00LUX，每天光照16h的條件下進行培養。在本發明方法條件下，山葡萄愈 傷組織超低溫保存后成活率達到90%以上。
[0041] 試驗例：
[0042] 實施例1山葡萄愈傷組織玻璃化法超低溫保存技術
[0043] 實驗材料：來自山葡萄國家種質資源圃，種質編號為'75122'。
[0044] 實驗方法具體步驟如下：
[0045]1.材料獲得
[0046] 以山葡萄莖段為材料接種在MS培養基中添加BA(6-芐氨基腺嘌呤）2mg?L\ NAA(萘乙酸）0.Img.L\蔗糖30g.L\瓊脂7g.L1中，溫度25±2°C，光照強度1200Lux~ 1600Lux，每天光照16h的條件下誘導愈傷組織；
[0047] 2.愈傷組織脫水
[0048] 將愈傷組織切成0. 2*0. 2cm小塊置于超凈工作臺中鼓風干燥30min，使愈傷組織 適當脫水，可在超低溫保存過程中防止組織內冰晶的形成。
[0049] 3.裝載液裝載以及超低溫冷凍保存
[0050] 將愈傷組織浸入到裝有冷凍保護液的凍存管中，迅速投入到液氮中進行超低溫保 存；
[0051] 4.愈傷組織化凍
[0052] 將液氮中保存的愈傷組織取出置于40°C水浴鍋中化凍；
[0053] 5?洗滌
[0054] 用MS添加3 %蔗糖液體培養基沖洗兩次，每次10~12分鐘；
[0055] 6.恢復再生培養
[0056] 洗滌后，轉移到MS培養基中添加BA(6-芐氨基腺嘌呤）Img?L\NAA(萘乙 酸）0. 5mg?L\蔗糖30g?L\瓊脂7g?L1中，在25°C進行暗培養2周，然后移到光照強度 1200Lux~1600Lux，每天光照16h的條件下進行培養。
[0057] 實施例2干燥時間對山葡萄愈傷組織存活率的影響
[0058] 僅改變愈傷組織在超凈工作臺中鼓風干燥時間，其余步驟同實施例1，研究干燥時 間對山葡萄愈傷組織超低溫保存存活率的影響。結果如圖1所示。
[0059] 從圖1可以看出，新鮮的山葡萄愈傷組織凍存后，存活率為5% ;隨著干燥時間延 長，愈傷組織存活率有所增加，在干燥時間為40min，愈傷組織含水量為40. 7%時，存活率 達到最高，為90%。而過長的干燥時間，導致愈傷組織失水嚴重，愈傷組織存活率下降。
[0060] 實施例3裝載液對山葡萄愈傷組織存活率的影響
[0061] 僅改變裝載液組成成分，其余步驟同實施例1，研究裝載液對山葡萄愈傷組織超低 溫保存存活率的影響，其中Sl為超純水附加10%二甲基亞砜（DMSO)+10%乙二醇+8%葡萄 糖，32為超純水附加12.5%01^0+0.25%水解酪蛋白，33為超純水附加10%01^0+10%山 梨醇，S4為PVS2。結果如圖2所示，當采用Sl裝載液對山葡萄愈傷組織進行裝載并且對其 進行快速冷凍時，山葡萄愈傷組織存活率最高，達到90 %，其次為采用S4裝載液進行慢速 冷凍，山葡萄愈傷組織存活率為75%，使用S2和S3裝載液并進行分步冷凍時，山葡萄愈傷 組織存活率最低，均為20%。
[0062] 實施例4化凍溫度對山葡萄愈傷組織存活率的影響
[0063] 僅改變化凍溫度，其余步驟同實施例1，研究化凍溫度對山葡萄愈傷組織超低溫保 存存活率的影響。結果如圖3所示，在4°C冰箱內進行化凍時，愈傷組織成活率僅為5%， 25°C室溫進行化凍；愈傷組織成活率為55%，40°C水浴化凍時，愈傷組織成活率最高，達到 90%〇
[0064] 實施例5暗培養時間對山葡萄愈傷組織存活率的影響
[0065] 僅改變暗培養時間，其余步驟同實施例1，研究裝載液對山葡萄愈傷組織超低溫保 存的影響。結果如圖4所示。沒有進行暗培養的愈傷組織凍后成活率為25%，隨著暗培養 時間的延長，再培養成活率逐漸升高，暗培養14d的成活率最高，為90 %，暗培養時間過長 也不利于愈傷組織恢復生長。
[0066] 最后應說明的是：以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡 管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然 可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替 換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的精 神和范圍。
【主權項】
1. 一種山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，其特征在于，包括誘導愈傷組織、風 干、超低溫保存、化凍的步驟。2. 根據權利要求1所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，其特征在于，所述 誘導愈傷組織包括： 步驟1 :以山葡萄莖段為材料接種在下列培養基中： MS培養基；培養條件：溫度25±2°C，光照強度1200LuX-l600LuX，每天光照16h誘導愈傷組織。3. 根據權利要求1所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，其特征在于，所述 風干包括：將愈傷組織切塊并進行風干；所述超低溫保存包括：將風干后的山葡萄愈傷組 織浸入到含有冷凍保護液的凍存管中，然后將凍存管迅速投入到液氮中進行超低溫保存； 所述化凍包括：將液氮中保存的愈傷組織取出置于水浴鍋中化凍。4. 根據權利要求1所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，其特征在于，在化 凍之后，還包括以下步驟： 步驟a:用MS培養基添加質量百分比含量為3%的蔗糖液體作為最終培養基沖洗兩次， 每次10~12分鐘； 步驟b:洗滌后，轉移到下列培養基中： MS培養基培養條件：在25°C進行暗培養2周，然后移到光照強度1200LUX~I600LuX，每天光照 16h〇5. 根據權利要求3所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，其特征在于，所述 冷凍保護液按質量百分比計，包括DMS010%、乙二醇10%、葡萄糖8%，余量：超純水。6. 根據權利要求3所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，其特征在于，所述 將愈傷組織切塊并進行風干包括：將愈傷組織切成0. 2*0. 2cm小塊置于超凈工作臺中鼓風 干燥30min。7. 根據權利要求3所述的山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，其特征在于，步驟4 中，所述水浴鍋的溫度為40°C。
【專利摘要】本發明提供一種山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法，包括誘導愈傷組織、風干、超低溫保存、化凍的步驟。采用本發明方法保存的山葡萄愈傷組織繁殖率高，避免了田間圃位保存易受自然災害影響而導致種質丟失或毀滅的危險以及試管苗組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險。山葡萄愈傷組織玻璃化超低溫保存方法不需經過長期繼代保存，降低人工勞動強度。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105028195
【申請號】CN201510357986
【發明人】孫丹, 艾軍, 秦紅艷, 趙瀅, 李昌禹, 楊義明, 范書田
【申請人】中國農業科學院特產研究所
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月25日