專利名稱：一種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及ー種植物的組織培養和離體快速繁殖，尤其涉及ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法。
背景技術：
蕪;活是傘形科(UmbelIiferae)憲活屬iNotopterygium)多年生植物,為我國特有的重要瀕危植物，是中、藏、羌藥中最常用的藥材之一，也是市場缺ロ較大的中藏藥材。寬葉羌活以根狀莖及根入藥，味辛、性溫，有散表寒、祛風濕利關節等功效，主治感冒風濕、發熱頭痛、皮膚瘙癢、風水浮腫等癥。我國歷版藥典對寬葉羌活均有收載，據《中華人民共和國藥典》2005年版一部，為傘形科(Umbelliferae)多年生草本植物蕪;活
incisum Ting ex H. T. Chang)和寬葉蕪;活 0 forbesii Boissieu)的干燥根莖及根,用藥開發歷史悠久。依據藥材性狀一般劃分為蠶羌、竹節羌、大頭羌和條羌4個商品等級。按產地不同分為川羌(四川)和西羌(青海、甘肅等)。青海是寬葉羌活藥材的道地產區，暢銷全國并出口，主產果洛、玉樹、黃南、海東等地270(Γ4500米以上的高海拔山區。羌活藥材長期依賴野生采挖來滿足國內外市場需求，種質資源破壞嚴重、蘊藏量急劇減少，寬葉羌活種群遭到了毀滅性破壞，致使其資源已無法滿足市場需要。尤其是近年來隨著國內外對寬葉羌活需求量的増加，供需矛盾日益突出，加之利益驅使，大量掠奪性采挖，使寬葉羌活逐漸成為瀕危植物，面臨物種喪失，資源枯竭的危險，進行種質資源保護和擴大寬葉羌活繁育勢在必行。植物組織培養技術是利用細胞的全能性(即個體的某個器官或組織已經分化的細胞再生成完整個體的遺傳潛力。)，取植物個體上的細胞團或組織，通過人工配制的培養基，使這些細胞團或組織形成成千上萬個植株。利用組織培養進行離體快速繁殖有以下幾方面重要意義⑴繁殖速度快，不受外界氣候因素影響，一年四季在室內均可快速大量繁殖；(2)便于保持優良生物學特性；⑶在保存和繁育優良突變體或優良雜種一代方面有非常重要的意義，一株具有明顯優勢的寬葉羌活突變體或一個具明顯優勢的后代經組織培養后可大面積推廣等等。文獻報道了眾多高山野生藥材的組織培養，如雪蓮、紅景天等，但以野生寬葉羌活根芽為外植體的組織培養尚未見報道。從野外采集的外植體，其表面滋生大量細菌和真菌等微生物，有的甚至長到組織內部；加之寬葉羌活所含醌類、酚類物質較多，很容易氧化褐變，因此對外植體材料的選擇和消毒處理方法都是非常關鍵。本發明首次采用根芽外植體組織培養方法，開展野生寬葉羌活種質離體繁殖研究工作，這為挽救珍稀瀕危寬葉羌活種質資源，開展遺傳改良、促進寬葉羌活的エ廠化育苗提供了一條新途徑。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種易于操作、可進行大規模エ廠化生產的寬葉憲活組織培養離體快速繁埴方法。
為解決上述問題，本發明所述的ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理以寬葉羌活的根芽為外植體，經流水沖洗15 30分鐘，用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌2(Γ30秒，然后以無菌去離子水沖洗2 3次，再將沖洗后的外植體置于質量濃度為O. 19Γ0. 2%的升汞中，浸泡滅菌8 13分鐘，并用無菌去離子水沖洗3飛次，即得消毒后的外植體單芽；
⑵外植體接種將所述消毒后的外植體單芽接種在誘導芽分化培養基上，其中每25ml所述誘導芽分化培養基中接種I棵所述消毒后的外植體單芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol · m_2· s—1、光照時間為12 h · cf1的條件下培養25 30天，使根芽基部形成2 3個叢生芽；
⑶繼代増殖培養將所述2 3個叢生芽接種到繼代増殖培養基上，其中每25ml所述繼代増殖培養基中接種I棵所述叢生芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(Γ60umol . m_2. s'光照時間為12 h . cf1的條件下培養25 35天，形成寬葉羌活叢生苗；
⑷生根誘導將所述寬葉羌活叢生苗分株后轉入生根培養基中，其中每25ml所述生根培養基中接種I棵所述寬葉羌活叢生苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(Γ60umol . m_2. s'光照時間為12 h . cf1的條件下培養2(Γ30天后，小苗基部出現白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗；
(5)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15 20min后即得消毒后的育苗基質；所述育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質；
(6)植株移栽將所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基質中，煉苗后即長成正常寬葉羌活植株；所述ー棵完整再生小苗種植在所述消毒后的育苗基質IOcm2的范圍內。所述步驟⑴中的寬葉羌活的基源植物為傘形科多年生草本植物寬葉羌活{No top terygium forbesii Boissieu)。所述步驟⑵中的誘導芽分化培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤母液5 20ml，濃度為O. lmg/ml的萘こ酸母液2 10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. (Γ8.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。所述步驟⑶中的繼代増殖培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤母液5 20ml，濃度為O. lmg/ml的萘こ酸母液2 10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. (Γ8. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。所述步驟⑷中的生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液IOml，有機成分母液IOml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的吲哚丁酸母液5 15ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 0 8. