專利名稱：秈粳雜種育性位點秈粳片段置換的分子標記方法
秈粳雜種育性位點秈粳片段置換的分子標記方法技術領域：
本發明提供了秈粳雜種育性位點秈粳片段置換的分子標記方法，屬于分子遺傳學 領域。并利用此方法選育出粳型親秈性光溫敏不育系509S。該方法適合于水稻秈粳交后代 育性位點片段置換系的選育，可促進秈粳亞種間雜種優勢的利用。二、背景技術
近年來，隨著我國人口數量的不斷增加，以及耕地面積有限的情況下，提高水稻單 產對保障國家糧食安全具有重要意義，而秈粳雜種優勢的利用是提高水稻單產的重要途 徑。但秈粳亞種間雜種F1通常表現部分不育，從而限制其強大雜種優勢在生產上的有效利 用。廣親和基因S5-n的發現為克服秈粳亞種間育性障礙提供了途徑。目前，該基因被廣泛 應用于水稻秈粳雜種優勢利用中(Sci Agric Sin 1992，23 :1_6)。隨著育種親本范圍的擴 大，研究者們發現，某些雜交組合盡管親本之一為攜帶S5-n的廣親和品種，但其雜種F1仍 出現半不育現象(Japan J Breed 1993,43 :507-516)，因此僅靠廣親和基因S5_n并不能完 全解決秈粳亞種間的雜種半不育性問題。在育種實踐中，隨著雜種育性鑒定范圍的擴大，鑒 定出了 S8(Japan J Breed 1993，43 :507-516)、S9 (Theor Appl Genet, 1996,92 :183-190), S15(Theor Appl Genet，1996，92 :183-190)、S16 (Breeding Science 1995,45:161-170)、 S29(Plant Breeding,2005，124:440-445)、S30 (Breed Science,2005，55 :409-414)、 S31(Euphytica，2006，151 :331-337)和 S32 (Theor Appl Genet，2007，114 :515-524)等雜 種雌配子不育位點。目前，怎樣利用已經發現的育性位點應用于水稻秈粳交分子標記育種 還是一片空白。基于水稻秈粳交雜種不育的機理主要是單位點孢子體-配子體互作模式 (IRRI Rice genetics. IRRI, Manila, 1984, pp 119-130)，及在某一個育性位點上，秈稻和 粳稻中的等位基因分別為SX-i和SX-j，基因型為SX-i/SX-j的雜合體由于攜帶SX-j的雌 配子部分敗育而產生半不育小穗。本課題組提出，在不改變某一粳型品種的遺傳背景下，只 在育性位點上置換為相應的秈型品種的等位基因，該品種與秈稻品種雜交具有親和性，反 之，在秈型背景下，在育性位點上置換相應的粳型的等位基因，該品種與粳型品種雜交具有 親和性。通過這種策略，從而克服秈粳交雜種不育問題，實現秈粳亞種間雜種優勢的利用。 為此，本發明提供了秈粳雜種育性位點秈粳片段置換的分子標記方法，并利用此方法在低 世代分離群體中，通過分子標記輔助選擇以及結合常規的回交育種，選育出粳型親秈性光 溫敏不育系509S，實現秈粳亞種間雜種優勢的利用。三、發明內容
技術問題
本發明的目的是提供了秈粳雜種育性位點秈粳片段置換的分子標記方法，屬于 分子遺傳學領域。并利用此方法選育出粳型親秈性光溫敏不育系509S。該方法適合于水稻 秈粳交后代育性位點片段置換系的選育，可解決秈粳交亞種間雜種不育的問題，促進秈粳 亞種間雜種優勢的利用。
