下培養35?60d，即得蠶蟲草。
【附圖說明】
[0021]圖1為本發明操作流程示意圖。
[0022]圖2為本發明培育的蠶蟲草產品圖。
【具體實施方式】
[0023]實施例1
[0024](1)家蠶的選擇:選擇五齡第3天的家蠶作為寄主；
[0025](2)蛹蟲草菌種的制備:將復壯后的蛹蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每2?3塊接種到一瓶液體培養基中，于23°C、130r/min震蕩培養5d得發酵液，過無菌紗布得液體菌種；
[0026](3)營養土的制備:配制含水量10%的土壤，121 °C，0.1Mpa滅菌30min ；
[0027](4)接種:將上述的家蠶放入超凈工作臺上紫外滅菌30min，然后用一次性的注射器吸取0.2ml的液體菌種注射到家蠶體內；
[0028](5)前期培養管理:將接種后的家蠶放入上述的營養土內，放置在9°C環境下避光培養10d ;
[0029](6)后期培養管理:將經步驟(5)中的培養的家蠶放在光照強度501x，溫度21°C，濕度86%條件下培養45d;
[0030]培養結束后，其蠶體感染率90 %，出草率為89 %，子實體長3?6cm，經測定，所得蠶蟲草子實體蟲草素的含量為0.189%，多糖為0.839%，蟲草酸為1.238% ;蟲體蟲草素的含量為0.077%，多糖為0.281%，蟲草酸為0.227%。其中蠶蟲草整體中蟲草素含量為0.155%，多糖為0.495%，蟲草酸為0.873%。
[0031]實施例2
[0032](1)家蠶的選擇:選擇五齡第5天的家蠶作為寄主；
[0033](2)蛹蟲草菌種的制備:將復壯后的蛹蟲草斜面菌種分割成黃豆大小，每2?3塊接種到一瓶液體培養基中，于23°C、130r/min震蕩培養5d得發酵液，過無菌紗布得液體菌種；
[0034](3)營養土的制備:配制含水量15%的土壤，121 °C，0.1Mpa滅菌30min ；
[0035](4)接種:將上述的家蠶放入超凈工作臺上紫外滅菌50min，然后用一次性的注射器吸取0.3ml的液體菌種注射到家蠶體內；
[0036](5)前期培養管理:將接種后的家蠶放入上述的營養土內，放置在7°C環境下避光培養12d ;
[0037](6)后期培養管理:將經步驟(5)中的培養的家蠶放在光照強度為1501x，溫度23°C，濕度89%條件下培養60d ；
[0038]培養結束后，其蠶體感染率95 %，出草率為92 %，子實體長3?6cm，其中子實體中蟲草素的含量為0.191%，多糖為0.911%，蟲草酸為1.476%。其中蟲體中蟲草素的含量為0.062 %，多糖為0.237 %，蟲草酸為0.309 %。其中蠶蟲草整體中蟲草素含量為0.169 %，多糖為0.523 %，蟲草酸為0.987 %。
[0039]以上得到的蠶蟲草經非臨床研究機構湖南省實驗動物中心和湖南省藥物安全評價研究中心的研究專題“小鼠經口灌服蠶蟲草粉急性毒性試驗(HNSE2013 (3) 005ATSI) ”進行試驗，結果顯示:小鼠經口灌胃蠶蟲草粉最大濃度0.48g/ml，最大體積40ml/kg，當日1次，小鼠自主活動如常，在給藥后14天的觀察期內未見明顯毒性癥狀，未見動物死亡，觀察期結束后麻醉處死所有動物，大體解剖后肉眼觀察各臟器也未發現明顯異常。
【主權項】
1.一種培育蠶蟲草的方法，其包括如下步驟: (1)選擇五齡第3-5天的家蠶作為寄主； (2)將復壯后的蛹蟲草菌種接種到液體培養基中培養，得液體菌種； (3)配制含水量5-20%的營養土，滅菌； (4)將步驟(1)的家蠶滅菌，然后接種步驟(2)的液體菌種； (5)將接種后的家蠶在營養土內5-12°C避光培養5-12d; (6)將經步驟(5)培養的家蠶在光照強度50-2001x、溫度21-23°C、濕度86-89%條件下培養35-60d。2.權利要求1的方法，其中營養土的含水量為10-20%。3.權利要求2的方法，其中營養土的含水量為10-15%。4.權利要求1-3之一的方法，其中步驟(5)的溫度為7-12°C。5.權利要求4的方法，其中步驟(5)的溫度為7-9°C。6.權利要求1-5之一的方法，其中步驟(5)的時間為10-12d。7.權利要求1-6之一的方法，其中步驟(6)的光照強度為50-1501x。8.權利要求1-7之一的方法，其中步驟(6)的光照時間為45-60d。
【專利摘要】一種蠶蟲草的培育方法，其包括如下步驟：(1)家蠶的選擇：選擇五齡第3～5d的家蠶作為寄主；(2)菌種制備：將蛹蟲草菌種接種于液體培養基中，震蕩培養后，無菌紗布過濾除菌球后得液體菌種；(3)營養土的制備：配制含水量5％～20％的土壤，高溫高壓滅菌后作為營養土；(4)接種：將家蠶放入紫外下滅菌20～50min，然后注射0.2～0.4ml的液體菌種到家蠶體內；(5)培養管理：將接種后的家蠶放入營養土內，放置在5℃～12℃環境下避光培養5～12d，后轉入光強為50～200lx，溫度為21℃～23℃，濕度為86％～89％的條件下培養35～60d，即得蠶蟲草。本發明具有操作簡單、成本低、感染率及出草率高、穩定性好等優點，適合大規模生產，具有廣闊的發展前景。
【IPC分類】A01G1/04
【公開號】CN105359825
【申請號】CN201510740832
【發明人】劉東波, 顏新培, 王蕾, 李堅, 賴錫湖
【申請人】劉東波
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2013年5月15日
【公告號】CN103262751A, CN103262751B