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。所述步驟(5)中的育苗基質的總孔隙度為70°/Γ75%，有機質含量為20%。所述大量元素母液是指含有硝酸銨(NH4NO3) 1650mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1900mg/L,硫酸鎂(MgSO4) 370mg/L，磷酸ニ氫鉀(KH2PO4) 170mg/L,氯化鈣(CaCl2_ 2H20)440mg/L 的混合液。所述微量元素母液是指含有硫酸錳(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4 7H20)8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化鉀(ΚΙ) O. 83mg/L，鑰酸鈉(NaMoO4 2H20)0. 25mg/L，硫酸、銅(CuSO4 5H20) 0. 025mg/L,氯化鈷(CoCl2_ 6H20) 0. 025mg/L 的混合液。所述有機成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素O. lmg/L,鹽酸吡哆醇O. 5mg/L,煙酸O. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液。所述鐵鹽母液是指含有硫酸亞鐵(FeSO47H20) 27. 8mg/L, Na2 EDTA- 2H20 37. 3 mg/L的混合液。本發明與現有技術相比具有以下優點
I、本發明首次采用根芽外植體通過生物工程技術一組織培養技術進行組織培養，克服了寬葉羌活育苗周期過長(2年)、繁殖系數低的問題；同時開展野生寬葉羌活種質資源離體繁殖研究工作，為挽救珍稀瀕危寬葉羌活種質資源，開展遺傳改良、促進寬葉羌活的エ廠化育苗提供了一條新途徑，提供了一種能進行寬葉羌活的人工繁殖、種質資源離體保存、利用及選育藥用成分含量高的突變系的組織培養離體繁殖方法。2、由于本發明所用培養基中含有植物激素6-BA，6-BA激素屬細胞分裂素類，其具有誘導芽分化的主導作用，因此誘發時間短、出苗快、增殖頻率高，尤其出苗齊，煉苗后可直接成活，易于操作，可進行大規模エ廠化生產。3、本發明利用組織培養進行離體快速繁殖有以下幾方面重要意義⑴繁殖速度快，不受外界氣候因素影響，一年四季在室內均可快速大量繁殖，即啟動快；⑵便于保持優良生物學特性，即同步性好；(3)在保存和繁育優良突變體或優良雜種一代方面有非常重要的意義，一株具有明顯優勢的寬葉羌活突變體或一個具明顯優勢的后代經組織培養后可大面積推廣等等。
具體實施例方式實施例I ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理以寬葉羌活的根芽為外植體，經流水沖洗15分鐘，用體
積濃度為75%的酒精浸泡滅菌20秒，然后以無菌去離子水沖洗2 3次，再將沖洗后的外植體置于質量濃度為O. 1%的升汞中，浸泡滅菌8分鐘，并用無菌去離子水沖洗3次，最后用無菌濾紙吸干水分即得消毒后的外植體單芽。⑵外植體接種將消毒后的外植體單芽接種在誘導芽分化培養基上，其中每25ml誘導芽分化培養基中接種I棵消毒后的外植體單芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . πΓ2. s—1、光照時間為12 h . cf1的條件下培養25天，使根芽基部形成2^3個叢生芽。誘導芽分化培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，濃度為O. lmg/ml的萘こ酸(NAA)母液2ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。
⑶繼代增殖培養將2 3個叢生芽接種到繼代增殖培養基上，其中每25ml繼代增殖培養基中接種I棵叢生芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol .m_2. s_\光照時間為12 h . cf1的條件下培養25天，形成寬葉羌活叢生苗。繼代增埴培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液15ml，濃度為O. lmg/ml的萘こ酸(NAA)母液2ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。⑷生根誘導將寬葉羌活叢生苗長至5飛厘米時分株，即在無菌超凈工作臺內，打開瓶ロ封ロ膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然后轉入生根培養基中，其中每25ml生根培養基中接種I棵寬葉羌活叢生苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . πΓ2· s—1、光照時間為12 h · cf1的條件下培養20 25天后，小苗基部出現白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進行自養生長的幼小植株。生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液5ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后,加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。(5)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15^20min后即得消韋后的育苗基質。其中育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質，該育苗基質的總孔隙度為70°/Γ75%，有機質含量為20%。(6)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質中，煉苗后即長成正常寬葉羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質IOcm2的范圍內。實施例2 —種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理以寬葉羌活的根芽為外植體，經流水沖洗20分鐘，用體
積濃度為75%的酒精浸泡滅菌25秒，然后以無菌去離子水沖洗2 3次，再將沖洗后的外植體置于質量濃度為O. 15%的升汞中，浸泡滅菌10分鐘，并用無菌去離子水沖洗3次，最后用無菌濾紙吸干水分即得消毒后的外植體單芽。⑵外植體接種將消毒后的外植體單芽接種在誘導芽分化培養基上，其中每25ml誘導芽分化培養基中接種I棵消毒后的外植體單芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . πΓ2. s—1、光照時間為12 h . cf1的條件下培養28天，使根芽基部形成2^3個叢生芽。
