專利名稱：一種測定選育番茄抗青枯病品種的方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及利用基因分子標記和抗性酶測定選育品種的方法，尤其涉及利用AFLP(擴增酶切DNA片段長度多態性)分子標記和抗性酶測定指標相結合，選育番茄抗青枯病品種的方法。
背景技術：
青枯病菌是細菌青枯雷爾菌(Ralstonia Solanacearum Smith)，1896年被美國Eruim Smith定名為青枯假單胞桿菌。其有兩個亞分類系統，根據寄主范圍不同分為4個Race(生理小種)，對番茄、馬鈴薯、茄子等茄科作物以及煙草為害的是Race I。二是根據對乳糖、麥芽糖、纖維二糖和甘露糖、山梨酸、甜酸的糖酸利用情況分為5個Biovar(生化變種)，我國南方青枯病為害番茄的主要是Biovar III。受青枯病的影響，我國南方番茄生產常損失慘重，選育抗青枯病番茄品種是重要的抗病技術。番茄青枯病的遺傳背景復雜，給育種帶來困難。雖然目前對番茄抗青枯病基因的定位和分子標記育種進行了一些研究，但成功地用于育種還沒有公開的報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種選育番茄抗青枯病的方法，是利用接種青枯病后抗性酶變化的特點和AFLP(擴僧酶切DNA片段長度多態性)基因分子標記相結合，可以選出含有番茄抗青枯病基因的品種或親本。
本發明的方法通過以下步驟實現(1)選擇3-4葉期番茄苗，用斷根法接種濃度為4*108個/ml的青枯病菌液；7-16天后用葉片連續測定苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)3-5天，選擇苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶峰值比不接種的高40％和15％的為抗病株系，選用的青枯菌為Race I或Biovar III；(2)選擇3-4葉番茄苗，斷根法接種青枯病菌后選10株高抗株提取DNA或選取番茄3-4葉苗10株提取DNA，進行AFLP分子標記，測定接種青枯病后7-16天的苗和未經處理過番茄苗的苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶，AFLP分子標記中選用E-AAG/M-CAT、E-AGG/M-CTG引物組合。AFLP分子標記應先建立抗性親本、感病性親本和F2代中的抗病和感病植株的4個DNA基因池(PR、PS、BR、BS)，，再用25μl反應體系中加入連接稀釋10倍后的DNA樣品2.5μl選用EcoR I/Mse I內切酶，退火Tm值取53℃，預擴增體系選用1.2mMOLMg2+濃度，反應溫度為94℃30S，53℃60S，72℃60S，23個循環。應用EcoR I/Mse I各8個引物，組成64個引物的組合，擴增后尋找E-AAG/M-CAT的特異條帶。
本發明的特點是(1)AFLP結合了RFLP和RAPD的各自優點，所需DNA的量少而方便快速，AFLP產物呈典型的孟德爾遺傳方式，實驗結果可靠，與生理酶性反應相結合，提出了番茄抗青枯病分子輔助育種的創新方法。(2)節省育種材料，利用分子標記方法選育番茄抗青枯病只需少量種子，可以分析出大量純合的番茄品種或品系的抗性差異，較快地選出抗性育種材料。(3)縮短育種的世代和時間，常規育成番茄品種需6-8年的周期，AFLP分子標記選擇育種，可以在同一時間內分析多個品種，在有親本、F2種子的時候，只需2-3個月的時間就可以明確抗性基因的存在，使新品種的選育能在1-2年內完成，大大節省了人力和物力。(4)實驗結果可靠，只要實驗環境一致，可以獲得理想的選育結果，再繼續研究，還能把特異性條帶定位到染色體的位點上。
具體實施例方式
