專利名稱：一種神經細胞的凍存液及凍存方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞的凍存液及凍存方法。
背景技術：
細胞冷凍技術作為一種保存細胞的有效方法在生物學領域已深入廣泛的應用。低溫冷凍保存技術即將二甲亞砜和血清加入細胞懸液后放入凍存管中，置于-80°C冰箱內過夜后轉入液氮中保存。對多種細胞來說，加入適宜的冷凍液，經過凍-融過程細胞仍可存活并可以繼續培養。但多數情況適合于能在體外進行培養并長期存活的細胞，如骨髓瘤細胞、 雜交瘤細胞等。中國專利公告號CN 1164739C公開一種提高凍存細胞復蘇率的細胞凍存液，該發明配方為10% -30%的細胞培養液、60% -80%小牛血清和10%二甲基亞砜。所針對的細胞為普通動物組織細胞，甚至是腫瘤細胞，但是，對于神經細胞，因其中包含處于不同分化狀態的細胞，在體外又不適于長期存活、生長、分化，對凍融損傷、能量缺乏的敏感性較強，將嚴重影響神經細胞復蘇后的存活率和細胞活性。與其它細胞類型相比，神經細胞能量代謝快，能量需求量大，尤以細胞分化時更甚。葡萄糖是神經元能量代謝必需的能源物質，葡萄糖有利于神經元生長，但葡萄糖濃度太高，就容易增加污染的機會。神經細胞凍存復蘇后存活率較差、細胞活性較低，目前還未探索出一種較為理想的神經細胞凍存液和凍存方法，其原因主要與凍存液毒性、細胞能量缺乏等有關。中國專利CN1966674A公開了一種冷凍保存神經干細胞的方法，該發明所采用的將15% 2XDMS0導入膠原培養基中凍干，二甲基亞砜(DMSO)是細胞凍存常用的保護劑，無色透明液體，有很強的極性，可顯著改變細胞內多種酶類的活性，從而有利于細胞的凍存， 但二甲基亞砜使用濃度過高O 10%)，對凍存細胞產生嚴重的毒性作用，與蛋白質疏水基團發生作用，導致蛋白質變性。因此，神經細胞凍存液的研制應該致力于保證神經細胞的活性和提高復蘇后的存活率。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是，提供一種保持神經細胞活性，且提高細胞凍存復蘇后存活率的凍存液，同時，也提供一種應用此凍存液進行神經細胞凍存的方法。為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是，一種神經細胞的凍存液，所述凍存液包括基礎培養基、胎牛血清、二甲基亞砜、6-磷酸果糖和黃酮類物質，其中各組分的重量比為基礎培養基20-70重量份胎牛血清20-50重量份二甲基亞砜3-8重量份6-磷酸果糖O. 1-1重量份
黃酮類物質O. 1-1重量份；
其中，所述基礎培養基為Eagl^ 8]\^]\1、01^]\^12、或01^]\1與？12的按1 I的
重量比的混合培養基。其中，所述黃酮類物質為4'，5，7_三羥基黃酮、5，6_ 二羥基_7，4' -二甲氧基黃酮、5，8，2'-三烴基-7-甲氧基黃酮或3'，4'，5，7_四羥基黃烷酮。在本發明的神經細胞的凍存液中，黃酮類物質具有明確的抗氧化、可以抵御自由基對細胞的損傷。6-磷酸果糖具有在使凍存的細胞復原時提高活細胞率(有效細胞率)的功能，能在分子水平上調節細胞代謝中若干酶活性，恢復和改善細胞代謝，減輕細胞損傷， 能促進血液循環,增加ATP合成。本發明在神經細胞凍存液中含6-磷酸果糖、黃酮類物質和兩種制劑。本發明含 6-磷酸果糖和黃酮類物質的混合物有較好的效果，6-磷酸果糖和的黃酮類物質有顯著的協同作用，可以顯著提高神經細胞的活性和復蘇后的存活率。本發明還提供了一種神經細胞的凍存液的制備方法，即將所述各組分混合搖勻即成。本發明還提供了一種神經細胞凍存方法，包括以下步驟A.凍存液制備制備所述的神經細胞凍存液；B.細胞懸液制備培養生長成單層的神經細胞一瓶，O. 25%胰蛋白酶液消化3分鐘，棄胰酶液，加入RPMI-1640培養液10ml，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，離心4000轉/分， 棄上清，加入步驟A凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內；C.