誘導芽分化培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，濃度為O. lmg/ml的萘こ酸(NAA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。⑶繼代增殖培養將2 3個叢生芽接種到繼代增殖培養基上，其中每25ml繼代增殖培養基中接種I棵叢生芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol .m_2. s_\光照時間為12 h . cf1的條件下培養30天，形成寬葉羌活叢生苗。繼代增埴培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，濃度為O. lmg/ml的萘こ酸(NAA)母液5ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。⑷生根誘導將寬葉羌活叢生苗長至5飛厘米時分株，即在無菌超凈工作臺內，打開瓶ロ封ロ膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然后轉入生根培養基中，其中每25ml生根培養基中接種I棵寬葉羌活叢生苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . πΓ2· s—1、光照時間為12 h · cf1的條件下培養25 30天后，小苗基部出現白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進行自養生長的幼小植株。生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液IOml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后，加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。(5)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15^20min后即得消韋后的育苗基質。其中育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質，該育苗基質的總孔隙度為70°/Γ75%，有機質含量為20%。(6)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質中，煉苗后即長成正常寬葉羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質IOcm2的范圍內。實施例3 —種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理以寬葉羌活的根芽為外植體，經流水沖洗25分鐘，用體
積濃度為75%的酒精浸泡滅菌30秒，然后以無菌去離子水沖洗2 3次，再將沖洗后的外植體置于質量濃度為O. 2%的升汞中，浸泡滅菌12分鐘，并用無菌去離子水沖洗4次，最后用無菌濾紙吸干水分即得消毒后的外植體單芽。⑵外植體接種將消毒后的外植體單芽接種在誘導芽分化培養基上，其中每25ml誘導芽分化培養基中接種I棵消毒后的外植體單芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . πΓ2. s—1、光照時間為12 h . cf1的條件下培養30天，使根芽基部形成2^3個叢生芽。誘導芽分化培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液15ml，濃度為O. lmg/ml的萘こ酸(NAA)母液10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉7. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。⑶繼代增殖培養將2 3個叢生芽接種到繼代增殖培養基上，其中每25ml繼代增殖培養基中接種I棵叢生芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol .m_2. s_\光照時間為12 h . cf1的條件下培養35天，形成寬葉羌活叢生苗。繼代增埴培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元
素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液15ml，濃度為O. lmg/ml的萘こ酸(NAA)母液8ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉7. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。⑷生根誘導將寬葉羌活叢生苗長至5飛厘米時分株，即在無菌超凈工作臺內，打開瓶ロ封ロ膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然后轉入生根培養基中，其中每25ml生根培養基中接種I棵寬葉羌活叢生苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為30 60 umol . πΓ2· s—1、光照時間為12 h · cf1的條件下培養20 30天后，小苗基部出現白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進行自養生長的幼小植株。生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液15ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后，加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。(5)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15^20min后即得消韋后的育苗基質。其中育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質，該育苗基質的總孔隙度為70°/Γ75%，有機質含量為20%。(6)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質中，煉苗后即長成正常寬葉羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質IOcm2的范圍內。實施例4 ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理以寬葉羌活的根芽為外植體，經流水沖洗30分鐘，用體