實施例一將純合的番茄種子播于穴盤，在3-4葉期用斷根法接種濃度為4*108個/ml的青枯病菌液，有10株不接種。接種后7-16天間取番茄鮮葉按照(XUE YinglongOUYANG Guangcha，AO Shaogen.Studies on the plant phenlanine ammonielyase[J].Acta Phytophysioloca Sinica.1983，9(3)301-305)中的方法提取酶液，進行苯丙氨酸解氨酶(PAL)的測定，用(ZHU Guanglian，ZHONGHaiwen，ZHANG Haiqin.A Laboratory Mannal of plantPhysiology[M].BeijingScience Press，199051-54.in china)中的方法提取超氧化物歧化酶(SOD)并進行測定。隔天測定，一般5-8次，接種番茄和不接種番茄的酶活性進行比較，接種番茄的PAL和SOD的峰值比不接種的峰值超過40％和15％以上可被選為有抗青枯病基因的番茄品種或親本，即抗病株系。接種后PAL值在前一周高于或低于不接種的番茄植株，一般高于的峰值不超過30％，一周后低于不接菌種的植株，而SOD值接菌的植株一直低于不接種的植株的可初選為不抗青枯病的番茄品種或親本。
被選擇初步認定為抗病和不抗病的番茄株系，用抗性品系為母本以不抗病的番茄株系為母本有性雜交，加代繁殖F1進行自交形成F2代種子。
挑選飽滿的母本(抗性)、父本(感性)和F2代種子播于裝有基質(蛭石∶泥炭∶珍珠巖＝1∶2∶1)的育苗穴盤中(一般要求36或72穴)，在25-30℃下發芽，待子葉平展，噴施營養液，二葉期移栽到15穴的育苗盤中，每一親本群體在100-150株，F2在300株左右，至四葉期前每一樣本群體單株掛牌后進行單株葉片取樣0.1克，樣品溶液氮處理后保存于-70℃的冰箱內。取樣5天后用斷根法進行接種4*108個/ml青枯病菌液，在30-35℃下進行管理，接菌21天后對三個樣本進行田間調查，在抗性母本中挑選抗性植株10株，確定其編號；在感病性父本中挑選感病植株10株，并確定其編號；在F2樣本各挑選10株高抗和高感的植株，并確定其編號，根據編號要求把已取樣的葉片進行確定，并把10株葉樣混合。
參照Michaels等人的方法，(Michaels SD，John MC，Amasino RM.Removalof polysaccharides from plant DNA by ethanolprecipitation.Biotechniques，1991，17(2)274-276)以抗病親本，感病親本中隨機挑選出的10株高抗株和高感株采用(Michaels SD，John MC，AmasinoRM.Removal of polysaccharides from plant DNA by ethanolprecipitation.Biotechniques，1991，17(2)274-276)中的方法提取DNA，并建立抗病親本池(PR)和感病親本池(PS)，并用BSA(分群分析法)構池法建立F2抗病基因池(BR)和感病基因池(BS)。
參照Vos等人的方法進行AFLP分析(Vos P，Hogers R，Bleeker M，ReijiansM，Vandelee T，Hornes M，Frijters A，Peleman J，Kuiper M，Zabeau M.AFLPanew technique for DNA fingerprinting.Nucleic AcidsResearch，1995，234407-4414)。用EcoR I/Mse I內切酶雙酶切DNA基因組，通過熱變性對內切酶進行處理，在T4連接酶的作用下，對AFLP只含一個選擇性堿基的引物進行結頭連接反應，在25μl反應體系中加入連接稀釋10倍的DNA樣品2.5μl，在1.2Mm的Mg2+濃度下進行PCR預擴增(94℃，30S；53℃，60S；72℃，60S；23個循環)。第二次擴增選用8個EcoR I引物和8和Mse I引物組成64個引物組。引物一般選3個選擇性堿基(參見表1)。將預擴增產物20倍作為DNA模板進行2次PCR選擇性擴增，擴增產物用6％的變性聚丙烯酰胺凝膠，在65W恒功率下電泳3h，固定后銀染顯色。在4200多條可分辨的條帶中含有E-AAG/M-CAT并含有342Pb的條帶的為有抗青枯病基因的品種或親本。