冷凍先將凍存管在(TC下凍存30min，然后放入-30°C凍存lh，再放入-80°C凍存4h，最后移入液氣iip中保存；D.細胞復蘇取出凍存管快速置于37°C水浴l_2min，震蕩直至細胞懸液完全融化，然后用10倍Hanks液稀釋，1000r/min離心5min,離心,去除上清液,再重復3次。所述細胞懸浮濃度為IX 108細胞/ml 5X 1010細胞/ml，以深低溫保藏。與現有技術相比，本發明具有以下優點和效果(I)本發明的神經細胞凍存液和凍存方法，復蘇細胞存活率可達95% -99%以上， 較使用常規細胞凍存液的復蘇存活率有了顯著提高；(2)本發明的神經細胞凍存液和凍存方法可以長期保存神經細胞，并且在長期保存后神經細胞活性不發生變化，保證了神經細胞生物學活性。(3)本發明神經細胞凍存方法，操作簡單可行，具有很強的實用價值。(4)本發明凍存液配方中二甲基亞砜濃度低于10%，對凍存神經細胞無毒性作用。
具體實施例方式實施例I神經細胞凍存液的制備一種神經細胞的凍存液，它由基礎培養基，胎牛血清，二甲基亞砜，6-磷酸果糖和黃酮類物質組成。按如下四個配方所列的物質和重量稱取各組分(單位為克)
權利要求
1.一種神經細胞的凍存液，其特征在于，所述凍存液包括基礎培養基、胎牛血清、二甲基亞砜、6-磷酸果糖和黃酮類物質，其中各組分的重量比為基礎培養基20-70重量份胎牛血清20-50重量份二甲基亞砜3-8重量份6-磷酸果糖O. 1-1重量份黃酮類物質0.1-1重量份；其中，所述基礎培養基為Eagle ; S MEM、DMEM、F12、或DMEM與F12的按I :1的重量比的混合培養基。
2.根據權利要求I所述的神經細胞的凍存液，其特征在于，所述黃酮類物質為 4’，5，7-三羥基黃酮、5，6-二羥基-7，4’-二甲氧基黃酮、5，8，2’_三烴基-7-甲氧基黃酮或3’，4’，5，7-四羥基黃烷酮。
3.—種神經細胞的凍存液的制備方法，將所述各組分混合搖勻即成。
4.一種使用權利要求I所述的神經細胞的凍存液的神經細胞凍存方法，包括以下步驟A.凍存液制備制備如權利要求I所述的神經細胞凍存液；B.細胞懸液制備培養生長成單層的神經細胞一瓶，O.25%胰蛋白酶液消化3分鐘，棄胰酶液，加入RPMI-1640培養液10ml，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，離心4000轉/分，棄上清，加入步驟A凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內；C.冷凍先將凍存管在0°C下凍存30min，然后放入_30°C凍存lh，再放入-80°C凍存 4h，最后移入液氣iip中保存；D.細胞復蘇取出凍存管快速置于37°C水浴l_2min，震蕩直至細胞懸液完全融化，然后用10倍Hanks液稀釋，1000r/min離心5min,離心,去除上清液,再重復3次。
5.根據權利要求4所述的神經細胞凍存方法，其特征在于，所述細胞懸浮濃度為 1X108細胞/ml 5X1010細胞/ml，以深低溫保藏。
全文摘要
本發明公開了一種凍存神經細胞的細胞凍存液及凍存方法，用于凍存神經細胞，特別是新鮮分離的原代動物神經細胞，如海馬神經細胞。本發明凍存液為在基礎培養基中加入基礎培養基、胎牛血清、二甲基亞砜、6-磷酸果糖和黃酮類物質，6-磷酸果糖(w/w)具有在使凍存的細胞復原時提高活細胞率(有效細胞率)的功能，黃酮類物質具有明確的抗氧化、可以抵御自由基對細胞的損傷。本發明提高神經細胞經過凍存的存活率以及細胞功能，復蘇細胞存活率提高到95%以上，本發明神經細胞凍存液可以長期保存神經細胞，保證神經細胞生物學活性，具有很強的實用價值。
文檔編號A01N1/02GK102578078SQ201210023539
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月2日 優先權日2012年2月2日
發明者孫晶 申請人:溫州醫學院附屬第二醫院