積濃度為75%的酒精浸泡滅菌30秒，然后以無菌去離子水沖洗2 3次，再將沖洗后的外植體置于質量濃度為O. 2%的升汞中，浸泡滅菌13分鐘，并用無菌去離子水沖洗6次，最后用無菌濾紙吸干水分即得消毒后的外植體單芽。⑵外植體接種將消毒后的外植體單芽接種在誘導芽分化培養基上，其中每25ml誘導芽分化培養基中接種I棵消毒后的外植體單芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol . πΓ2. s—1、光照時間為12 h . cf1的條件下培養30天，使根芽基部形成2^3個叢生芽。誘導芽分化培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，濃度為O. lmg/ml的萘こ酸(NAA)母液2ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉8. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。⑶繼代增殖培養將2 3個叢生芽接種到繼代增殖培養基上，其中每25ml繼代增殖培養基中接種I棵叢生芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol .m_2. s_\光照時間為12 h . cf1的條件下培養3(Γ35天，形成寬葉羌活叢生苗。繼代增埴培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元 素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液5ml，濃度為O. lmg/ml的萘こ酸(NAA)母液10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉8. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。⑷生根誘導將寬葉羌活叢生苗長至5飛厘米時分株，即在無菌超凈工作臺內，打開瓶ロ封ロ膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的苗從叢生苗中分剝下來，然后轉入生根培養基中，其中每25ml生根培養基中接種I棵寬葉羌活叢生苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol · m_2· s—1、光照時間為12 h . cf1的條件下培養20 30天后，小苗基部出現白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進行自養生長的幼小植株。生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的吲哚丁酸(IBA)母液12ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImMNaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉8. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。(5)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15^20min后即得消韋后的育苗基質。其中育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質，該育苗基質的總孔隙度為70°/Γ75%，有機質含量為20%。(6)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質中，煉苗后即長成正常寬葉羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質IOcm2的范圍內。上述實施例廣4中的寬葉羌活的基源植物為傘形科多年生草本植物寬葉羌活(,No top terygi um forbesii Boissieu);超凈工作臺，型號為BCM-1000A,由蘇州安泰空氣技術有限公司生產。誘導芽分化培養基、繼代增殖培養基、生根培養基中大量元素母液是指含有硝酸銨(NH4NO3) 1650mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1900mg/L,硫酸鎂(MgSO4) 370mg/L,磷酸ニ氫鉀(KH2PO4) 170mg/L,氯化鈣(CaCl2_ 2H20) 440mg/L的混合液；微量元素母液是指含有硫酸錳(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4 7H20) 8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化鉀(KI) O. 83mg/L，鑰酸鈉(NaMoO4 2H20) O. 25mg/L，硫酸銅(CuSO4 5H20) O. 025mg/L,氯化鈷(CoC12_6H20) O. 025mg/L的混合液；有機成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素O. lmg/L,鹽酸卩比卩多醇O. 5mg/L,煙酸O. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液；鐵鹽母液是指含有硫 酸亞鐵(FeSO4 7H20) 27. 8mg/L，Na2 EDTA.2H20 37. 3 mg/L 的混合液。
權利要求