在抗性親本中留下的10株單株，可留種作為有抗性基因的親本。用同樣的方法選擇不同類型的抗青枯病親本，可選育雜交組合，可提供利用分子生物學標記選育番茄抗青枯病新品種的途徑。
表1 AFLP分析所用的接頭和選擇性引物*

*所用的引物接頭由上海生工生物工程服務有限公司合成實施例二將純合的番茄種子播于穴盤，在3-4葉期用斷根法接種濃度為4*108個/ml的青枯病菌液，有10株不接種。接種后7-16天間取番茄鮮葉按照(XUE YinglongOUYANG Guangcha，AO Shaogen.Studies on the plant phenlanine ammonielyase[J].Acta Phytophysioloca Sinica.1983，9(3)301-305)中的方法提取酶液，進行苯丙氨酸解氨酶(PAL)的測定，用(ZHU Guanglian，ZHONGHaiwen，ZHANG Haiqin.A Laboratory Mannal of plantPhysiology[M].BeijingScience Press，199051-54.(in china))中的方法提取超氧化物歧化酶(SOD)并進行測定。隔天測定，一般5-8次，接種番茄和不接種番茄的酶活性進行比較，接種番茄的PAL和SOD的峰值比不接種的峰值超過40％和15％以上可被選為有抗青枯病基因的番茄品種或親本，即抗病株系。接種后PAL值在前一周高于或低于不接種的番茄植株，一般高于的峰值不超過30％，一周后低于不接菌種的植株，而SOD值接菌的植株一直低于不接種的植株的可初選為不抗青枯病的番茄品種或親本。
被選擇初步認定的抗病品種，自交留取種子，挑選飽滿的初選抗病品種或品系播于裝有基質(蛭石∶泥炭∶珍珠巖＝1∶2∶1)的15穴的育苗盤中，每一品種或品系留100-150株群體，至四葉期前每一品種或品系的單株掛牌后進行單株葉片取樣0.1克，樣品溶液氮處理后保存于-70℃的冰箱內。取樣5天后用斷根法進行接種4*108個/ml青枯病菌液，在30-35℃下進行管理，接菌21天后對三個樣本進行田間調查，每個品種或品系中挑選抗性植株10株，確定編號，并把10株葉樣混合，在10株高抗株中以(Michaels SD，JohnMC，Amasino RM.Removal of polysaccharides from plant DNA by ethanolprecipitation.Biotechniques，1991，17(2)274-276)提取DNA，建立每個品種或品系的抗病基因池(PR)。
參照Vos等人的方法進行AFLP分析(Vos P，Hogers R，Bleeker M，ReijiansM，Vandelee T，Hornes M，Frijters A，Peleman J，Kuiper M，Zabeau M.AFLPanew technique for DNA fingerprinting.Nucleic AcidsResearch，1995，234407-4414)。用EcoR I/Mse I內切酶雙酶切DNA基因組，通過熱變性對內切酶進行處理，在T4連接酶的作用下，對AFLP只含一個選擇性堿基的引物進行結頭連接反應，在25μl反應體系中加入連接稀釋10倍的DNA樣品2.5μl，在1.2Mm的Mg2+濃度下進行PCR預擴增(94℃，30S；53℃，60S；72℃，60S；23個循環)。第二次擴增選用8個EcoR I引物和8和Mse I引物組成64個引物組。引物一般選3個選擇性堿基(參見表1)。將預擴增產物20倍作為DNA模板進行2次PCR選擇性擴增，擴增產物用6％的變性聚丙烯酰胺凝膠，在65W恒功率下電泳3h，固定后銀染顯色。在4200多條可分辨的條帶中含有E-AAG/M-CAT并含有342Pb的條帶的為抗青枯病的品種或品系。