秈粳亞種間雜種F1通常表現部分不育，限制其強大雜種優勢在生產上的有效利 用。廣親和基因S5-n的發現為克服秈粳亞種間育性障礙提供了途徑。目前，該基因被廣泛 應用于水稻秈粳雜種優勢利用中(Sci Agric Sin 1992，23 :1_6)。隨著育種親本范圍的擴 大，研究者們發現，某些雜交組合盡管親本之一為攜帶S5-n的廣親和品種，但其雜種F1仍 出現半不育現象(Japan J Breed 1993,43 :507-516)，因此僅靠廣親和基因S5_n并不能完 全解決秈粳亞種間的雜種半不育性問題。在育種實踐中，隨著雜種育性鑒定范圍的擴大， 鑒定出了 30多個雜種雌配子不育位點(Theor Appl Genet，2007，114 :915-925)。目前，怎 樣利用已經發現的育性位點應用于水稻秈粳交分子標記育種還是一片空白。基于水稻秈 粳交雜種不育的機理主要是單位點孢子體-配子體互作模式(IRRI Rice genetics. IRRI, Manila, 1984,pp 119-130)，及在某一個育性位點上，秈稻和粳稻中的等位基因分別為SX_i 和SX-j，基因型為SX-i/SX-j的雜合體由于攜帶SX-j的雌配子部分敗育而產生半不育小 穗。
技術方案
秈粳雜種育性位點秈粳片段置換的分子標記方法，其特征在于，用分子標記引物 RMz5、RMz7、RMz8和RMz9分別對育性位點S5位點、S7位點、S8位點和S9位點的秈粳片段 置換進行分子標記，其中
用標記引物RMz 5
左端引物序列5，-AATGGAGTCGACCGTGTGTTCGTCG-3 ‘
右端引物序列5' -CCCCAAACCTGAAATCACCAGTGTT-3‘
擴增廣親和水稻品種DNA，獲得S5位點標記片段大小為l(^bp ；擴增秈稻品種 DNA，獲得S5位點標記片段大小為I^bp ；擴增粳稻品種DNA，獲得S5位點標記片段大小為 131bp ；
標記引物RMz7
左端引物序列5，-GGTAACATGCATATCACGCT-3，
右端引物序列5，-GTATGCCGATATGCGTAGCC-3，
擴增秈稻品種DNA，獲得S7位點標記片段大小為200bp ；擴增粳稻品種DNA，獲得 S7位點標記片段大小為215bp ；
標記引物RMz8
左端引物序列5，-AACCACCACCACCACGCCTCTG-3，
右端引物序列5，-CCTTGGAGAGGAGGAGGCGCGC-3，
擴增秈稻品種DNA，獲得S8位點標記片段大小為131bp ；擴增粳稻品種DNA，獲得 S8位點標記片段大小為I^bp ；
標記引物RMz9
左端引物序列5，-GGTTGTTGGGAGGGAGAAAGGCT-3，
右端引物序列5，-TGGAGGCGACGGCGATGTCCTTG-3，
擴增秈稻品種DNA，獲得S9位點標記片段大小為150bp，擴增粳稻品種DNA ；獲得 S9位點標記片段大小為161bp。
所述分子標記方法的應用，包括
(1)用不育系輪回422S與粳稻品種鎮稻88雜交，得到雜交F1,以雜種F1作母本，用鎮稻88作輪回親本，得到回交群體BC1F1，從BC1F1開始在苗期就分別用S5位點的標記RMz5 和S8位點的標記RMz8進行檢測，
輪回422S為廣親和秈稻品種，用分子標記RMz5擴增時，能得到廣親和品種S5位 點標記105bp大小的片段，用分子標記RMzS擴增時，能得到S8位點131bp大小的片段；
鎮稻88為粳稻品種，用分子標記RMz5擴增時，能得到S5位點標記131bp大小的 片段；用分子標記RMzS擴增時，能得到S8位點標記145bp大小的片段；
BC1F1在育性位點S5和S8位點檢測到秈稻片段的株系，在開花期就作母本與背景 親本雜交，在每一個世代都用同樣的方法，一直到BC4F2世代得到一個穩定的粳稻光溫敏核 不育材料W0532即輪回422S/鎮稻88//鎮稻88///鎮稻88////鎮稻88 ；
(2)用帶有黃葉基因的249黃與粳稻品種鎮稻88雜交，得到雜交F1,以雜種F1作母 本，用鎮稻88作輪回親本，得到回交群體BC1F1，從開始在苗期就分別用S7位點的標記RMz7 和S9位點的標記RMz9進行檢測，
249黃為秈稻品種，用分子標記RMz7擴增時，能得到S7位點標記200bp大小的片 段，用分子標記RMz9擴增時，能得到S9位點標記150bp大小的片段；
鎮稻88為粳稻品種，用分子標記RMz7擴增時，能得到S7位點標記215bp大小的 片段；用分子標記RMz9擴增時，能得到S9位點標記161bp大小的片段；