1.ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，包括以下步驟 ⑴外植體的選擇和消毒處理以寬葉羌活的根芽為外植體，經流水沖洗15 30分鐘，用體積濃度為75%的酒精浸泡滅菌2(T30秒，然后以無菌去離子水沖洗2 3次，再將沖洗后的外植體置于質量濃度為0. 19T0. 2%的升汞中，浸泡滅菌8 13分鐘，并用無菌去離子水沖洗.3飛次，即得消毒后的外植體單芽； ⑵外植體接種將所述消毒后的外植體單芽接種在誘導芽分化培養基上，其中每25ml所述誘導芽分化培養基中接種I棵所述消毒后的外植體單芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60 umol m_2. s—1、光照時間為12 h cf1的條件下培養25 30天，使根芽基部形成2 3個叢生芽； ⑶繼代増殖培養將所述2 3個叢生芽接種到繼代増殖培養基上，其中每25ml所述繼代増殖培養基中接種I棵所述叢生芽；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60umol . m_2. s'光照時間為12 h . cf1的條件下培養25 35天，形成寬葉羌活叢生苗； ⑷生根誘導將所述寬葉羌活叢生苗分株后轉入生根培養基中，其中每25ml所述生根培養基中接種I棵所述寬葉羌活叢生苗；在溫度為20°C ±2°C、光源為日光燈、光強為3(T60umol . m_2. s'光照時間為12 h . cf1的條件下培養2(T30天后，小苗基部出現白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗； (5)育苗基質消毒將育苗基質在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15 20min后即得消毒后的育苗基質；所述育苗基質是指腐殖質與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質； (6)植株移栽將所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基質中，煉苗后即長成正常寬葉羌活植株；所述ー棵完整再生小苗種植在所述消毒后的育苗基質IOcm2的范圍內。
2.如權利要求I所述的ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑴中的寬葉羌活的基源植物為傘形科多年生草本植物寬葉羌活。
3.如權利要求I所述的ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑵中的誘導芽分化培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖.30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤母液5 20ml，濃度為0. lmg/ml的萘こ酸母液.2 10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. (T8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。
4.如權利要求I所述的ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑶中的繼代增殖培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為0. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤母液5 20ml，濃度為0. lmg/ml的萘こ酸母液2 10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. (T8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。
5.如權利要求I所述的ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑷中的生根培養基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液IOml，有機成分母液IOml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為.0.lmg/ml的卩引哚丁酸母液5 15ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后,加入ImM NaOH溶液調整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. (T8. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為ー瓶，經121°C高溫消毒即得。
6.如權利要求I所述的ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟(5)中的育苗基質的總孔隙度為709^75%，有機質含量為20%。
7.如權利要求3、4或5所述的ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特征在于所述大量元素母液是指含有硝酸銨1650mg/L，硝酸鉀1900mg/L，硫酸鎂370mg/L，磷酸ニ氫鉀170mg/L,氯化I丐440mg/L的混合液。
8.如權利要求3、4或5所述的ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特征在于所述微量元素母液是指含有硫酸錳22. 3mg/L,硫酸鋅8. 6mg/L,硼酸.2mg/L,碘化鉀0. 83mg/L，鑰酸鈉0. 25mg/L，硫酸銅0. 025mg/L，氯化鈷0. 025mg/L的混合液。
9.如權利要求3、4或5所述的ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特征在于所述有機成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素0. lmg/L,鹽酸吡哆醇0. 5mg/L,煙酸0. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液。
10.如權利要求3、4或5所述的ー種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，其特征在于所述鐵鹽母液是指含有硫酸亞鐵27. 8mg/L, Na2-EDTA-2H20 37. 3 mg/L的混合液。
全文摘要
本發明涉及一種寬葉羌活組織培養離體快速繁殖方法，該方法包括以下步驟⑴外植體的選擇和消毒處理以寬葉羌活的根芽為外植體，經浸泡滅菌、沖洗，即得消毒后的外植體單芽；⑵外植體接種將消毒后的外植體單芽接種在誘導芽分化培養基上形成2~3個叢生芽；⑶繼代增殖培養將2~3個叢生芽接種到繼代增殖培養基上形成寬葉羌活叢生苗；⑷生根誘導將寬葉羌活叢生苗分株后轉入生根培養基中培養，形成完整再生小苗；⑸育苗基質消毒；⑹植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質中，煉苗后即長成正常寬葉羌活植株。本發明克服了寬葉羌活育苗周期過長、繁殖系數低的問題，易于操作、可進行工廠化快速育苗。
文檔編號A01H4/00GK102657085SQ20121014378
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者劉衛根, 周國英, 徐文華, 賀麗華, 趙曉輝 申請人:中國科學院西北高原生物研究所