選擇出的抗青枯病品種或品系，按常規雜交育種的方法，在品種或品系間進行選配雜交，留下的F1代種子按實施例一所蔬的方法進行AFLP分子標記，在F1代有342Pb條帶可作為抗青枯病的番茄雜種一代品種。
權利要求
1.一種測定選育番茄抗青枯病品種的方法，其特征在于通過以下步驟實現(1)收集番茄常規品種或品系種子播種后，選擇3-4葉番茄苗，用斷根法接種濃度為4*108個/ml青枯病菌液，留10-20株不接青枯病菌的番茄苗作為對照，用葉片測定苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)；(2)在接種后1-21天中應隔天連續測定，在接種后7-16天間，其苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)的峰值比對照高40％和15％可入選為抗青枯病的品種或品系，接種后前一周內苯丙氨酸解氨酶(PAL)值不高于對照苯丙氨酸解氨酶(PAL)值的30％，兩周后比對照低，而超氧化物歧化酶(SOD)值一直比對照值低的為不抗青枯病的番茄品種或品系；(3)獲得預選的親本抗病、不抗病番茄種子和兩親本雜交(正交)后的F2種子，利用兩親本和F2所育的3葉苗建立基因池，酶切后進行擴增酶切DNA片段長度多態性(AFLP)的預擴增；(4)預擴增的產物進行8個引物組合的擴增酶切DNA片段長度多態性(AFLP)選擇性擴增而獲得特異性條帶。
2.根據權利1所述的一種測定選育番茄抗青枯病品種的方法，其特征在于以初選抗病番茄品系為母本，感病的品系為父本種植后進行有性雜交獲F1種子，再獲F1種植后自交的F2種子。
3.根據權利1或2所述的一種測定選育番茄抗青枯病品種的方法，其特征在于將母本、父本、F2種子播種，幼苗3葉期提取葉片DNA，植株編號與DNA編號一一對應，4葉期用斷根法接種青枯病菌，21天后在抗病母本中抽樣10株高抗株，感病父本中選擇10株高感株，F2代中各抽取10株高抗和高感的植株，把已取的相對應的DNA作為測定材料。
4.根據權利1所述的一種測定選育番茄抗青枯病品種的方法，其特征在于步驟(3)中建立抗性親本、感病性親本和F2代中的抗病和感病植株的4個DNA基因池，選用EcoR I和Mse I內切酶，擴增酶切DNA片段長度多態性分子標記預擴增選用E-AAG/M-CAT引物組合。
5.根據權利要求1或4所述的一種測定選育番茄抗青枯病品種的方法，其特征在于建立DNA基因池后，用25μl反應體系加入稀釋10倍后的DNA樣品2.5μl，選用EcoR I/Mse I內切酶，退火Tm值取53℃，引物連接接頭后，預擴增體系選用1.2mMOLMg2+濃度，反應溫度為94℃30S，53℃60S，72℃60S，23個循環。
6.根據權利要求1所述的一種測定選育番茄抗青枯病品種的方法，其特征在于步驟(4)中應用EcoR I/Mse I各8個引物，組成64個引物的組合，擴增后尋找E-AAG/M-CAT的特異條帶。
全文摘要
本發明提供一種測定選育番茄抗青枯病品種的方法，是利用接種青枯病后抗性酶變化的特點和擴僧酶切DNA片段長度多態性基因分子標記相結合，可以選出含有番茄抗青枯病基因的品種或親本。本發明方法節省育種材料，利用分子標記方法選育番茄抗青枯病只需少量種子，可以分析出大量純合的番茄品種或品系的抗性差異，較快地選出抗性育種材料；可縮短育種的世代和時間，可以在同一時間內分析多個品種，在有親本、F
文檔編號A01H3/00GK1736165SQ20051006056
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月30日 優先權日2005年8月30日
發明者壽森炎, 馮壯志, 盧鋼, 楊悅儉, 苗立祥, 王漢榮, 黃錫志 申請人:浙江大學