BC1F1在育性位點S7和S9位點檢測到秈稻片段的株系，在開花期就作母本與背景 親本雜交，在每一個世代都用同樣的方法，一直到BC4F2世代得到一個穩定的帶有黃葉基因 材料W249，即輪回249黃/鎮稻88//鎮稻88///鎮稻88////鎮稻88 ；
(3)進一步以粳稻光溫敏核不育材料W0532作母本，與帶有黃葉基因材料W249雜 交得到F1,自交得到分離F2群體，在這個分離群體中用4個分子標記RMz5，RMz7, RMz8和 RMz9共同進行選擇，同時也進行黃葉和花粉育性表型選擇，在以下的自交分離群體中，都 用相同的方法進行選擇，一直到F8代，當不育株系表現整齊一致，不育性良好，即不育株率 100%，花粉不育度100%，套袋自交結實率0，在4個育性位點S5位點、S7位點、S8位點和 S9位點上都置換為秈型片段，將該株系暫定名為509S。
光溫敏不育系509S要以與秈稻、粳稻以及育種上正在利用的常規品種配制雜交 種應用。
有益效果本發明所提供的秈粳雜種育性位點秈粳片段置換的分子標記方法，具 有以下優點
(1)通過本發明獲得與秈粳雜種育性位點緊密連鎖的分子標記，在S5位點上開發 分子標記RMz5，在S7位點上開發分子標記RMz7，在S8位點上開發分子標記RMz8，在S9位 點上開發分子標記RMz9。
(2)通過本發明可對S5、S7、S8、S9育性位點進行秈粳片段置換進行分子標記，選 擇的片段位置明確，鑒定方便。通過檢測育性位點的分子標記，即可預測秈粳交雜種育性恢 復的大小，進而在秈粳交分離群體中快速篩選出高育的后代用于雜交水稻的育種。該方法 檢測方便快速，不受環境影響；
(3)輔助育種選擇目標明確，節約成本。在秈粳交傳統育種方法中，首先要種植較 大的次級分離群體，需要投入大量的人力，物力和財力。其次，育種的周期長，一個常規品 種的選育需要8-10年，且不一定在育性位點選育到純合穩定的植株。而通過早期的育性位點的分子標記選擇，可以在較小的分離群體中，通過檢測秈粳交育性位點的分子標記，在 苗期就鑒定出置換片段的單株，淘汰其它植株，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率。 通過此方法，光溫敏不育系509S只用了 6年時間就被選育出來了，較常規的育種方法提前 2年時間。成功用于與秈稻配制雜交組合，后代表現出強大的秈粳交雜種優勢，如雜交組合 509S/W102在江蘇南京，江西南昌連續兩年的區試中都表現為優質高產。


圖1在S5位點分子標記RMz5選擇單株
M為Marker, 1,7,8,9,10，11，12泳道代表背景親本鎮稻88片段的單株；3，6為帶 有秈稻品種249黃片段的單株；2，4，5泳道為帶有廣親和品種輪回422片段的單株。
圖2在S7位點分子標記RMz7檢測秈稻、粳稻
M為Marker，1，9，11，12為帶有鎮稻88片段的單株；4，5，6，7，10，泳道為帶有秈稻 品種片段的單株；2，3，8為雜合單株片段。
圖3在S8位點分子標記RMz8測秈稻、粳稻
M為Marker，1,7,8,11,12為帶有秈稻品種片段的單株；2，3，4，5，泳道為帶有粳稻 品種片段的單株；6，9，10為雜合單株。
圖4在S9位點分子標記RMz9檢測秈稻、粳稻
M為Marker，1,7,8,11,12為帶有秈稻品種片段的單株；2，4，5，6泳道為帶有粳稻 品種片段的單株；3，9，10為雜合單株。
圖5利用SSR標記對包括509S在內的M個品種聚類分析。
在圖中，光溫敏不育系509S被聚類在粳稻品種這一類，其中與粳稻品種越光具有 較高的相似性。
生物材料保藏
粳型親秈型光溫敏不育系509S，屬水稻(Oryza sativa)，于2010年08月23日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院 3號，中國科學院微生物研究所，保藏號CGMCCN0. 4105。
具體實施方式
研究結果表明秈粳交雜種不育的機理屬于單位點孢子體-配子體互作模式，及在 某一個育性位點上，秈稻和粳稻中的等位基因分別為SX-i和sx-j，基因型為sx-i/sx-j的 雜合體由于攜帶sx-j的雌配子部分敗育而產生半不育小穗。只在育性位點上置換為相應 另一亞種的等位基因，這樣有可能克服秈粳交雜種不育。其中，本實驗已經對S5，S7, S8和 S9育性位點進行了精細定位，相應的分子標記也已經開發。如S5位點的標記為RMz5，S7位 點的標記為RMz7，S8位點的標記為RMz8，S9位點的標記為RMz9 (見表1)。
(一 )標記篩選
(1) 一方面，用不育系輪回422S與粳稻品種鎮稻88雜交，得到雜交F1,以雜種F1 作母本，用鎮稻88作輪回親本，得到回交群體BC1F1，從BC1F1開始在苗期就分別用S5位點 的標記RMz5和S8位點的標記RMz8進行檢測。輪回422S為廣親和品種，用分子標記RMz5 擴增時，能得到105bp大小的片段，用分子標記RMzS擴增時，能得到131bp大小的片段(見表2)。鎮稻88為粳稻品種，用分子標記RMz5擴增時，能得到131bp大小的片段；用分子標 記RMzS擴增時，能得到145bp大小的片段。在育性位點檢測到需要的秈稻片段的株系，在 開花期就作母本與背景親本雜交，在每一個世代都用同樣的方法，一直到BC4F2世代得到一 個穩定的粳稻光溫敏核不育材料W0532 (輪回422S/鎮稻88//鎮稻88///鎮稻88////鎮 稻 88)。
(2)另一方面，用帶有黃葉基因的249黃與粳稻品種鎮稻88雜交，得到雜交F1,以 雜種F1作母本，用鎮稻88作輪回親本，得到回交群體BC1F1，從BC1F1開始在苗期就分別用S7 位點的標記RMz7和S9位點的標記RMz9進行檢測。249黃為秈稻品種，用分子標記RMz7擴 增時，能得到200bp大小的片段，用分子標記RMz9擴增時，能得到150bp大小的片段。鎮稻 88為粳稻品種，用分子標記RMz7擴增時，能得到215bp大小的片段；用分子標記RMz9擴增 時，能得到161bp大小的片段。在育性位點檢測到需要的秈稻片段的株系，在開花期就作母 本與背景親本雜交，在每一個世代都用同樣的方法，一直到BC4F2世代得到一個穩定的帶 有黃葉基因材料W249 (輪回249黃/鎮稻88//鎮稻88///鎮稻88////鎮稻88)。
(3)進一步將粳稻光溫敏核不育材料W0532作母本，與帶有黃葉基因材料W249雜 交得到F1,自交得到分離F2群體，在這個分離群體中用4個分子標記(RMz5，RMz7, RMz8, RMz9)進行標記的選擇，同時也進行表型選擇(黃葉和花粉育性選擇)。在以下的自交分離 群體中，都用相同的方法進行選擇，一直到F8代，當不育株系表現整齊一致，不育性良好，在 4個育性位點上都置換為秈型片段，且割茬再生時可繁性好，把該系暫定名為509S。
(4)當光溫敏不育系509S育成后，以其作母本，與當前生產上利用的優異的常規 品種廣泛雜交(見表3)。從表中結果可知，不育系509S與粳稻測驗種巴里拉、秋光雜交 雜種的小穗育性表現為半不育，而與秈稻測驗種南京11、IR36雜交雜種的小穗育性卻表 現正常。該結果暗示不育系509S雖然92%為鎮稻88的粳稻遺傳背景，但在不育位點上 100%都已經被置換為秈稻片段，因此，與秈稻雜交雜種育性表現正常。同時，在不育系與 秈稻配制的雜交組合中表現出強大的秈粳交雜種優勢，如雜交組合509S/W102(品種權號 CNA20060245. 4)在江蘇南京，江西南昌連續兩年的區試中都表現為優質高產。本方法為秈 粳交雜種優勢的育種實踐利用提供了一種新的可行途徑。
表1標記引物的序列及擴增片段大小
權利要求
1.秈粳雜種育性位點秈粳片段置換的分子標記方法，其特征在于，用分子標記引物 RMz5、RMz7、RMz8和RMz9分別對育性位點S5位點、S7位點、S8位點和S9位點的秈粳片段 置換進行分子標記，其中用標記引物RMz5左端引物序列 5’ -AATGGAGTCGACCGTGTGTTCGTCG-3 ‘ 右端引物序列 5' -CCCCAAACCTGAAATCACCAGTGTT-3 ‘擴增廣親和水稻品種DNA，獲得S5位點標記片段大小為l(^bp ；擴增秈稻品種DNA，獲 得S5位點標記片段大小為I^bp ；擴增粳稻品種DNA，獲得S5位點標記片段大小為131bp ； 標記引物RMz 7左端引物序列 5’ -GGTAACATGCATATCACGCT-3’ 右端引物序列 5’ -GTATGCCGATATGCGTAGCC-3，擴增秈稻品種DNA，獲得S7位點標記片段大小為200bp ；擴增粳稻品種DNA，獲得S7位 點標記片段大小為215bp ； 標記引物RMz8左端引物序列 5’ -AACCACCACCACCACGCCTCTG-3， 右端引物序列 5’ -CCTTGGAGAGGAGGAGGCGCGC-3，擴增秈稻品種DNA，獲得S8位點標記片段大小為131bp ；擴增粳稻品種DNA，獲得S8位 點標記片段大小為I^bp ； 標記引物RMz9左端引物序列 5’ -GGTTGTTGGGAGGGAGAAAGGCT-3’ 右端引物序列 5’ -TGGAGGCGACGGCGATGTCCTTG-3’擴增秈稻品種DNA，獲得S9位點標記片段大小為150bp，擴增粳稻品種DNA ；獲得S9位 點標記片段大小為161bp。
2.權利要求1所述分子標記方法的應用，包括(1)用不育系輪回422S與粳稻品種鎮稻88雜交，得到雜交F1,以雜種F1作母本，用鎮 稻88作輪回親本，得到回交群體BC1F1，從BC1F1開始在苗期就分別用S5位點的標記RMz5 和S8位點的標記RMzS進行檢測，BC1F1在育性位點S5和S8位點檢測到秈稻片段的株系， 在開花期就作母本與背景親本雜交，在每一個世代都用同樣的方法，一直到BC4F2世代得到 一個穩定的粳稻光溫敏核不育材料W0532即輪回422S/鎮稻88//鎮稻88///鎮稻88//// 鎮稻88 ；(2)用帶有黃葉基因的249黃與粳稻品種鎮稻88雜交，得到雜交F1,以雜種F1作母本， 用鎮稻88作輪回親本，得到回交群體BC1F1，從開始在苗期就分別用S7位點的標記RMz7和 S9位點的標記RMz9進行檢測，BC1F1在育性位點S7和S9位點檢測到秈稻片段的株系，在 開花期就作母本與背景親本雜交，在每一個世代都用同樣的方法，一直到BC4F2世代得到一 個穩定的帶有黃葉基因材料WM9，即輪回249黃/鎮稻88//鎮稻88///鎮稻88////鎮稻 88 ；(3)進一步以粳稻光溫敏核不育材料W0532作母本，與帶有黃葉基因材料W249雜交得 到F1,自交得到分離F2群體，在這個分離群體中用4個分子標記RMz5，RMz7, RMz8和RMz9 共同進行選擇，同時也進行黃葉和花粉育性表型選擇，在以下的自交分離群體中，都用相同的方法進行選擇，一直到F8代，當不育株系表現整齊一致，不育株率100%，花粉不育度 100%，套袋自交結實率0，在4個育性位點S5位點、S7位點、S8位點和S9位點上都置換為 秈型片段，將該株系暫定名為509S。
3.權利要求2所述株系509S的應用，包括將光溫敏不育系509S與秈稻、粳稻以及育 種上正在利用的常規品種配制雜交種的應用方法。
全文摘要
本發明提供了秈粳雜種育性位點秈粳片段置換的分子標記方法，屬于分子遺傳學領域。本發明開發設計分子標記引物RMz5，RMz7，RMz8和RMz9分別能夠在S5，S7，S8和S9這4個秈粳交不育位點擴增出差異片段。通過育性基因位點的分子標記實現了秈粳片段的置換，可準確而快速地導入所需要的片段，大大提高秈粳育性位點片段置換的選擇效率，并育成粳型親秈性光溫敏不育系509S。
文檔編號A01H1/02GK102031301SQ20101027251
公開日2011年4月27日 申請日期2010年9月6日 優先權日2010年9月6日
發明者萬建民, 劉世家, 劉喜, 江玲, 王益華, 趙志剛, 陳亮明 申請人:南京農業大學